Vergleichende Analyse der Wirksamkeit der Entwicklung von Phagencocktails gegen mehrere Salmonella-Serovare und ihrer Aktivität zur Biofilmkontrolle

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 13054 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Lebensmittelbedingte Krankheiten stellen eine große Herausforderung in der globalen Lebensmittelindustrie dar, insbesondere solche, die durch multiresistente Bakterien (MDR) verursacht werden. Bakterien, die zusätzlich zu MDR-Stämmen zur Biofilmbildung fähig sind, verringern die Wirksamkeit der Behandlung und stellen eine erhebliche Bedrohung für die Bakterienkontrolle dar. Bakteriophagen, also Viren, die Bakterien infizieren und abtöten, gelten als vielversprechende Alternative zur Bekämpfung von MDR-Bakterien, sowohl in der Humanmedizin als auch in der Tierproduktion. Phagencocktails, die aus mehreren Phagen bestehen, werden häufig eingesetzt, um das Wirtsspektrum zu erweitern und die Entwicklung einer Phagenresistenz zu verhindern oder zu verzögern. Zur Bewertung der lytischen Aktivität von Bakteriophagen stehen zahlreiche Techniken und Protokolle zur Verfügung. Die am häufigsten verwendeten Methoden sind Spot-Test-Assays, EOP-Tests (Efficiency of Plating) und Infektionsassays in Flüssigkultur. Allerdings gibt es derzeit keine Standardisierung dafür, welche Analysen eingesetzt werden sollten und welche möglichen Unterschiede zwischen ihnen bestehen, um das Wirtsspektrum der Phagen und die Zusammensetzung eines Cocktails genau zu bestimmen. Eine vorläufige Auswahl mithilfe des Spot-Test-Assays ergab vier Phagen für die anschließende Bewertung gegen eine Gruppe von 36 Salmonella-Isolaten zahlreicher Serovare. Der Vergleich von EOP- und Infektionstests in Flüssigkulturen ergab, dass EOP die lytische Aktivität von Phagen unterschätzen und so die Entwicklung von Phagencocktails direkt beeinflussen könnte. Darüber hinaus war der Phagencocktail, der die vier ausgewählten Phagen enthielt, laut EOP in der Lage, die von 66 % (23/35) der Isolate gebildeten Biofilme zu kontrollieren oder zu entfernen, einschließlich derjenigen, die eine geringe Anfälligkeit für Phagen aufwiesen. Die Phagen wurden genomisch charakterisiert und zeigten das Fehlen von Genen, die mit Antibiotikaresistenz, Virulenzfaktoren oder Integrasen assoziiert sind. Laut konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie-Analyse wurde festgestellt, dass die Biofilmreifung eines Salmonella-Isolats, das in Flüssigkultur- und 96-Well-Platten-Biofilm-Lebensfähigkeitstests eine hohe Anfälligkeit für Phagen aufwies, jedoch niedrige EOP-Werte aufwies, durch den Phagen gehemmt und kontrolliert wurde Cocktail. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass Phagen trotz ihrer niedrigen EOP-Werte Salmonellen-Biofilme während ihres gesamten Wachstums- und Reifungsprozesses kontrollieren und entfernen können. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung von Infektionstests in Flüssigkulturen eine präzisere Untersuchung der Phageninteraktionen für die Cocktailgestaltung – zeitlos und mühelos. Daher kann die Integration von Strategien und Techniken zur umfassenden Bewertung des Wirtsspektrums und der lytischen Aktivität von Bakteriophagen unter verschiedenen Bedingungen das antibakterielle Potenzial von Phagencocktails genauer demonstrieren.

Salmonellen spp. sind ein häufiger menschlicher Krankheitserreger, der weltweit als eine Bedrohung für die öffentliche Gesundheit gilt1. Unter den durch Lebensmittel übertragenen Krankheitserregern sind Salmonellen die dritthäufigste Todesursache und stellen daher auch eine erhebliche wirtschaftliche Belastung dar. Der jüngste Bericht der Weltgesundheitsorganisation über die weltweite Belastung durch lebensmittelbedingte Krankheiten schätzt, dass von den weltweit 88 Millionen jährlich durch Salmonellen verursachten Fällen 123.000 zum Tod führten und insgesamt 222.000 Lebensjahre mit Behinderungen verbracht wurden1.

Eines der Hauptmerkmale von Salmonella spp. Der Grund für sein Überleben in lebensfeindlichen Umgebungen ist die Bildung oberflächenassoziierter komplexer Gemeinschaften – Biofilme –, die es schwierig machen, seine Ausbreitung zu kontrollieren, insbesondere in Geflügelfarmen, da mehr als 50 % der Salmonellenstämme, die aus in Brasilien geschlachteten Hühnern isoliert wurden, diese Fähigkeit aufweisen zur Bildung von Biofilmen2,3,4,5. Biofilme erhöhen die Toleranz gegenüber Bioziden6,7, da die Zellen innerhalb der Polymermatrix organisiert sind, was das Eindringen des bioziden Wirkstoffs verringert und dazu führt, dass die Bakterien in Umgebungen der Lebensmittelverarbeitung über lange Zeiträume bestehen bleiben5,8.

Daher ist es von großer Bedeutung, Strategien zur Bekämpfung von Salmonellen in der Geflügelproduktion zu entwickeln, mit dem Ziel, den Einsatz von Antibiotika aufgrund des Auftretens multiresistenter Mikroorganismen zu reduzieren9,10. In diesem Szenario gewinnen Bakteriophagen als Mittel zur Hemmung oder Zerstörung von Biofilmen an Interesse11,12,13.

Bakteriophagen (Phagen) wurden ursprünglich von Frederick Twort und Felix D'Herelle entdeckt und sind Viren, die speziell Bakterien infizieren14,15. Da sie am Ende der Vermehrung die Lyse ihrer Wirte auslösen können, werden lytische Phagen seit ihrer Entdeckung in der medizinischen Praxis in Ostländern wie Polen und Georgien eingesetzt und ersetzen herkömmliche Antibiotika oder in Kombination mit diesen11,14. Zahlreiche Studien haben dokumentiert, dass Phagen ein hilfreiches Instrument zur Inaktivierung und Kontrolle von durch Lebensmittel übertragenen Krankheitserregern sind14,16,17,18, was es den phagenbasierten Produkten gegen Salmonella spp. von der US-amerikanischen Food and Drug Administration (FDA) als „Generally Recognized as Safe“ (GRAS) zugelassen werden13,16,19.

Phagen können als biologische Kontrolle entweder als einzelner Phagentyp (Monophage) oder in einem Cocktail bestehend aus mehreren Phagen20,21 eingesetzt werden. Durch die Kombination mehrerer Phagen ist es möglich, das Wirkungsspektrum hinsichtlich der Anzahl der Stämme, die Phagen infizieren können, zu erhöhen und eine bakterielle Resistenz gegen Phagen zu vermeiden, die in Fällen, in denen nur ein Phagen verwendet wird, schnell auftreten kann11,20. Daher ist es notwendig, das Wirtsspektrum und die Virulenz der Phagen, aus denen der Cocktail besteht, zu untersuchen, um seine Wirksamkeit sicherzustellen11,22,23.

Auch wenn es keine definierten Richtlinien zur Standardisierung der Entwicklung eines optimierten Cocktails gibt, wurden einige Techniken und Protokolle wie PhageScore24, Virulence Index11,23 und Breite und Tiefe des Cocktails21 entwickelt, um die Phageneffizienz zu quantifizieren und den besten Ansatz für Cocktails zu bestimmen Design. Daher demonstriert diese Studie die Charakterisierung von vier Phagen und bewertet das Potenzial eines vorgeschlagenen Cocktails für die biologische Bekämpfung von Salmonella spp. Darüber hinaus liefern die vorgeschlagenen Experimente quantitative Daten zur Beurteilung der Virulenz von Phagen, ihrer Fähigkeit, Biofilme zu zerstören, sowie der Sicherheit der Phagen in Bezug auf den Lysezyklus, bakterielle Virulenzgene und Resistenzgene.

Insgesamt 24 Phagen wurden zunächst für 11 von 50 Salmonella-Isolaten (Ergänzungstabelle S1) isoliert, die zur Anreicherung verwendet wurden. Die Phagen wurden auf der Grundlage der Morphologie der Plaques (Plaquegröße und Trübung), die einen Durchmesser von 0,3 bis 1,1 mm hatten, und des für die Isolierung verwendeten Wirts ausgewählt, dh Plaques von unterschiedlichen Wirten wurden als unterschiedliche Phagen betrachtet. Wie jedoch später erläutert wird, könnte derselbe Phage bei verschiedenen Bakterienisolaten unterschiedliche Plaquemorphologien aufweisen.

Vier Phagen der 24 ersten isolierten Phagen wurden zur weiteren Charakterisierung ausgewählt, da sie im Streak Spot Test (SST)-Assay ein breites Wirtsspektrum für 50 Salmonella-Isolate aufwiesen, das 16 verschiedene Serotypen umfasste (ergänzende Abbildung S1). Basierend auf der phylogenetischen Klassifizierung der Phagen wurden sie Tequintavirus phA11, Tequintavirus phC11, Tequintavirus phB7 und Tequintavirus phC17 genannt, und von nun an werden sie nur noch phA11, phC11, phB7 und phC17 genannt. Die Ergebnisse des SST-Assays (ergänzende Abbildung S1) zeigten einen breiten anfänglichen Wirtsbereich für die vier ausgewählten Phagen mit Prozentsätzen der lytischen Aktivität, d. zu phA11, 58 % zu phC11, 66 % zu phB7 und 66 % zu phC17.

Die 36 empfindlichen Isolate im SST-Assay wurden zur Bewertung der Plaquebildung mit der relativen Efficiency of Plating (EOP)-Methode (Abb. 1) und zur Bewertung der Virulenz der Phagen anhand der lokalen Virulenz bei Multiplizität der Infektion (MOI) 1 (v1) verwendet ) Analyse (Abb. 2). EOP bewertet die Fähigkeit eines Phagen, Plaques zu bilden, indem es die Anzahl der Plaques, die ein Phagen in einem bestimmten Bakterienstamm/Isolat bilden kann, mit der höchsten Plaquezahl vergleicht, die für diesen Phagen in der getesteten Bakteriengruppe erhalten wurde. Daher wurde der Bakterienstamm/das Bakterienisolat mit der höchsten für einen bestimmten Phagen gebildeten Plaquezahl als Referenz für diesen Phagen verwendet und hatte folglich einen EOP-Wert von 1,0. Jeder Phage bildete die höchste Plaque-Anzahl in verschiedenen Bakterienisolaten: Bei phA11 war es das Isolat 1075786; für phC11 war es das Isolat 1079411; für phB7 war es das Isolat SSP13; und für phC17 war es das Isolat SA17. Darüber hinaus bildeten alle vier Phagen die höchste Plaquezahl in Bakterienisolaten, die sich von denen unterschieden, aus denen sie isoliert wurden. In Bezug auf v1 kann es als die Fähigkeit eines Phagen definiert werden, das Wachstum eines Bakteriums in einer Flüssigkultur bei MOI 1 zu hemmen. Bei jeder Methode gab es einen Unterschied im Wirtsbereich und in der Klassifizierung der Virulenz der Phagen und des Cocktails. Tabelle 1 beschreibt die Klassifizierung der Phagen in jeder Methode, wobei der Schwerpunkt auf phB7 liegt, das laut v1 eine hohe lytische Aktivität gegenüber 36,1 % der Isolate aufwies, während bei EOP 19,4 % der Isolate eine hohe Plaqueproduktion aufwiesen. Bei phC11 wurde das gleiche Merkmal beobachtet, wo es in v1 eine hohe lytische Aktivität gegenüber 39,9 % der Isolate aufwies, während bei EOP nur 13,9 % der Isolate eine hohe Plaqueproduktion aufwiesen. Der Phagen phC11 hat einen durchschnittlichen v1- und EOP-Wert von 0,428 bzw. 0,135, während der durchschnittliche v1- und EOP-Wert des Phagen phB7 0,423 bzw. 0,319 beträgt. Die Unterschiede zwischen v1- und EOP-Werten für phC11 und phC17 verstärkten sich in der Klassifizierung „Ineffizient“, mit v1-Prozentsätzen von 19,4 % bzw. 38,9 % und EOP-Prozentsätzen von 55,6 % bzw. 75,0 %. Dennoch wies der Cocktail unter Berücksichtigung von v1 und hoher lytischer Aktivität gegenüber 50 % aller getesteten Isolate keine Stämme in der Klassifizierung „Ineffizient“ auf. Für einige Bakterien zeigte der Cocktail positive Wechselwirkungen. Der mit den Phagen phA11, phC11, phB7 und phC17 behandelte Stamm 14344 zeigte v1-Werte von 0,483, 0,456, 0,397 bzw. 0,435 (Abb. 2). Umgekehrt stieg der v1-Score des Cocktails auf 0,999 (Abb. 2). Analoge Muster wurden für die Isolate SSF19 und SSP09 beobachtet (Abb. 2).

Heatmap der relativen Effizienz der Beschichtung für die Phagen phA11, phC11, phB7 und phC17 für 36 Salmonella-Isolate. Die Werte stellen den Durchschnitt von drei Wiederholungen dar. Der EOP-Wert für die Phagen-Bakterien-Kombination wurde als „Hoch“ für Verhältnisse ≥ 0,5, „Mittel“ für Verhältnisse ≥ 0,1 und < 0,5, „Niedrig“ für Werte > 0,001 und < 0,1 und „Ineffizient“ für Verhältnisse ≤ 0,001 klassifiziert .

Heatmap der lokalen Virulenz von MOI 1 (v1) für die Phagen phA11, phC11, phB7, phC17 und Phagencocktail für 36 Salmonella-Isolate. Die Werte stellen den Durchschnitt von drei Wiederholungen dar. Wachstumskurven sind in der ergänzenden Abbildung S2 dargestellt. Der lokale Virulenz-Score wurde als „Hoch“ für v1 > 0,5, „Mittel“ für 0,2 ≤ v1 ≤ 0,5, „Niedrig“ für 0,001 ≤ v1 < 0,2 und „Ineffizient“ für v1 < 0,001 klassifiziert.

Dieser Unterschied zwischen den Ergebnissen der beiden Tests ist in Abb. 3 besser zu erkennen, in der die Ergebnisse zum gegenseitigen Vergleich in einer Dotplot-Abbildung aufgetragen wurden. Die Farbskala repräsentiert die EOP-Werte und die Punktgröße repräsentiert die v1-Werte für jede Phagen-Bakterien-Kombination. Die Daten sind nach dem höchsten Mittelwert v1 der vier Phagen zu den niedrigsten Werten von oben nach oben geordnet. Die Phagen phA11, phC11 und phC17 zeigen ein ähnliches Punktmuster, obwohl phC11 das Wachstum einiger Isolate kontrollieren konnte, was phA11 und phC17 nicht gelang. Von 36 Salmonella-Isolaten zeigen nur 5 (14 %) eine direkte Korrelation der Phagenanfälligkeit zwischen EOP und v1 für die Phagen phA11 und phC11. Für den Phagen phC17 ist dieser Unterschied sogar noch größer, und nur 1 (3 %) Isolat zeigt die Korrelation zwischen Phagen-Empfindlichkeitstests. Andererseits weist phB7 eine gute Fähigkeit zur Bildung von Plaques auf, was als allgemeine Korrelation der Anfälligkeit zwischen EOP und v1 angesehen werden kann, sobald die Farbskala und die Punktgröße homogener verteilt sind. Große Punkte (hohe v1-Werte) mit violetter Farbe (niedrige EOP-Werte) sind bei allen Phagen außer phB7 zu sehen, was die Unterschiede in der Bewertung der lytischen Phagenaktivität je nach analysiertem Phagen verdeutlicht.

Punktdiagramm zum Vergleich der lokalen Virulenz und der relativen Effizienz der Beschichtungswerte für die Phagen phA11, phC11, phB7 und phC17. Die Größe des Punkts am Schnittpunkt von Bakteriophagen/Bakterien ist proportional zum mittleren lokalen Virulenzwert. Die Skalenfarbe ist proportional zu den mittleren EOP-Werten.

Bakteriophagen zeichneten sich durch maximale Produktion und Widerstandsfähigkeit gegenüber verschiedenen physikalisch-chemischen Bedingungen aus.

Die vier ausgewählten Bakteriophagen produzierten die höchsten Nachkommen mit unterschiedlichen Infektionsmultiplizitäten (MOI) (ergänzende Abbildung S3), die dann in den nachfolgenden Experimenten für eine maximale Phagenproduktion verwendet wurden. Aufgrund der Verwendung von 108 KBE/ml (> 107 KBE/ml) des Wirtsstamms gehen wir davon aus, dass bald nach der Phagenzugabe eine 100 %ige Phagenadsorption stattgefunden hat25.

Die Stabilität von Bakteriophagen wurde bei acht verschiedenen Temperaturen (–20 °C, 4 °C, 25 °C, 30 °C, 37 °C, 50 °C, 70 °C und 90 °C) und drei verschiedenen Zeiten untersucht Inkubation (1 h, 24 h und 7 Tage – außer 50 °C, 70 °C und 90 °C) (Ergänzende Abbildung S4). Die Lagerung bei 4 °C wurde als Kontrolle für die Stabilität angesehen, da es sich um die Temperatur handelt, die für die Lagerung des Bakteriophagenbestands verwendet wird. Unsere Ergebnisse zeigen, dass alle Phagen bei den getesteten Temperaturen eine gute Stabilität aufweisen, mit Ausnahme von 70 °C und 90 °C. Der Phagen phC17 war bei 30 °C und 37 °C in 24 Stunden und 7 Tagen weniger stabil und nahm im Vergleich zu 1 Stunde um etwa 0,8 log ab. Obwohl die Phagen innerhalb von 7 Inkubationstagen einen Titerabfall aufwiesen, zeigten sie im Allgemeinen eine gute Stabilität. Bei einstündiger Einwirkung einer Temperatur von 50 °C zeigten alle vier Phagen eine beträchtliche Stabilität, ohne dass eine Verringerung der Phagenmengen beobachtet wurde. Bei einer Verlängerung der Inkubationszeit auf 24 Stunden zeigte sich jedoch eine Verringerung der Phagenkonzentrationen. Anschließend wurde die Resistenz der Phagen bei einer höheren Temperatur von 90 °C sowohl für 1 Stunde als auch für 24 Stunden getestet. Alle vier Phagen zeigten eine bemerkenswerte Anfälligkeit gegenüber dieser erhöhten Temperatur, da ihre Konzentrationen unter die Nachweisgrenze fielen und sie nach Einwirkung von 90 °C nicht mehr lebensfähig waren. Bei einer Zwischentemperatur von 70 °C variierte die Reaktion der vier Phagen. Insbesondere der Phagen phB7 zeigte einen bemerkenswerten Mangel an Resistenz und zeigte einen Konzentrationsabfall nach einstündiger Exposition sowie ein völliges Fehlen von Plaques nach 24-stündiger Inkubation. Im Gegensatz dazu zeigten die anderen drei Phagen unterschiedliche Resistenzgrade gegenüber 70 °C, was durch logarithmische Verringerungen der Phagenkonzentration nach 1 Stunde belegt wurde. Anschließend, nach der 24-stündigen Inkubationszeit, waren für diese drei Phagen keine Plaques mehr nachweisbar, was darauf hindeutet, dass ihre Lebensfähigkeit bei dieser Temperatur beeinträchtigt war.

Zusätzlich wurde die Stabilität von Phagen in einem pH-Bereich von 2,5 bis 12,5 zum gleichen Zeitpunkt der Inkubation des Temperaturstabilitätsexperiments bewertet (ergänzende Abbildung S5). Alle Phagen waren zu jedem Zeitpunkt bei pH 2,5 inaktiviert und die Konzentration lag unter der Nachweisgrenze. Bei pH 3,5 blieben alle Phagen nach einer Stunde Inkubation aktiv, wobei der Titer leicht abnahm. Allerdings blieb nach 24-stündiger Inkubation nur phA11 aktiv, was im Vergleich zu 1-stündiger Inkubation etwa 1 Log an lebensfähigen Phagen verringerte. Keiner der Phagen blieb innerhalb von 7 Tagen nach der Inkubation bei pH 3,5 aktiv. Alle Phagen waren zu allen Zeitpunkten für die verbleibenden pH-Punkte nachweisbar, mit Ausnahme der Phagen phC11 und phB7 bei pH 12,5.

Zur Bewertung der Anti-Biofilm-Aktivität des Phagencocktails wurden 35 Salmonella-Isolate aus 14 verschiedenen Serovaren verwendet. Ein Phagencocktail aus vier Phagen mit einer Endkonzentration von 5 × 107 PFU/ml jedes Phagen wurde verwendet, um die Biofilme 24 Stunden lang zu behandeln. Die Ergebnisse zeigten eine gute Fähigkeit zur Biofilmkontrolle oder -entfernung (Abb. 4). Der Cocktail war in der Lage, das Biofilmwachstum von starken (Abb. 4a) und mäßigen/schwachen (Abb. 4b) Biofilmproduzenten zu kontrollieren und den Biofilm von 23 (66 %) der 35 getesteten Isolate zu kontrollieren oder zu entfernen (p < 0,05, zwei). -Wege-ANOVA und Post-hoc-Tukey-Mehrfachvergleichstest). Für die Isolate 14339, SK21 und SA17 wurden nach der Phagenbehandlung keine sessilen Zellen nachgewiesen, was auf die vollständige Entfernung des Biofilms hinweist. Für die Isolate SG, SPJF, 654, 926, SSF16 und SSP13 kann eine signifikante Verringerung der OD-Werte der behandelten Phagen im Vergleich zur 24-Stunden-Biofilm-Kontrollbedingung (p < 0,05, Zwei-Wege-ANOVA und Post-hoc-Tukey-Mehrfachvergleichstest) beobachtet werden , was darauf hindeutet, dass, obwohl Bakterienzellen nicht ausgerottet wurden, der Phagencocktail den Biofilm innerhalb von 24 Stunden Behandlung reduzieren konnte. Bei 14 Isolaten war der Phagencocktail in der Lage, das Biofilmwachstum zu kontrollieren, indem er den Biofilm 24 Stunden lang auf dem gleichen Niveau wie bei der Anwendung des Cocktails hielt oder das Biofilmwachstum verlangsamte, was durch signifikante Unterschiede beobachtet wurde (p < 0,05, 2). -Wege-ANOVA und Post-Hoc-Mehrfachvergleichstest nach Tukey) des mit Phagen behandelten Zustands im Vergleich zur 48-Stunden-Biofilmkontrolle, aber kein Unterschied oder leichte Erhöhung (p < 0,05, Zweiweg-ANOVA und Post-Hoc-Mehrfachvergleichstest nach Tukey) im Vergleich zum 24-Stunden-Biofilm Kontrolle. Bei behandelten Phagen wurde im Vergleich zur 48-Stunden-Biofilmkontrolle kein signifikanter Biofilmanstieg (p > 0,05, Zwei-Wege-ANOVA und Post-hoc-Tukey-Mehrfachvergleichstest) beobachtet, was darauf hinweist, dass die Phagen im Cocktail das Biofilmwachstum bei keinem der getesteten Isolate steigerten .

MTT-Biofilm-Assay-Daten für Phagencocktail. (a), Salmonella-Isolate, die als starke Biofilmproduzenten eingestuft sind und 24 Stunden lang mit Phagencocktail behandelt wurden. (b), Salmonella-Isolate, die als mäßige oder schwache Biofilmproduzenten eingestuft sind und 24 Stunden lang mit Phagencocktail behandelt wurden. Alle Daten werden als mittlere OD (570 nm) dargestellt, normalisiert auf den Cutoff der optischen Dichte (ODc) von drei Replikaten mit Standardabweichungsbalken für alle Bakterienisolate. Einzelne Datenpunkte werden durch Punkte gekennzeichnet. ***zeigen einen statistisch signifikanten Unterschied an (p < 0,001, Zwei-Wege-ANOVA und Post-hoc-Tukey-Mehrfachvergleichstest). Zur Verbesserung der Grafikästhetik wurden einige Identifizierungen von Bakterienproben auf die letzten drei Zahlen reduziert. Daher ist dort, wo 786 steht, 1075786 zu lesen; 654, lesen Sie 1084654; 926, lesen Sie 1076926; 484, gelesen 1081484; 617, gelesen 1088617; 411, lesen Sie 1079411; 225, lesen Sie 1080225.

Basierend auf diesen Ergebnissen wurde Salmonella SG für die weitere Analyse der Phageninteraktionen mit Biofilm ausgewählt, da es erhebliche Unterschiede zwischen den drei getesteten Bedingungen aufwies. Eine vergleichende Analyse von Kontrollen und mit Phagen behandelten Biofilmen wurde mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) durchgeführt, um die Auswirkungen der Phagen auf die Biofilmstruktur besser zu verstehen. Es wurden sechs Bilder aufgenommen und eines wurde ausgewählt, um jeden Zustand darzustellen. Nach 24-stündiger Inkubation wies die Biofilmkontrolle eine Dicke von etwa 20 µm auf (Abb. 5a und b). Die 48-Stunden-Biofilmkontrolle zeigte einen gut strukturierten Biofilm und eine Dicke von etwa 20 µm, jedoch mit höherer Zelldichte (Abb. 5c und d) im Vergleich zur 24-Stunden-Kontrolle. Die Biofilmdicke (4 µm) und die Zelldichte waren nach 24-stündiger Phagencocktail-Behandlung (Abb. 5e und f) verringert. Zur quantitativen Analyse und zum Vergleich der Bilder wurde die Fluoreszenzintensität von DAPI (einem fluoreszierenden DNA-Marker) quantifiziert (Abb. 6) und zeigte ähnliche Muster wie im MTT-Biofilm-Assay, was die Aktivität des Phagencocktails zur Kontrolle des Biofilmwachstums gegen dieses Bakterium verstärkt isolieren. Der mit Phagen behandelte Zustand zeigte im Durchschnitt eine signifikante Reduktion (p < 0,0001, einfaktorielle ANOVA und Post-hoc-Tukey-Mehrfachvergleichstest) um etwa das Siebenfache der Fluoreszenzintensität im Vergleich zur 48-Stunden-Biofilmkontrolle. Es wurden keine signifikanten Unterschiede (p = 0,0565, einfaktorielle ANOVA und Post-hoc-Tukey-Mehrfachvergleichstest) in der Fluoreszenzintensität zum Vergleich zwischen mit Phagen behandelter und 24-Stunden-Biofilmkontrolle beobachtet, obwohl bei der Quantifizierung eine Tendenz zur Verringerung der Zelldichte beobachtet wurde Panel (Abb. 6) und in den repräsentativen Bildern (Abb. 5).

Repräsentative CLSM-Bilder von DAPI-gefärbten Salmonella enterica Serovar Gallinarum SG 24-Stunden- und 48-Stunden-Biofilmen unter verschiedenen Bedingungen. SG-Zellen wurden 24 Stunden (a und b) und 48 Stunden (c und d) bei 37 °C ohne Zugabe von Phagencocktails für das Biofilmwachstum gezüchtet. Ein Phagencocktail (2 × 108 PFU/ml aller Phagen) wurde zu 24 Stunden alten Biofilmen gegeben und 24 Stunden lang inkubiert (e und f). Maßstabsbalken repräsentieren 10 µm.

DAPI-Fluoreszenzintensität von CLSM-Bildern von Salmonella enterica Serovar Gallinarum SG-Biofilmen. Die Daten werden als Mittelwert von sechs Bildern verschiedener Felder mit Standardabweichungsbalken dargestellt. Einzelne Datenpunkte werden durch Punkte oder Dreiecke gekennzeichnet. ****zeigen einen statistisch signifikanten Unterschied (p < 0,0001, einfaktorielle ANOVA und Post-hoc-Tukey-Mehrfachvergleichstest) zwischen den Gruppen an.

Die Sequenzierung wurde mit Illumina MiSeq durchgeführt und Paarendsequenzen (2 × 250 Basen) wurden mit CLC Genomics Workbench (Qiagen) zusammengestellt. Mithilfe von Trimmomatic26 wurden die ursprünglichen Lesevorgänge gefiltert, um Regionen mit geringer Qualität zu entfernen. Seqtk (https://github.com/lh3/seqtk) hat eine Teilstichprobe der gesamten Lesevorgänge mit 50.000 Lesevorgängen erstellt (eine Hälfte für R1 und eine andere Hälfte für R2). Diese Teilmenge der Lesevorgänge wurde für die Assemblierung mit SPAdes27 verwendet, wodurch ein einzelner Contig erzeugt wurde, der das gesamte Phagengenom enthielt. Der Contig wurde für die nachgelagerte Analyse ausgewählt.

Die Analyse mithilfe von ABRicate mit der Resfinder-Datenbank (https://github.com/tseemann/abricate)28 zeigte das Fehlen von Resistenzgenen in den vier Genomen. Annotationsdaten von RAST29 und PHASTER30 deuteten darauf hin, dass in allen vier Genomen keine Integrase-Gene gefunden wurden, und BLASTN-Suchen mit Integrase-Genen aus nahegelegenen Phagengenomen als Abfragen bestätigten ebenfalls das Fehlen dieser Gene.

Der zirkuläre Vergleich von Phagengenomen mit BRIG31 und intergenomische Vergleiche mit VIRIDIC32 zeigen Ähnlichkeit zwischen den vier analysierten Phagen. Die Genomausrichtung von phC11 mit phA11 zeigt, dass der größte genomische Unterschied zwischen den Phagen zwischen 70 und 60 kbp mit kleinen nicht homologen Regionen im Genom von phC11 auftritt (Abb. 7a). Die Phagen phA11 und phC11 weisen eine hohe Ähnlichkeit auf und werden derselben Spezies mit 96,4 % intergenomischer Ähnlichkeit zugeordnet33 gemäß dem Standard-Speziesschwellenwert von 95 % von VIRIDIC (Abb. 7b). Der zirkuläre Vergleich der phB7- und phC17-Genome mit dem phA11-Genom zeigt eine geringere Ähnlichkeit als phC11, mit mehreren nicht homologen Regionen in ihren Genomen, wenn sie an phA11 ausgerichtet sind (Abb. 7a). Die Phagen phB7 und phC17 weisen eine intergenomische Ähnlichkeit von 76,8 % bzw. 86,2 % mit phA11 auf (Abb. 7b), wie von VIRIDIC nachgewiesen. Dies zeigt, dass sie, obwohl sie derselben Gattung zugeordnet sind (> 70 %), aus verschiedenen Arten stammen (< 95 %). Die intergenomische Ähnlichkeit zwischen phB7 und phC17 beträgt 86,5 %, was sie auch als verschiedene Arten derselben Gattung klassifiziert (Abb. 7b). Dies wird durch die Phylogenieanalyse von VICTOR34 bestätigt, bei der die vier Phagen innerhalb derselben Familie und Gattung gruppiert wurden. Die VICTOR-Ergebnisse differenzierten jedoch alle Phagen in verschiedenen Spezies, einschließlich phA11 und phC11, obwohl ihr phylogenetischer Abstand gering ist (Abb. 7c). Dieser Unterschied zwischen den VIRIDIC- und VICTOR-Ergebnissen hinsichtlich der Artenebene lässt sich durch die unterschiedlichen Berechnungen und Artenschwellenwerte erklären, die jeweils verwendet werden. Alle vier Phagen wurden in die Klasse Caudoviricetes, Familie Demerecviridae, Unterfamilie Markadamsvirinae und Gattung Tequintavirus eingeteilt.

Genomanalyse der Phagen phA11, phC11, phB7 und phC17. (a), Mehrfache Genomausrichtung der vier Phagen, aus denen der Cocktail besteht. Das Genom von phA11 wird als Referenz verwendet und das Alignment ist ein paarweises BLASTn, das mit BRIG durchgeführt wird. Die einzelnen Phagenanmerkungen und -beschreibungen sind in den ergänzenden Abbildungen S6, S7, S8 und S9 dargestellt. (b), Heatmap intergenomischer Ähnlichkeiten und Ausrichtungsindikatoren für die vier Phagen des Cocktails. In der rechten Hälfte basiert die Farbintensität auf der intergenomischen Ähnlichkeit der Phagengenome, und die Zahlen stellen die Ähnlichkeitswerte für jedes Paar dar. In der linken Hälfte werden für jedes Genompaar drei Indikatorwerte in der Reihenfolge von oben nach unten dargestellt: Ausrichtungsfraktion Genom 1 (für das in der Zeile gefundene Genom), Genomlängenverhältnis (für das Genompaar) und Ausrichtungsfraktion Genom 2 (für das in der Spalte gefundene Genom)32. (C), Phylogenomischer Genome-BLAST-Distanz-Phylogenie-(GBDP)-Methodenbaum, abgeleitet unter Verwendung der Formel D0. Die Astlängen der resultierenden VICTOR-Bäume werden anhand der jeweils verwendeten Distanzformel skaliert. Die OPTSIL-Clusterbildung ergab 29 Artencluster, einen Gattungscluster und einen Familiencluster34. Die Formen und Farben verdeutlichen die Unterschiede und Gemeinsamkeiten in der phylogenetischen Einteilung der Phagen und im G + C-Gehalt. Alle Phagen gehören zur gleichen Familie und Gattung, da alle in der Familien- und Gattungsspalte die gleiche Form und Farbe (grünes Quadrat) haben. Hinsichtlich der Arten gibt es eine größere Diversität zwischen den Phagen, wobei jeder Phagen als eine andere Art angegeben wird.

Holin- und Endolysin-Gene wurden in allen vier Genomen nebeneinander gefunden (Ergänzende Abbildungen S6, S7, S8 und S9). Die Endolysin- und Holin-Gene der Phagen phA11 und phC11 sind identisch. Die genaue Ähnlichkeit kann für die Phagen phC17 und phB7 beobachtet werden, was zeigt, dass es auch bei identischen Holin- und Endolysin-Genen Unterschiede im Wirtsbereich der Phagen gibt. Holin-Gene der Phagen phA11/phC11 und phC17/phB7 zeigten eine Ähnlichkeit von 95,74 %, obwohl Endolysin-Gene eine Ähnlichkeit von 72,22 % zeigten, was mehr konservierte Regionen von Holin-Genen als Endolysin-Gene für die vier Phagen zeigt. BLASTn der Phagen phA11/phC11-Endolysin-Gene zeigten eine hohe Ähnlichkeit (> 90 %) mit nur fünf verschiedenen Phagen, die Salmonella enterica, Shigella sp. und Escherichia coli infizierten. Für die Endolysin-Gene der Phagen phC17/phB7 zeigte BLASTn eine hohe Ähnlichkeit (> 90 %) mit 75 verschiedenen Phagen, die Salmonella enterica, Escherichia coli und Klebsiella pneumoniae infizierten.

Die Ergebnisse der Analyse der vorhergesagten Schwanzfaser-Gene zeigten, dass mit jedem Phagen eine unterschiedliche Anzahl von Genen verbunden war. phA11 hatte elf Gene, die als „Phagenschwanzfaser“ vorhergesagt wurden, während phC11 zwölf Gene hatte. Für die Phagen phC17 und phB7 betrug die Anzahl der vorhergesagten Gene zehn bzw. acht. Die Ausrichtung aller dieser Gene mithilfe der Geneious-Version 2023.1 (Biommaters, Inc., Neuseeland) zeigte, dass die vorhergesagten Phagenschwanzfasern der Phagen phA11 und phC11 98,38 % der Identität aufweisen und damit die identischsten unter den vier Phagen sind. Da Phagenschwanzfasern in engem Zusammenhang mit der Phageninfektion und damit dem Wirtsspektrum stehen, könnte diese hohe Identität mit den Wirtsbereichen phA11 und phC11 zusammenhängen, die ähnlich sind (Abb. 1 und 2), insbesondere unter Berücksichtigung von EOP. phB7 wies unter den vier Phagen die geringste Identität auf, wenn man die vorhergesagten Phagenschwanzfasern berücksichtigte, mit 78,08 %, 80,80 % bzw. 81,07 % für die Phagen phA11, phC11 und phC17. Darüber hinaus weist es die geringste Anzahl vorhergesagter Phagenschwanzfaser-Gene, aber das breiteste Wirtsspektrum sowohl bei EOP als auch bei v1 auf. Diese Unterschiede könnten eine wichtige Rolle im Wirtsbereich von phB7 spielen, der eher als generalistischer als als spezialisierter Bakteriophage betrachtet werden könnte, insbesondere in der EOP-Analyse. Daher sollten detailliertere Studien zum Wirtsbereich sowie zur Anzahl und Identität der Phagenschwanzfasern durchgeführt werden, um deren Einfluss gründlich zu charakterisieren.

Die Phagentherapie gilt als vielversprechende Alternative zu Antibiotika im Kampf gegen pathogene Bakterien, sowohl in der Humanmedizin als auch in der Tierproduktion. Bakteriophagen sind äußerst spezifisch für bestimmte Bakterien; Daher erhöht ihre Verwendung in einem Cocktail mit verschiedenen Phagen das Wirtsspektrum und verringert die Wahrscheinlichkeit einer Resistenz. Es gibt zahlreiche Techniken und Protokolle zur Bewertung der lytischen Aktivität von Bakteriophagen. Die am häufigsten verwendeten sind Spot-Test-Assays und EOP11,22. Für Screening-Zwecke ist der Spot-Test eine übliche Technik, obwohl er die lytische Aktivität der Phagen aufgrund des Phänomens der „Lyse von außen“11,35 überschätzt, das in unserer Studie beim Vergleich von SST mit EOP und v1 festgestellt wurde. Andererseits weist EOP auf eine produktive Infektion hin, die wir als die Fähigkeit zur Bildung von Plaques bezeichnen. Es ist bekannt, dass derselbe Phagen auf verschiedenen Bakterienstämmen unterschiedliche Plaques (Morphologie, Größe und Trübung) bilden kann und dass spezifische Phagenabwehrsysteme dies direkt beeinflussen. Mehrere kürzlich entdeckte Phagenabwehrsysteme wie PD-λ-5, PD-λ-2, PD-T7-2, PD-T7-4, Retron-Eco8, Viperine und viele andere reduzieren die Größe der Plaques der Phagen T7 , T5, T3 und λvir36,37,38. Darüber hinaus kommt es je nach dem in den Bakterien vorhandenen Phagenabwehrsystem zu einer Reduzierung der Plaquezahl um das Zehnfache bis hin zu keiner sichtbaren Plaque, was sich direkt auf den beschriebenen EOP-Wert auswirkt36,39.

Bei Infektionstests in Flüssigkulturen wie v1 verzögert oder verhindert das Vorhandensein von Phagenabwehrsystemen wie Viperinen den Zusammenbruch der Kultur38 und wirkt sich auf den v1-Wert aus. Abortive Infektionssysteme wie PD-T4-636 und Toxin-Antitoxin-Abwehrsysteme wie die kürzlich beschriebene toxSAS-CapRel-Unterfamilie40 wirken sich direkt auf das Verhalten der Wachstumskurve von mit Phagen infizierten Bakterienflüssigkulturen aus, insbesondere bei niedrigen MOIs. Andererseits unterscheiden sich direkte Immunsysteme im Wachstumskurvenverhalten phageninfizierter Flüssigkulturen nicht von der nicht infizierten Kontrolle bei niedrigen und hohen MOIs, sobald direkte Immunsysteme die Vermehrung von Phagen ohne altruistisches Selbstmordverhalten verhindern, das bei abortiven Infektionssystemen gezeigt wird36. Daher wirken sich Phagenabwehrsysteme auf Unterschiede in der Anfälligkeit von Bakterien gegenüber demselben Phagen aus, wenn sie mit unterschiedlichen Techniken analysiert werden. Die Phagen phA11, phC11 und phC17 weisen in Abb. 3 ähnliche Datenverteilungsmuster auf, wobei die meisten Isolate eine große Punktgröße (hohes v1), aber eine violette Farbe (niedriger EOP) aufweisen, was zeigt, dass sie zwar eine gute lytische Aktivität gegenüber einigen Isolaten besitzen Sie sind keine geeigneten „Plaquebildner“. Bei phB7 ist ein anderes Muster zu beobachten, das in zahlreichen Isolaten eine hohe Fähigkeit zur Bildung von Plaques zeigt, was durch eine homogenere Verteilung der Punktgröße und -farbe belegt wird. Diese Beweise zeigen, dass die verwendeten Methoden zu unterschiedlichen Klassifizierungen der Phagenaktivität führen können, was sich direkt auf die Auswahl der Phagen auswirkt, aus denen ein Cocktail zusammengestellt wird. Bemerkenswert ist der Unterschied zwischen den Phagen phC11 und phB7 hinsichtlich der Punktmuster in Abb. 3, obwohl sie einen ähnlichen v1-Durchschnitt aufweisen. Daher könnte die alleinige Verwendung von EOP-Scores zur Klassifizierung von Phagen zu einer Unterschätzung der lytischen Aktivität führen, und außerdem kann EOP keine Interaktionen von Phagen in Cocktails erkennen. Dieser Unterschied wurde jedoch für den Phagen phB7 nicht beobachtet, was zeigt, dass es je nach analysiertem Phagen Unterschiede in den Ergebnissen geben kann oder nicht und dass bei der Wahl der Methoden andere Aspekte berücksichtigt werden müssen. Eine weitere Möglichkeit, Infektionstests in Flüssigkulturen einzusetzen, besteht darin, synergistische/antagonistische Effekte von Phagenkombinationen11 oder Phagen-Antibiotikum-Kombinationen zu beobachten, ein wichtiger Faktor bei der Entwicklung von Phagencocktails.

Es ist wichtig hervorzuheben, dass mehrere Faktoren die Plaquebildung beeinflussen. Abhängig vom Geliermittel und seiner Konzentration, dem Vorhandensein zweiwertiger Kationen, dem verwendeten Wachstumsmedium und der Wachstumsphase des Wirts können Anzahl und Größe der gebildeten Plaques unterschiedlich sein41. Darüber hinaus ist, wie Abedon und Yin41 feststellten, „das Scheitern der Plaquebildung nicht notwendigerweise gleichbedeutend mit der Unlebensfähigkeit von Virionen“. Daher wird empfohlen, strengere Kriterien als das Fehlen einer Plaquebildung anzuwenden, bevor festgestellt wird, dass ein Phagen nicht in der Lage ist, ein bestimmtes Bakterienisolat zu infizieren . Betrachtet man die EOP-Werte von Phagen für Salmonella SG, hatte nur phB7 eine hohe Fähigkeit zur Plaquebildung. Allerdings könnten alle vier Phagen das Wachstum dieses Isolats in Flüssigkultur verzögern oder kontrollieren oder sogar den Biofilm während seiner Bildung entfernen, wenn sie kombiniert werden, wie durch MTT-Assay und CLSM-Bilder gezeigt.

Bakterien mit der Fähigkeit, Biofilme zu bilden, verringern die Wirksamkeit von Antibiotikabehandlungen und stellen eine ernsthafte Bedrohung für die Bakterienkontrolle dar. Daher ist die Suche nach Alternativen zu antimikrobiellen Mitteln, die die Bildung von Biofilmen reduzieren können, von entscheidender Bedeutung. Die Hemmung des Salmonellen-Biofilms durch Bakteriophagen wurde bereits beschrieben13,42,43. Diese Studien zeigten eine bemerkenswerte Fähigkeit, die Anzahl von Salmonella Typhimurium und S. Enteritidis aus Biofilmstrukturen in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen unter Verwendung von Phagencocktails mit 107 und 108 PFU/ml zu verringern. Unsere Ergebnisse zeigten, dass der in dieser Studie verwendete Phagencocktail eine hohe Fähigkeit besitzt, den Biofilm des Serovars zu kontrollieren oder zu reduzieren. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass Bakteriophagen auf sich bildende Biofilme angewendet wurden, was zeigt, dass ihr prophylaktischer Einsatz wirksam gegen die Bildung von Biofilmen in der Lebensmittelverarbeitungskette sein könnte44. Darüber hinaus steigerten die Phagen im Cocktail das Wachstum des Biofilms bei keinem der getesteten Isolate in der Analyse signifikant (p > 0,05, Zwei-Wege-ANOVA und Post-hoc-Tukey-Mehrfachvergleichstest), was die hohe lytische Aktivität der Phagen verstärkte ausgewählte Phagen. Dies ist von besonderem Interesse, da bestimmte Phagen mehrere Eigenschaften ihres Wirts modulieren, einschließlich der Möglichkeit, die Biofilmproduktion zu steigern45. Eine detailliertere Analyse der Interaktion der Phagen mit dem Salmonellen-Biofilm ist in den CLSM-Bildern zu sehen. Nach 24-stündiger Inkubation war der Biofilm noch nicht ausgereift, es können jedoch erste Zellcluster mit hoher Dicke beobachtet werden. Ein in diesem Stadium angewendeter Phagencocktail könnte die Reifung des Biofilms stoppen, indem er die Zelldichte reduziert und die Zellverklumpung nach weiteren 24 Stunden Inkubation verhindert, da die Bakterienzellen nicht ausgerottet, sondern verteilt werden, was auf ein bestimmtes Maß an Konzentration schließen lässt phagenresistente mutierte Zellen. Die Eliminierung von Bakterien aus der Biofilmstruktur durch Phagen zeigt Unterschiede in den Auswirkungen hinsichtlich der Anzahl der Phagen (einzelner Phagen oder Phagencocktail)46,47,48, der Salmonella-Serovare, dem Stadium der Biofilmreifung und der Zusammensetzung des Biofilms (gemischt oder einzeln). Art)49. Die Kombination einer Phagentherapie mit alternativen Behandlungen oder Antibiotika kann eine hervorragende Strategie zur Eliminierung resistenter mutierter Zellen und zur Beseitigung von Biofilmen sein. Eine aktuelle Studie von Duarte et al.50 beschrieb die synergistische Aktivität eines einzelnen Phagen und eines von Phagen abgeleiteten lytischen Proteins gegen Staphylokokken-Biofilme und zeigte, dass die Kombination von Phagen mit lytischen Proteinen dazu beitragen könnte, die Entwicklung einer Phagenresistenz einzudämmen. Die Kombination von Phagen mit Antibiotika war auch gegen Biofilme wirksam, wie Dickey und Perrot51 zeigten, was die Verhinderung antibakteriell resistenter Bakterien bewies, vor allem, wenn zuerst Phagen und dann Antibiotika eingesetzt wurden. Allerdings muss die Kombination aus Antibiotika und Phagen sorgfältig untersucht werden, wenn sie die Verteilung von Antibiotikaresistenzgenen erhöhen oder eine antagonistische Wirkung haben könnte, insbesondere bei Medikamenten, die die Nukleinsäure- oder Proteinsynthese hemmen52.

Unsere Studie hat gezeigt, dass die Wirksamkeit der Bakterienhemmung abhängig von den Protokollen, die zur Bewertung des Wirtsbereichs von Bakteriophagen verwendet werden, unterschiedlich sein kann, was sich direkt auf die Auswahl der Phagen für die Cocktailzusammensetzung auswirkt. Die Anwendung von Infektionstests in Flüssigkulturen zur Bestimmung des Wirtsbereichs, wie z. B. v1, ermöglicht die mühelose und zeitlose Bewertung des Phagencocktails als EOP und könnte daher für die Entwicklung von Phagencocktails eingesetzt werden, da in EOP die Phagen phA11 und phC11 ermittelt werden , und phC17 zeigte bei einigen Salmonella-Isolaten wie dem SG keine guten Werte für die Plaquebildung. In Kombination mit phB7 wurde jedoch in v1 kein Bakterienwachstum festgestellt und eine Biofilmkontrolle beobachtet. Allein auf der Grundlage der EOP-Werte wären diese Phagen nicht für die Bewertung der Antibiofilmaktivität gegen mehrere Salmonella-Isolate geeignet, und dieser Phagencocktail könnte unterschätzt werden. Daher kann die Kombination von Strategien und Techniken zur besseren Bewertung des Wirtsspektrums und der lytischen Aktivität von Bakteriophagen unter verschiedenen Bedingungen das antibakterielle Potenzial von Phagencocktails genauer demonstrieren. Dies könnte den Einsatz von Hochdurchsatzmethoden und Algorithmen zur Optimierung der Datenanalyse und Phagenkombination für die Cocktailzusammensetzung erleichtern und so den Entwicklungsprozess der Phagentherapie als vielversprechende Alternative zu Antibiotika beschleunigen.

Alle Bakterien wurden in Lysogeny-Broth (LB) Miller-Medium (10 g/L Trypton, 5 g/L Hefeextrakt und 10 g/L NaCl) oder auf LB Miller Agar (LBA) (1,5 % Agar)-Platten gezüchtet53. Für Plaque-Assays wurde LB Miller Soft Agar (LBSA) (0,7 % Agar), ergänzt mit 10 mM CaCl2, verwendet. Gehirn-Herz-Infusionsbrühe (BHI), ergänzt mit 30 % (v/v) Glycerin, wurde zur Lagerung von Bakterienisolaten bei -80 °C verwendet. Zur Lagerung und Verdünnung der Phagen wurde Salz-Magnesium-Puffer (SM) (50 mM Tris-Cl, 100 mM NaCl, 8 mM MgSO4) verwendet.

In dieser Studie wurden 50 Salmonella enterica subsp enterica-Isolate verwendet (Ergänzungstabelle S1). Der Standardstamm ATCC 13076 wurde von der American Type Culture Collection (ATCC, Gaithersburg, MD, USA) erworben, während die anderen aus kommerziellen Geflügelfarmen im Bundesstaat Paraná, Brasilien, isoliert wurden oder Teil der Sammlung des Laboratory of Basic and waren Angewandte Bakteriologie (Staatliche Universität Londrina, Brasilien). Alle Bakterien wurden bei -80 °C in BHI, ergänzt mit 30 % (v/v) Glycerin, gelagert. In jedem Experiment wurden frische 18–24-Stunden-Kulturen hergestellt, indem die Bakterien auf LBA-Platten ausgestrichen wurden und eine einzelne Kolonie in 5 ml LB geimpft und 18–24 Stunden lang bei 37 °C unter Schütteln bei 120 U/min inkubiert wurde.

Verschiedene Umweltproben wurden von kommerziellen Geflügelfarmen und Schlachthöfen im brasilianischen Bundesstaat Paraná gesammelt, darunter Geflügelstreuproben und Schlachthofabwasserproben, und wie zuvor beschrieben mit einigen Modifikationen für die Bakteriophagenisolierung verwendet54. Kurz gesagt, flüssige Proben wurden 10 Minuten lang bei 5000 × g zentrifugiert und der Überstand wurde durch einen 0,45 µm Polyethersulfon-Membranfilter (Membran mit geringer Proteinbindung) gesammelt. Für feste Proben wurden 5 g jeder Probe mit 10 ml salzhaltigem Magnesiumpuffer (SM) in sterilen 15-ml-Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen gemischt und durch Umdrehen 10 Minuten lang gründlich gemischt. Die Röhrchen wurden 5 Minuten lang bei 5000 × g zentrifugiert und der Überstand wurde wie bei flüssigen Proben gesammelt. Die Überstände wurden zur Bakteriophagenanreicherung verwendet.

Die Bakteriophagenanreicherung wurde wie zuvor beschrieben mit einigen Modifikationen durchgeführt54. Zunächst wurden 5 ml des Überstands mit 5 ml doppelt konzentriertem LB, ergänzt mit 20 mM CaCl2, in 50 ml Polypropylen-Zentrifugenröhrchen gemischt und 100 µL einer Bakterienkultur in der logarithmischen Phase hinzugefügt. Polypropylenröhrchen mit der Mischung wurden 24 Stunden lang bei 37 °C unter Schütteln bei 120 U/min inkubiert. Dann wurden 5 % (v/v) Chloroform in die Röhrchen gegeben, durch Umdrehen 5 Minuten lang gemischt und 5 Minuten lang bei 5000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt und bei 4 °C gelagert. Die Phagenaktivität wurde durch Aufbringen von 5 µL aus jedem Überstand auf einen Streifen des Wirtsstamms in LBA-Platten, ergänzt mit 10 mM CaCl2, nachgewiesen, und positive Ergebnisse wurden durch die Agar-Overlay-Methode bestätigt, um einzelne Plaques zu erhalten54. Die Plaques wurden anhand ihrer Trübung, ihres Durchmessers und ihrer Erscheinungsdauer ausgewählt. Die ausgewählten Plaques wurden mit einer sterilen Pipettenspitze vom Agar entfernt, in 1 ml LB, ergänzt mit 10 mM CaCl2, in 2 ml-Mikroröhrchen beimpft und 100 µL einer Bakterienkultur in der logarithmischen Phase hinzugefügt. Die Gemische wurden 6 Stunden lang bei 37 °C inkubiert und anschließend wurden Phagenlysate unter Verwendung des oben beschriebenen 5 %igen Chloroform- und Zentrifugationsverfahrens extrahiert. Jedes Lysat wurde mit der Agar-Overlay-Methode titriert. Dieser Vorgang wurde wiederholt, bis für jedes Lysat ein Plaque-Morphotyp erhalten wurde.

Der Wirtsbereich der isolierten Phagen wurde anhand der Streak-Spot-Test-Methode (SST)54 anhand von 50 Salmonella-Isolaten bestimmt, und die empfindlichen Phagen wurden der Relative Efficiency of Plating-Methode (EOP)22 unterzogen. Mithilfe des Streak-Spot-Tests wurde das bakterizide Potenzial aller isolierten Phagen bestimmt. Zur Bestimmung des EOP wurden Phagen mit dem breitesten Wirtsspektrum ausgewählt. EOP wurde für jeden Phagen berechnet, indem das Bakterienisolat mit der maximalen Plaquezahl im Vergleich zu den getesteten Isolaten verwendet wurde, d. h. der durchschnittliche PFU des getesteten Isolats dividiert durch den durchschnittlichen PFU des Isolats mit der maximalen Plaquezahl. Der EOP-Wert für die Phagen-Bakterien-Kombination wurde als „Hoch“ für Verhältnisse ≥ 0,5, „Mittel“ für Verhältnisse ≥ 0,1 und < 0,5, „Niedrig“ für Werte > 0,001 und < 0,1 und „Ineffizient“ für Verhältnisse ≤ 0,00122 klassifiziert . Mit GraphPad Prism v. 9.1.1 (GraphPad Software) wurde eine Heatmap zum Vergleich der EOP-Werte erstellt.

Die lytische Aktivität in der flüssigen Umgebung ausgewählter Phagen wurde im Vergleich zu den empfindlichen Isolaten im Streak-Spot-Test-Assay nach Haines et al.11 und Storms et al.23 mit Modifikationen bewertet. Zunächst wurden 100 µL doppelt konzentriertes LB, ergänzt mit 10 mM CaCl2, in die 96-Well-Platte mit flachem Boden gegeben. Anschließend wurden die Bakteriophagen verdünnt, um 1,5 × 108 PFU/ml zu erhalten, und 50 µL wurden in jede Vertiefung gegeben, um die dynamische lytische Aktivität der Phagen zu bewerten, mit Ausnahme der positiven (Bakterien und LB-Brühe) und negativen (nur LB-Brühe) Kontrollen und Blindproben. Die Formulierung des Cocktails erfolgte durch Mischen jedes Bakteriophagen im Verhältnis 1:1:1:1, um eine Endkonzentration von 1,5 × 108 PFU/ml zu erreichen und mit den einzelnen Phagen fortzufahren. Übernachtkulturen von Salmonella-Isolaten in LBA wurden auf eine 0,5-MacFarland-Skala (1,5 × 108 KBE/ml) in Kochsalzlösung (0,85 % NaCl) eingestellt und 50 µL wurden in jede Vertiefung gegeben, außer in der Negativkontrolle und dem Leerwert. Den Positiv- und Negativkontrollen wurde SM-Puffer zugesetzt, um ein Endvolumen von 200 µL zu erreichen. Die Leerproben hatten den gleichen Inhalt wie die Negativkontrollen. Diese Konzentrationen wurden verwendet, um eine theoretische Infektionsmultiplizität (MOI) von 1 zu erreichen. Die Plattenabdeckung wurde entfernt und mit einer gasdurchlässigen plastifizierten Polyvinylchlorid-Folie (PVC) sicher versiegelt. Die Platte wurde im Multiskan GO Microplate Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finnland) inkubiert und OD(A595nm)-Messungen wurden alle 15 Minuten für 12 Stunden bei 37 °C durchgeführt. Jeder Test wurde für jeden Salmonella-Stamm dreifach wiederholt und die Daten wurden als einzelne Abtötungstestkurve mit dem Mittelwert der Werte unter Verwendung von Microsoft Office Excel v. 16.0 aufgezeichnet.

Die Fläche unter den Kurven wurde unter Verwendung der Trapezregel für jeden Test von 0 bis 12 Stunden berechnet. Die lokale Virulenz für MOI 1 (v1) wurde auf der Grundlage der Arbeiten von Storms et al.23 und Haines et al.11 berechnet, indem die integrierte Fläche einer Phagentestkurve (Ai) mit der integrierten Fläche der Positivkontrolle (phagenfrei) verglichen wurde Kontrolle) (A0) und die Ergebnisse wurden zwischen einem theoretischen Minimum und Maximum von 0 bzw. 1 normalisiert.

Der lokale Virulenz-Score wurde als „Hoch“ für v1 > 0,5, „Mittel“ für 0,2 ≤ v1 ≤ 0,5, „Niedrig“ für 0,001 ≤ v1 < 0,2 und „Ineffizient“ für v1 < 0,001 klassifiziert. Eine Heatmap, die den v1-Score für einzelne Phagen und den Cocktail vergleicht, wurde mit GraphPad Prism v. 9.1.1 (GraphPad Software) aufgezeichnet. R v. 4.2.2 wurde verwendet, um den Vergleich von EOP und v1 in einem Dotplot-Diagramm darzustellen.

Für den MOI-Assay gehen wir davon aus, dass eine 100-prozentige Phagenadsorption kurz nach der Phagenzugabe an Bakterien stattgefunden hat25. Bakteriophagenbestände wurden mit SM-Puffer in Zehnfachreihen verdünnt. Bakterielle Wirtskulturen (108 KBE/ml) wurden mit Aliquots jeder Verdünnung des jeweiligen Phagen gemischt, was zu unterschiedlichen Verhältnissen (10–7 zu 1 PFU/KBE) in dreifacher Ausfertigung führte, und 18 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Phagenlysate wurden titriert, um die höchste Produktion als optimale MOI zu bestimmen. Der Test wurde zu drei unabhängigen Zeitpunkten durchgeführt.

Die Stabilität von Phagen bei verschiedenen pH-Werten und Temperaturen wurde wie zuvor beschrieben56,57 mit Modifikationen bewertet. Zunächst wurden die Phagen in SM-Puffer (50 mM Tris-Cl, 100 mM NaCl, 8 mM MgSO4) verdünnt, um 108 PFU/ml zu erreichen, dann wurden 100 μl jedes Phagen in 900 μl eines universellen pH-Puffers (150 mM KCl) gegeben , 10 mM KH2PO4, 10 mM Na3C6H5O7, 10 mM H3BO3) mit pH-Einstellung mit NaOH oder HCl von 2,5 bis 12,5. Es wurde eine Kontrolle mit SM-Puffer (pH 7,4) durchgeführt. Die Suspensionen wurden 24 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert, und dann wurden die Phagen zur Zählung verdünnt und unter Verwendung der Agar-Overlay-Methode58 ausplattiert. Am Ende des Tests ermöglichte uns der Unterschied in der Titration im Vergleich zu den Kontrollexperimenten, die Lebensfähigkeit der Phagen zu bewerten.

Um die Stabilität der Phagen in verschiedenen Temperaturbereichen zu beurteilen, wurden sie in SM-Puffer (107 PFU/ml) inkubiert und bei –20 °C, 4 °C (als Kontrolle), 25 °C, 30 °C, 37 °C gelagert C, 50 °C, 70 °C und 90 °C für 1 Stunde, 24 Stunden und 7 Tage (außer 50 °C, 70 °C und 90 °C). Nach der Inkubation wurde ein Aliquot von 100 μl jedes Phagen gesammelt, verdünnt und zur Zählung ausplattiert.

Mit einigen Modifikationen59 wurde die Fällungsmethode mit Polyethylenglykol (PEG) verwendet, um Phagen zu konzentrieren und zu reinigen. Eine 5-ml-Kultur der Wirtsbakterien mit den Phagen mit der besten MOI wurde in 500 ml LB-Medium überführt und über Nacht bei 37 °C kultiviert. Den 500 ml Kultur wurde Chloroform bis zu einer Endkonzentration von 0,1 % zugesetzt und 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Der Kultur wurde NaCl bis zu einer Endkonzentration von 1 M zugesetzt und dann 1 Stunde lang in einem Eiswasserbad inkubiert. Anschließend wurde die Kultur 10 Minuten lang bei 11.000 × g zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen, und dem Überstand wurde Polyethylenglykol 8000 (PEG8000) bis zu einer Endkonzentration von 10 % (Gew./Vol.) zugesetzt. Diese Suspension wurde 1 Stunde lang in einem Eiswasserbad inkubiert, um Phagenpartikel auszufällen. Die Suspension wurde 10 Minuten lang bei 11.000 × g zentrifugiert, und das Pellet wurde in 5 ml SM-Puffer resuspendiert, gefolgt von der Zugabe von 5 ml Chloroform und gründlichem Mischen durch 5-minütiges Umdrehen und 5-minütigem Zentrifugieren bei 5.000 × g zur Trennung die Phagen aus dem PEG8000. Anschließend wurde die wässrige Phase gesammelt und 3 ml der konzentrierten Phagensuspension 2 Stunden lang bei 110.000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das „glasartige Pellet“ wurde in SM-Puffer resuspendiert und durch einen Polyethersulfon-Membranfilter mit einer Porengröße von 0,22 μm (Membran mit geringer Proteinbindung) filtriert und bei 4 °C gelagert.

Der Phagencocktail wurde getestet, um die Antibiofilmaktivität gegen Salmonella-Biofilme zu bewerten60,61,62. Salmonellenproben, die gegenüber Phagen empfindlich waren, wurden 18–24 Stunden lang in 5 ml LB-Medium bei 37 °C gezüchtet. Bakterienproben wurden 1:100 in LB-Medium verdünnt und jeweils 100 µL wurden sowohl für die Kontrollen als auch für die mit Phagencocktail behandelten Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen und flachem Boden in fünffacher Ausfertigung hinzugefügt. Nach 24-stündiger Inkubation bei 37 °C ohne Rühren wurde die Planktonphase entfernt und jede Vertiefung zweimal mit 100 µL vorgewärmtem (37 °C) PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4). Für die 24-Stunden-Biofilmkontrolle wurden 100 µL MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazoliumbromid) mit 0,25 mg/ml, verdünnt in LB, in jede Vertiefung gegeben und bei 37 °C inkubiert °C für 2 Stunden vor Licht geschützt aufbewahren. Nach 2 Stunden wurde das MTT entfernt und 100 µl Dimethylsulfoxid (DMSO) in die Vertiefungen gegeben und nach 15 Minuten Solubilisierung wurden OD-Messungen bei A570 mit dem Multiskan GO Microplate Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finnland). Für mit Phagen behandelte Gruppen wurden 50 µL Phagencocktail (5 × 107 PFU jedes Phagen – 2 × 108 PFU/ml aller Phagen) plus 50 µL LB-Medium doppelter Stärke in die Vertiefungen gegeben. Für die 48-Stunden-Biofilmkontrolle wurden nur 100 µL vorgewärmtes LB in die Vertiefungen gegeben, gefolgt von einer Inkubation der Mikrotiterplatte bei 37 °C ohne Rühren. Nach 24-stündiger Inkubation wurde die Planktonphase entfernt und jede Vertiefung wie bereits erwähnt gewaschen, und der Nachweis/die Quantifizierung des Biofilms erfolgte gemäß den zuvor beschriebenen Schritten. Die Biofilmproduktion wurde basierend auf dem Grenzwert, der nach der folgenden Formel unter Verwendung der Werte der optischen Dichte (OD) berechnet wurde, als negativ, schwach, mäßig und stark klassifiziert44:

ODcutoff (ODc): OD-Durchschnitt der Negativkontrolle + (3 × Standardabweichung der ODs der Negativkontrolle).

OD ≤ ODc = Nicht produzierender Biofilm;

ODc < OD ≤ (2 × ODc) = Schwacher Biofilmproduzent;

(2 × ODc) < OD ≤ (4 × ODc) = Mäßiger Biofilmproduzent;

OD > 4 × ODc = Starker Biofilmproduzent.

Die konfokale Rasterlasermikroskopie wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt, mit einigen Modifikationen50. Für die konfokale Mikroskopieanalyse wurden 24-Stunden- und 48-Stunden-Biofilme gebildet, indem 2 ml einer 1:100 verdünnten S. enterica Gallinarum (SG)-Zellsuspension aus einer ON-Kultur in LB in eine Platte mit 24 Vertiefungen geimpft wurden, die auf der Unterseite ein rundes Glasdeckglas enthielt . Die Platte wurde unter statischen Bedingungen bei 37 °C inkubiert. Nach 24 Stunden wurde die Planktonphase für alle Gruppen entfernt und der Biofilm zweimal mit vorgewärmtem (37 °C) PBS gewaschen. Für die 24-Stunden-Biofilmgruppe wurden 400 µL Paraformaldehyd hinzugefügt und 30 Minuten lang bei 37 °C inkubiert, gefolgt von zweimaligem Waschen mit PBS. Als nächstes wurden 200 µL 4´,6-Diamidino-2-phenylindol-dihydrochlorid (DAPI) zur Färbung in die Vertiefungen gegeben und 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert. Nach der Inkubationszeit wurden die Vertiefungen mit PBS gewaschen, das Deckglas vorsichtig entfernt, mit einem Tropfen Fluoromount-G™ Eindeckmedium (Sigma-Aldrich F4680) auf einen Objektträger gegeben und die Fluoreszenzbildgebung mit einem TCS durchgeführt Konfokales Rasterlasermikroskop SP8 (Leica Microsystems, Mannheim, Deutschland) mit einem 60-fach-Wasserobjektiv. Das konfokale Mikroskop TCS SP8 verwendete die LAS X-Software (Leica Microsystems, Mannheim, Deutschland). Für mit Phagen behandelte Gruppen wurden vorgewärmtes (37 °C) LB-Medium und ein Phagencocktail (5 × 107 PFU jedes Phagen − 2 × 108 PFU/ml aller Phagen) in die Vertiefungen gegeben und weitere 24 Stunden bei inkubiert 37 °C. Für die 48-Stunden-Biofilmkontrolle wurde nur vorgewärmtes (37 °C) LB in die Vertiefungen gegeben, gefolgt von einer 24-stündigen Inkubation bei 37 °C ohne Rühren. Anschließend wurde die Planktonphase entfernt, jede Vertiefung wie bereits erwähnt gewaschen und der Nachweis/die Quantifizierung des Biofilms erfolgte entsprechend den zuvor beschriebenen Schritten.

Phagen-DNA wurde aus hochkonzentriertem und gereinigtem Phagenstamm unter Verwendung der an anderer Stelle63 beschriebenen Methoden mit einigen Modifikationen extrahiert. Gereinigte Phagenpartikel wurden 15 Minuten lang bei Raumtemperatur mit DNase I (1 μg/ml) (Sigma-Aldrich) behandelt und anschließend wurde die Nuklease 5 Minuten lang bei 75 °C inaktiviert. Dann wurden Proteinase K (20 μg/ml) und Natriumdodecylsulfat (SDS) (1 %) zugegeben und die Mischung 1 Stunde lang bei 60 °C inkubiert. Zur wässrigen Phase wurden 500 µL Chloroform:Isoamylalkohol (24:1) gegeben und 5 Minuten lang bei 16.000 × g zentrifugiert. Die wässrige Phase wurde mit dem 0,8-fachen Volumen Isopropanol ausgefällt und 30 Minuten bei 16.000 × g zentrifugiert. Das Pellet wurde zweimal mit 80 %igem Ethanol gewaschen, kurz an der Luft getrocknet und dann wurde entionisiertes Wasser verwendet, um die präzipitierte genomische DNA aufzulösen.

Vor der Sequenzierung wurden die Qualität und Quantität der DNA sowohl mithilfe eines Qubits (Thermo Fisher Scientific) als auch durch Visualisierung nach der Agarosegelelektrophorese geschätzt. Die Bibliothek wurde mit dem Nextera XT Illumina Kit erstellt. Die Sequenzierung wurde auf Illumina MiSeq unter Verwendung von MiSeq Reagent 500V2 durchgeführt. Paarendsequenzen (2 × 250 Basen) wurden mit CLC Genomics Workbench (Qiagen) zusammengestellt.

Die Qualität aller Lesevorgänge aus der Sequenzierung wurde mit FastQC64⁠ verifiziert und die Berichtstrimmparameter wurden für Trimmomatic26⁠ definiert. Die aus dieser Filterung resultierenden Lesevorgänge wurden für die Genomassemblierung mit SPAdes27⁠ verwendet. Eine Teilmenge der ursprünglichen Lesevorgänge wurde mit seqtk (https://github.com/lh3/seqtk) erstellt und für die Assemblierung mit SPAdes verwendet. Baugruppen mit unterschiedlichen k-mer-Werten wurden mit QUAST65 verglichen. Das gesamte Genom wurde in einem einzigen Contig gefunden, der für die weitere Analyse ausgewählt wurde; Andere Contigs wurden mit BLASTN auf mögliche Fragmente überprüft.

VIRIDIC32 wurde verwendet, um die intergenomischen Ähnlichkeiten der vier Phagen zu berechnen, mit einem Artenschwellenwert von 95 % und einem Gattungsschwellenwert von 70 %33. Für die zirkuläre Darstellung der vier Genome wurde die Software BRIG31⁠ verwendet. Die in Zusatzbildern gezeigten Merkmale wurden per Skript mit Biopython66⁠ ausgewählt und die als „Hypothetisches Protein“ und „Phagenprotein“ identifizierten Merkmale wurden zu Visualisierungszwecken verworfen.⁠

Die Phylogenie- und Klassifizierungsanalyse wurde vom VICTOR-Webdienst (https://victor.dsmz.de) durchgeführt, einer Methode zur genombasierten Phylogenie und Klassifizierung prokaryotischer Viren34. Alle paarweisen Vergleiche der Nukleotidsequenzen wurden mit der Genome-BLAST Distance Phylogeny (GBDP)-Methode67 unter den für prokaryotische Viren empfohlenen Einstellungen34 durchgeführt. Die resultierenden intergenomischen Abstände wurden verwendet, um einen ausgeglichenen minimalen Evolutionsbaum mit Zweigunterstützung über FASTME abzuleiten, einschließlich SPR-Nachbearbeitung68 für jede Formel D0, D4 bzw. D6. Die Zweigunterstützung wurde aus jeweils 100 Pseudo-Bootstrap-Replikaten abgeleitet. Bäume wurden in der Mitte verwurzelt69 und mit ggtree70 visualisiert. Taxongrenzen auf Arten-, Gattungs- und Familienebene wurden mit dem OPTSIL-Programm71, den empfohlenen Clustering-Schwellenwerten34 und einem F-Wert (Anteil der für die Clusterfusion erforderlichen Links) von 0,572 geschätzt.

ABRicate mit der Resfinder-Datenbank wurde verwendet, um die Genome auf das Vorhandensein von Genen mit antimikrobieller Resistenz und Virulenzfaktoren zu untersuchen (https://github.com/tseemann/abricate)28⁠. Für das Gen-Calling wurden RAST29⁠ und PHASTER30⁠ verwendet. Der tRNA-Nachweis wurde mit tRNAscan-SE73 durchgeführt. Die Analyse der vorhergesagten Phagenschwanzfaser-Gene wurde mit der Software Geneious Version 2023.1 (Biommaters, Inc., Neuseeland) (https://www.geneious.com) durchgeführt.

Alle Phagengenome wurden an die GenBank übermittelt. Die Zugangsnummern für alle Phagengenome lauten OQ680478, OQ680479, OQ680480 und OQ680481 für die Phagen phA11, phB7, phC11 und phC17.

GraphPad Prism v.9.1.1 (GraphPad Software) wurde für die statistische Analyse der Biofilm-Assays verwendet. Die Ergebnisse wurden als Mittelwert ± Standardabweichung nach Analyse mit einer einfaktoriellen ANOVA für DAPI-Fluoreszenzintensitätsdaten oder einer zweifaktoriellen ANOVA für MTT-Biofilm-Assay-Daten mit Post-hoc-Mehrfachvergleichstests von Tukey für beide ausgedrückt, und p < 0,05 wurde als signifikant angesehen.

Die während der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich, und die DNA-Sequenz der Bakteriophagen ist in der GenBank-Datenbank unter den Zugangsnummern OQ680478, OQ680479, OQ680480 und OQ680481 verfügbar.

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Die Autoren danken der Coordination for the Improvement of Higher Education Personnel (CAPES) des Ph.D. Stipendium des JMRWAVJ dankt dem CNPq-Stipendium (#309633/2021-4). Die Autoren danken dem CMLP-UEL (Central Multiusuário de Laboratórios de Pesquisa da Universidade Estadual de Londrina) für den kostenlosen Zugang zu Geräten.

Labor für grundlegende und angewandte Bakteriologie, Staatliche Universität Londrina, Londrina, PR, Brasilien

Jhonatan Macedo Ribeiro, Giovana Nicolete Pereira, Renata Katsuko Takayama Kobayashi und Gerson Nakazato

Labor für Bioinformatik, Bundesuniversität Santa Catarina, Florianópolis, SC, Brasilien

Itamar Durli Jr

Labor für Mikrobenbiotechnologie, Staatliche Universität Londrina, Londrina, PR, Brasilien

Gustavo Manoel Teixeira

Labor für Schmerzen, Entzündungen, Neuropathie und Krebs, Staatliche Universität Londrina, Londrina, PR, Brasilien

Mariana Marques Bertozzi & Waldiceu A. Verri Jr

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JMR trug zur Konzeption und Ausarbeitung der Studie, zum Design und zur Planung der Experimente bei, führte die Experimente durch, erfasste Daten, analysierte, interpretierte und verfasste diesen Artikel. GNP führt die Experimente, die Datenerfassung, die Analyse und das Verfassen dieses Artikels durch. IDJ beschaffte und stellte die Umweltproben für die Phagenisolierung bereit, führte die Phagenisolierungsexperimente durch und überprüfte den Artikel. GMT führt die bioinformatische Analyse und Überprüfung dieses Artikels durch. MMB führt das konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie-Experiment durch, analysiert und interpretiert die Bilder und überprüft diesen Artikel. WAVJ hat zur Analyse und Interpretation der Bilder der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie beigetragen und diesen Artikel überprüft. RKTK leistete einen Beitrag zur Unterstützung und Anleitung zur Datenanalyse und -interpretation. GN war an der Beratung dieser Studie und der kritischen Überprüfung des Artikels beteiligt.

Korrespondenz mit Gerson Nakazato.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Ribeiro, JM, Pereira, GN, Durli Junior, I. et al. Vergleichende Analyse der Wirksamkeit der Entwicklung von Phagencocktails gegen mehrere Salmonella-Serovare und ihrer Aktivität zur Biofilmkontrolle. Sci Rep 13, 13054 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-40228-z

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Eingegangen: 28. März 2023

Angenommen: 07. August 2023

Veröffentlicht: 11. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-40228-z

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