Erhöhte Bindung und funktionelle Antikörperreaktionen auf SARS

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 4864 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die Antikörperreaktionen bei Säuglingen auf eine Virusinfektion können sich von denen bei Erwachsenen unterscheiden. Es liegen jedoch nur begrenzt Daten zur Spezifität und Funktion von Antikörpern gegen das schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) bei Säuglingen sowie direkte Vergleiche zwischen Säuglingen und Erwachsenen vor. Hier charakterisieren wir die Antikörperbindung und -funktionalität gegen den Wuhan-Hu-1-Stamm (B-Linie) SARS-CoV-2 im Rekonvaleszenzplasma von 36 postpartalen Frauen und 14 ihrer mit SARS-CoV-2 infizierten Säuglinge aus einer impfnaiven prospektiven Kohorte in Nairobi, Kenia. Wir finden deutlich höhere Antikörpertiter gegen SARS-CoV-2 Spike, die Rezeptorbindungsdomäne und die N-terminale Domäne sowie Spike-exprimierende Zelloberflächenfärbungsniveaus bei Säuglingen im Vergleich zu Müttern. Plasmaantikörper von Müttern und Säuglingen binden an ähnliche Regionen der Spike S2-Untereinheit, einschließlich des Fusionspeptids (FP) und der Stammhelix-Heptadenwiederholung 2. Allerdings weisen Säuglinge im Vergleich zu Säuglingen höhere Antikörperspiegel und konsistentere Antikörper-Ausweichwege in der FP-Region auf Mütter. Schließlich weisen Säuglinge ein deutlich höheres Maß an antikörperabhängiger zellulärer Zytotoxizität (ADCC) auf, obwohl überraschenderweise die Spike-Pseudovirus-Neutralisationstiter zwischen Säuglingen und Müttern ähnlich sind. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Säuglinge ausgeprägte SARS-CoV-2-Bindungs- und funktionelle Antikörperaktivitäten entwickeln und altersbedingte Unterschiede in der humoralen Immunität gegen eine SARS-CoV-2-Infektion aufzeigen, die für den Schutz und die Folgen der COVID-19-Erkrankung relevant sein könnten.

Die Antikörperreaktionen auf eine Virusinfektion unterscheiden sich oft zwischen Säuglingen und Erwachsenen1,2,3,4,5, was auf mehrere Faktoren zurückzuführen ist, darunter das sich entwickelnde Immunsystem des Säuglings und Unterschiede in der Infektionsgeschichte. Über kindspezifische Antikörperreaktionen auf SARS-CoV-2 ist relativ wenig bekannt, was zur altersabhängigen Schwere der Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19) beitragen könnte6,7,8. Plasmaantikörper von Personen, die mit SARS-CoV-2 infiziert sind, zielen auf mehrere virale Proteine ab, obwohl Antikörper, die auf das Oberflächenglykoprotein Spike abzielen, wahrscheinlich Korrelate des Schutzes sind, basierend auf Impfstoff- und SARS-CoV-2-Challenge-Studien (Übersicht in 9). Daher ist die Charakterisierung der Spiegel und der funktionellen Kapazität von Antikörpern, die an Spike und seine Subdomänen binden, wichtig für das Verständnis der humoralen Immunität gegen SARS-CoV-2 im gesamten Altersspektrum.

Innerhalb der beiden Untereinheiten von Spike (S1 und S2) wurden mehrere gemeinsame Antikörperbindungsstellen identifiziert. Dazu gehören Epitope innerhalb der Rezeptorbindungsdomäne (RBD) von S1 und stärker konservierte Regionen der S2-Untereinheit, einschließlich der SARS-CoV-2-Fusionsmaschinerie, die offenbar weniger anfällig für Mutationen ist10,11,12. Während die meisten neutralisierenden Antikörper gegen SARS-CoV-2 auf den RBD abzielen, binden die meisten Plasmaantikörper anderswo auf Spike13,14,15. Antikörper, die auf Stellen außerhalb der RBD abzielen, einschließlich solcher in der S2-Untereinheit mit dokumentierter neutralisierender Aktivität oder Fc-vermittelter Effektorfunktionalität16,17,18, sind attraktive therapeutische Kandidaten, da es im Zuge der weiteren Entwicklung von SARS-CoV-2 keine Hinweise auf ein Entkommen gibt . Mehrere Studien haben das Fusionspeptid (FP), die Heptad-Wiederholungen 1 und 2 (HR1 und HR2) und die Stammhelix (SH-H), die teilweise mit dem N-Terminus von HR2 überlappt, als Ziele für S2-gerichtete Antikörper identifiziert Reaktionen bei Erwachsenen13,19,20. Ob es sich hierbei auch um wichtige Antikörperziele bei Säuglingen handelt und ob sich Säuglinge und ihre Mütter in den Antikörperbindungsprofilen auf Epitopebene unterscheiden, wurde nicht untersucht.

Während in früheren Studien die Neutralisierungskapazität in Kohorten untersucht wurde, zu denen auch ältere Kinder gehörten21,22,23,24, haben nur wenige Studien die SARS-CoV-2-Antikörperfunktion25 bei Säuglingen im frühen Lebensalter untersucht oder die Antikörperreaktionen bei Säuglingen und Erwachsenen direkt verglichen. Obwohl die Antikörperneutralisierung von SARS-CoV-2 nach wie vor eine Schlüsselkomponente der schützenden und therapeutischen Immunität ist, gibt es zunehmend Belege für die Bedeutung nicht neutralisierender Antikörpereffektorfunktionen, wie z. B. der Fc-Rezeptor-vermittelten antikörperabhängigen zellulären Zytotoxizität (ADCC) für den Schutz gegen SARS-CoV-26,26,27,28,29,30. Dies gilt auch für andere Virusinfektionen; HIV-spezifische ADCC-Aktivität wurde in mehreren Studien mit verbesserten Ergebnissen bei Säuglingen mit HIV in Verbindung gebracht31,32,33,34. Daher besteht Bedarf an einer detaillierten Charakterisierung altersbedingter Gemeinsamkeiten und Unterschiede sowohl bei der Bindung als auch bei den funktionellen Antikörperreaktionen auf eine SARS-CoV-2-Infektion.

In dieser Arbeit untersuchen wir die Eigenschaften der Antikörperantwort auf eine SARS-CoV-2-Infektion bei Säuglingen im Vergleich zu ihren Müttern innerhalb einer einzigen Kohortenstudie. Wir zeigen, dass Säuglinge im Vergleich zu Müttern unterschiedliche Antikörperreaktionen aufweisen, einschließlich erhöhter Antikörperbindung an Spike, erhöhter nichtneutralisierender Antikörperaktivität (ADCC) und konvergenter Antikörperbindungs-Escape-Profile in der FP-Region des Spike-Proteins.

Längsplasmaproben von Säuglingen und ihren Müttern, die an einer prospektiven Kohortenstudie in Nairobi, Kenia, (der Linda-Kizazi-Studie) teilnahmen, wurden zuvor mit einem Nukleokapsid-Enzym-Immunoassay (ELISA) auf SARS-CoV-2-Seropositivität getestet35. Die erste seropositive Probe von Personen, die während des ursprünglichen Studienzeitraums serokonvertiert waren, wurde in diese Studie einbezogen (Tabelle 1). Die Probenentnahme erfolgte in etwa dreimonatigen Abständen, und wir schätzten den Zeitpunkt der Infektion, indem wir für jede Person den Mittelpunkt zwischen der letzten seronegativen Probe und der ersten seropositiven Probe berechneten35. Da die Antikörperreaktionen im Laufe der Zeit erheblich nachlassen können36,37, verglichen wir die Zeit seit der Infektion zum Zeitpunkt der in diese Studie einbezogenen Probenahme und stellten keinen signifikanten Unterschied zwischen den geschätzten Tagen seit der Infektion bei Säuglingen und Müttern fest, was darauf hindeutet, dass der Grad der Antikörperabnahme zwischen beiden ähnlich war die beiden Gruppen (Abb. S1).

Wichtig ist, dass alle Mütter, die eine Serokonversion zu SARS-CoV-2 durchführten, dies nach der Geburt taten und dass die beim Säugling nachgewiesenen Antikörper daher nicht auf eine passive Übertragung durch ihre Mutter zurückzuführen waren. Ebenso zirkulieren Antikörper, die in der menschlichen Muttermilch vorhanden sind, systemisch nicht in nennenswerten Mengen bei Säuglingen38. Mütter in der Kohorte lebten vor der Einschreibung entweder mit HIV und erhielten seit ≥ 6 Monaten eine antiretrovirale Therapie (ART) oder lebten nicht mit HIV, und die Säuglinge waren HIV-exponiert/nicht infiziert oder nicht exponiert (Tabelle 1). Es wurde festgestellt, dass der HIV-Status in dieser Kohorte keinen Einfluss auf das Risiko einer SARS-CoV-2-Infektion hat, kein Teilnehmer war gegen SARS-CoV-2 geimpft und die Sequenzierung des gesamten Genoms aus Stuhl ergab, dass die B.1-Linie in zwei von ihnen vorhanden war Proben, im Einklang mit den globalen Zirkulationsmustern zum Zeitpunkt der Probenentnahme35. Alle Fälle von COVID-19 waren entweder asymptomatisch oder hatten einen leichten Krankheitsschweregrad (Tabelle 1).

Um die SARS-CoV-2-Antikörpertiter zwischen Säuglingen und Müttern zu vergleichen, haben wir ihre ersten seropositiven Plasmaproben mit zwei Methoden getestet: (1) einer kommerziell erhältlichen Multiplex-Elektrochemilumineszenzplattform (MSD) zum Nachweis der IgG-Bindung an SARS-CoV-2-Antigene, einschließlich vollständiger -Längen-Spike, RBD, N-terminale Domäne (NTD) und Nukleokapsid und (2) ein Zelloberflächen-Färbetest, der die Antikörperbindung an GFP-markierten Spike misst, der auf der Oberfläche von CEM.NKr CCR5+-Zellen (S-CEM-Zellen) exprimiert wird ). Durch MSD konnten wir signifikant höhere IgG-Titer gegen Spike, RBD und NTD bei Säuglingen im Vergleich zu Müttern feststellen (p = 0,002, 0,001 bzw. 0,001, Abb. 1A–C), es gab jedoch keinen statistisch signifikanten Unterschied im IgG-Titer gegen Nukleokapsid (p = 1,0, Abb. 1D). Als wir die Analyse auf Säuglings-Mutter-Paare (N = 9) beschränkten, wurden bei Säuglingen ebenfalls signifikant höhere Konzentrationen bindender Antikörper über alle Antigene hinweg beobachtet, mit Ausnahme von Nukleokapsid, wie zuvor in der aggregierten Gruppe beobachtet (Abb. S2A – D). Als wir das Ausmaß der Zelloberflächenfärbung verglichen, das das Ausmaß der Bindung von IgG-Antikörpern an membrangebundenes Spike misst, war die Reaktion des Säuglings signifikant höher als die Reaktion der Mütter (p = 0,009, Abb. 1E, S2E und S3). Die Antikörperbindung an Spike voller Länge korrelierte zwischen den Methoden, was darauf hindeutet, dass diese Tests konsistente Metriken der Antikörperbindungsreaktion an Spike sind (r = 0,7; p < 0,0001, Abb. 1F). Statistisch signifikante Antikörperbindungsvergleiche blieben nach Stratifizierung nach HIV-Status (Tabelle S1) und nach Stratifizierung nach asymptomatischem Status (Tabelle S2) signifikant. Beim Vergleich von Säuglingen und Müttern mit Symptomen ging die Signifikanz verloren, wahrscheinlich aufgrund der geringen Anzahl symptomatischer Säuglinge in der Kohorte (N = 3) (Tabelle S2).

IgG-Antikörperbindungstiter an A-Spike in voller Länge, B RBD, C NTD und D-Nukleokapsid in Rekonvaleszenzplasma von Säuglingen (lila, N = 14) und Müttern (blau, N = 35), gemessen mit einem kommerziellen Multiplex-Elektrochemilumineszenz-Assay (MSD). . E Antikörper, der an Spike bindet und auf der CEM-Zelloberfläche bei Säuglingen (lila, N = 10) und Müttern (blau, N = 35) exprimiert wird. Die Spike-Färbung wurde dreifach wiederholt. F-Spearman-Korrelationskoeffizient und p-Wert (p = 2,5 × 10−7), berechnet für die Spike-IgG-Bindung durch MSD-Assay im Vergleich zur S-CEM-Zelloberflächenfärbung. Boxplots zeigen die mittlere Mittellinie und 25/75-Perzentile. Whisker zeigen Min- und Max-Werte an. P-Werte sind oberhalb der Vergleiche angegeben. Für alle Vergleiche wurde der zweiseitige Wilcoxon-Rangsummentest verwendet. MFI mittlere Fluoreszenzintensität, AU/ml, willkürliche Einheiten/Milliliter.

Unsere Daten deuten darauf hin, dass die Spiegel spezifischer Antikörper gegen Spike, RBD und NTD bei Säuglingen höher waren als bei Müttern. Um Bindungsstellen mit höherer Auflösung abzugrenzen und Epitope außerhalb dieser Domänen zu identifizieren, verwendeten wir einen zuvor beschriebenen phagenbasierten Immunpräzipitationsansatz (Phage-DMS)13,39, um lineare Epitopbindungsprofile in Plasmaproben von Müttern und ihren Säuglingen abzubilden. Phagen-DMS erkennt Epitope basierend auf der Anreicherung von Antikörper-gebundenen Peptiden, die vom T7-Phagen exprimiert werden, und definiert darüber hinaus Mutationen, die ein Entweichen ermöglichen, indem es den Verlust der Antikörperbindung an mutierte Peptide bewertet. Die Peptidbibliothek bestand aus Peptiden mit 39 Aminosäuren, die in einzelnen Aminosäureintervallen über Spike der B-Linie (Wuhan-Hu-1-Sequenz plus D614G) verteilt waren, und umfasste auch Wildtyp-Sequenzen (d. h. Wuhan-Hu-1 plus D614G). jede mögliche Aminosäuremutation an der zentralen Position jedes Peptids (siehe Methoden).

Wir haben zunächst die Antikörperbindung an Wildtyp-Spike-Sequenzen kartiert, um lineare Epitopprofile bei SARS-CoV-2-seropositiven Müttern und Säuglingen zu bestimmen. Die Antikörperbindung an FP und SH-H, beide in der S2-Untereinheit, war die vorherrschende Reaktion sowohl bei Säuglingen als auch bei Müttern (Abb. 2A). Wir bestätigten, dass diese Regionen vorherrschend waren, und definierten die an der Bindungsreaktion beteiligten Reste mithilfe der Hauptkomponentenanalyse (Abb. 2A und S4). Die Reaktionen auf FP und SH-H spiegeln zuvor identifizierte Epitope bei SARS-CoV-2-infizierten, ungeimpften Personen mit mildem COVID-1913,19,20,40,41,42 wider. Lineare Reaktionen auf die NTD und die C-terminale Domäne (CTD), die manchmal bei Personen zu finden sind, die mit COVID-19 ins Krankenhaus eingeliefert wurden, oder bei geimpften Personen19,20,40, fehlten sowohl bei Säuglingen als auch bei Müttern, was mit dem Fehlen einer Impfung oder schwerwiegenden klinischen Manifestationen übereinstimmt von COVID-19 in dieser Kohorte. Auch Reaktionen auf die RBD fehlten, möglicherweise weil RBD-Epitope konformationell sein können43,44, während Phage-DMS nur lineare, nicht glykosylierte Epitope erfasst.

Eine Heatmap, die peptidgebundene, angereicherte Antikörperreaktionen für einzelne Säuglinge (N = 10) und Mütter (N = 35) darstellt (Zeilen). Spike-Subdomänen und Aminosäurebereiche sind oben gekennzeichnet. Graue Balken zeigen Epitope an, die in dieser Studie im Fokus stehen (FP und SH-H). Die Positionen der Spike-Aminosäuren und der S1- und S2-Untereinheiten sind auf der unteren X-Achse angegeben. Die Anreicherungsskala ist rechts angegeben. Summierte Antikörperanreicherung bei Müttern (blau, N = 35) und Säuglingen (lila, N = 10) im FP-Epitop (B) und SH-H-Epitop (C). Boxplots zeigen die mittlere Mittellinie und 25/75-Perzentile. Whisker zeigen Min- und Max-Werte an. P-Werte sind oberhalb der Vergleiche angegeben. Für beide Vergleiche wurde der zweiseitige Wilcoxon-Rangsummentest verwendet. NTD n-terminale Domäne, RBD-Rezeptorbindungsdomäne, CTD c-terminale Domäne, FP-Fusionspeptid, HR1-Heptadenwiederholung 1, SH-H-Stammhelix-Heptadenwiederholung 2, HR2-Heptadenwiederholung 2.

Während sich das Gesamtmuster der Spike-Antikörperbindung sowohl bei Säuglingen als auch bei Müttern auf FP und SH-H konzentrierte, beobachteten wir Unterschiede im Ausmaß der Anreicherung zwischen Individuen. Um zu testen, ob das Ausmaß der Antikörperanreicherung in den FP- und SH-H-Regionen zwischen Säuglingen und Müttern insgesamt unterschiedlich war, haben wir die Antikörperanreicherung an jeder Position über das FP-Epitop (Reste 805–835) und das SH-H-Epitop summiert ( Reste 1135–1170). Interessanterweise hatten Säuglinge eine signifikant höhere summierte Anreicherung im FP als Mütter (p = 0,01, Abb. 2B), während wir im SH-H-Bereich keinen Unterschied zwischen Säuglingen und Müttern beobachteten (p = 0,8, Abb. 2C). Diese Ergebnisse stimmten in der Gruppe der Mütter und Säuglinge überein, die mit HIV lebten und HIV ausgesetzt waren (Tabelle S1) und beim Vergleich asymptomatischer Mütter und Säuglinge (Tabelle S2); Allerdings ging die Signifikanz für den FP-Vergleich verloren, wenn die Daten auf nicht exponierte Säuglinge im Vergleich zu nicht HIV-infizierten Müttern oder symptomatische Säuglinge im Vergleich zu Müttern aufgeteilt wurden, was wahrscheinlich auf die geringere Stichprobengröße bei der Stratifizierung zurückzuführen ist (N = 4 bzw. N = 3).

Unsere Phagen-DMS-Bibliothek enthielt Sequenzen mit allen möglichen Spike-Mutationen an der zentralen Position jedes Phagen-präsentierten Peptids, was es uns ermöglichte, den Einfluss von Mutationen auf die Antikörperbindung – d. h. die Fähigkeit einer mutierten Sequenz, der Bindung zu entgehen – bei Säuglingen zu beurteilen und Mütter. Um den Einfluss einer bestimmten Mutation auf die Antikörperbindung zu berechnen, verwendeten wir eine zuvor definierte Metrik mit der Bezeichnung „skalierte differenzielle Selektion“, definiert als die logarithmische Änderung der Antikörperbindungsanreicherung an der mutierten Sequenz dividiert durch die Wildtyp-Sequenz zu einem bestimmten Zeitpunkt Aminosäureposition (siehe Methoden)39. Mutationen, die zu einem Verlust der Antikörperbindung im Vergleich zur Wildtyp-Sequenz führen, führen zu einem negativ skalierten differenziellen Selektionswert und Mutationen, die zu einer Verstärkung der Antikörperbindung führen, führen zu einem positiv skalierten differenziellen Selektionswert. Mit dieser Methode haben wir eine skalierte Differenzialselektion für alle möglichen Spike-Mutationen bei Säuglingen und Müttern berechnet. Da in unserer vorherigen Analyse die Anreicherung von Wildtyp-Antikörpern bei Säuglingen und Müttern auf das FP und SH-H der S2-Untereinheit beschränkt war, konzentrierten wir unsere Aufmerksamkeit für weitere Analysen auf diese Regionen.

Bei Säuglingen führte eine Kerngruppe von Mutationen zu einem Entweichen der Antikörperbindung, das sich um die Reste 814–819 drehte und die durch die S2'-Transmembranproteasestelle 2 (TMPRSS2) vermittelte Spaltungsstelle überspannte45, wobei bei einigen Säuglingen das Entweichen stromabwärts dieses Fensters weniger ausgeprägt war (Abb . 3A). Säuglinge schienen sehr konsistente Fluchtprofile zu haben, was darauf hindeutet, dass Säuglinge möglicherweise eine konvergente und/oder weniger differenzierte Immunantwort auf das FP entwickeln. Es gab eine größere Variabilität in den Fluchtprofilen zwischen einzelnen Müttern als zwischen einzelnen Säuglingen, aber die Reste 813–820, die die bei Säuglingen beobachteten Kernpositionen umfassen, waren häufige Fluchtorte bei Müttern. Wir beobachteten jedoch bei Säuglingen eine ausgeprägtere unterschiedliche Selektion an den Resten 814 und 816–818 als bei Müttern (Abb. 3B und S5). Es gab auch einige Positionen direkt vor oder nach dieser Kernsequenz, die bei einigen Müttern für die Flucht ausgewählt wurden, insbesondere um die Positionen 810 und 825–830. Darüber hinaus beobachteten wir Variabilität beim Vergleich der Fluchtprofile von Müttern direkt mit ihrem Kind in der FP-Region (Abb. 3A, B, gestrichelte Linien zeigen Paarungen zwischen Kind und Mutter).

Fluchtprofile eines einzelnen Säuglings (N = 10) in der FP-Region (oben), summierte skalierte differenzielle Auswahl an jeder Position über alle Säuglingsprofile hinweg (unten). B Einzelne Escape-Profile der Mutter (N = 35) in der FP-Region (oben), summierte skalierte differenzielle Selektion an jeder Aminosäureposition über alle Mutterprofile hinweg (unten). Gestrichelte Linien, die Fluchtprofile in (A) und B verbinden, stellen Mutter-Kind-Paare dar. C Durchschnittlicher Ähnlichkeitswert an jeder FP-Aminosäureposition für Säuglinge (lila) und Mütter (blau). D Paarweise Ähnlichkeitswerte in der gesamten FP-Region bei Säuglingen (lila, N = 45 Säugling-Säugling-Paare), bei Müttern (blau, N = 595 Mutter-Mutter-Paare) und bei Säugling-Mutter-Paaren (gelb, N = 9 Paare). Die summierten skalierten differenziellen Selektionswerte für Mütter (B, unteres Feld) umfassen Daten aller Mütter (siehe zusätzliche Logo-Diagramme in Abb. S5). Boxplots zeigen die mittlere Mittellinie und 25/75-Perzentile. Whisker zeigen Min- und Max-Werte an.

Um quantitativ zu bewerten, ob Fluchtprofile bei Säuglingen konsistenter waren als bei Müttern, verwendeten wir eine zuvor beschriebene Methode zur Berechnung der Fluchtähnlichkeitswerte zwischen zwei Fluchtprofilen46. Dieser Ansatz ähnelt einer optimalen Transportberechnung, bei der die Ähnlichkeit der Aminosäuren die „Kosten“ bestimmt, die mit dem Übergang von einem Escape-Profil zum nächsten verbunden sind (siehe Methoden). Mit dieser Methode berechneten wir Escape-Ähnlichkeitswerte an jeder Aminosäureposition in der FP-Region und stellten fest, dass Säuglinge an mehreren Resten innerhalb des Epitops höhere Werte aufwiesen (Abb. 3C). Interessanterweise waren die mittleren Ähnlichkeitswerte für jeden paarweisen Säugling-Säugling-Vergleich höher als die Säugling-Mutter-Ähnlichkeitswerte, was darauf hindeutet, dass es innerhalb der Säuglingsgruppe mehr Konsistenz gab als innerhalb der Mutter-Kind-Paare (Abb. 3D).

Wie beim FP führten mehrere Mutationen zu einer Abnahme der Antikörperbindung im SH-H-Epitop sowohl bei Säuglingen als auch bei Müttern, aber das Escape-Profil umfasste einen größeren Bereich von Aminosäuren als in der FP-Region beobachtet (Abb. 4A, B und S6). ). Bei Säuglingen führten Mutationen der Aminosäure 1152 zu der negativsten medianen summierten Differenzialselektion, was darauf hindeutet, dass sie häufig für die Antikörperbindung an SH-H erforderlich ist (Abb. 4A). Umgekehrt führten Mutationen am Rest 1149 am häufigsten zu einem Entweichen der Antikörperbindung bei Müttern, was darauf hindeutet, dass Plasmaantikörper bei Säuglingen und Müttern im Grad der Bindungsempfindlichkeit gegenüber bestimmten Mutationen variieren (Abb. 4B und S6). Darüber hinaus stellten wir fest, dass die Säuglinge an mehreren Positionen im SH-H ähnlichere Fluchtprofile hatten als die Mütter (Abb. 4C) und dass sich die mittleren paarweisen Ähnlichkeitswerte zwischen Säugling und Säugling, Säugling und Mutter und Mutter und Mutter unterschieden, wenn auch zu a geringeres Ausmaß im Vergleich zur FP-Region (Abb. 4D).

Fluchtprofile eines einzelnen Säuglings (N = 10) in der SH-H-Region (oben), summierte skalierte differenzielle Auswahl an jeder Aminosäureposition über alle Säuglingsprofile hinweg (unten). B Einzelne Fluchtprofile der Mutter (N = 35) in der FP-Region (oben), summierte skalierte differenzielle Auswahl an jeder Position über alle Mutterprofile hinweg (unten). Die gestrichelten Linien, die die Fluchtprofile in (A) und (B) verbinden, stellen Mutter-Kind-Paare dar. C Durchschnittlicher Ähnlichkeitswert an jeder SH-H-Aminosäureposition für Säuglinge (lila) und Mütter (blau). D Paarweise Ähnlichkeitswerte über SH-H bei Säuglingen (lila, N = 45 Säugling-Säugling-Paare), bei Müttern (blau, N = 595 Mutter-Mutter-Paare) und bei Säugling-Mutter-Paaren (gelb, N = 9 Paare) . Die summierten skalierten differenziellen Selektionswerte für Mütter (B, unteres Feld) umfassen Daten aller Mütter (siehe zusätzliche Logo-Diagramme in Abb. S6). Boxplots zeigen die mittlere Mittellinie und 25/75-Perzentile. Whisker zeigen Min- und Max-Werte an.

Wir stellten die Hypothese auf, dass höhere Antikörperbindungsniveaus gegen Spike, RBD, NTD und FP in voller Länge bei Säuglingen mit einer erhöhten funktionellen Antikörperaktivität, einschließlich Neutralisierung und/oder ADCC, korrelieren könnten. Wir haben daher Plasma in einem Spike-pseudotypisierten lentiviralen Neutralisationstest getestet47,48. Mütter, die mit HIV leben, und HIV-exponierte Säuglinge wurden von der Neutralisierungsanalyse ausgeschlossen, da ART in Plasmaproben vorhanden war, was eine Infektion im Test verhindern würde. Interessanterweise fanden wir keinen signifikanten Unterschied im Neutralisationstiter zwischen Müttern und Säuglingen in Analysen, die alle Mütter ohne HIV und nicht exponierte Säuglinge einschlossen (p = 0,9, Abb. 5A), noch bei gepaarten Müttern und Säuglingen (p = 0,7, Abb. 5B). , was darauf hindeutet, dass im Zusammenhang mit dieser begrenzten Probengröße höhere Spike-Antikörpertiter bei Säuglingen nicht direkt zu höheren Neutralisationsgraden führen. Darüber hinaus korrelierten die Neutralisationstiter bei gepoolten Säuglingen und Müttern nicht mit der durch MSD gemessenen Spike-Bindung (r = 0,3, p = 0,2, Abb. S7A), es bestand jedoch ein Zusammenhang mit der durch S-CEM-Oberflächenfärbung gemessenen Bindung (r = 0,5, p = 0,04, Abb. S7B).

50 % Neutralisationstiter (NT50) gegen Wuhan-Hu-1 S-pseudotypisierte lentivirale Partikel in A aller Säuglinge (lila, N = 6) und Müttern (blau, N = 15) und B übereinstimmenden Mutter-Kind-Paaren (N = 6) . Die Neutralisationsaktivität wurde zweifach oder dreifach gemessen. Plasma-ADCC-Aktivität bei C aller Säuglinge (N = 10) und Müttern (N = 35) und bei D übereinstimmenden Mutter-Kind-Paaren (N = 9). Die Plasma-ADCC-Aktivität wurde dreifach gemessen. Boxplots zeigen die mittlere Mittellinie und 25/75-Perzentile. Whisker zeigen Min- und Max-Werte an. P-Werte werden über jedem Vergleich angezeigt. Unübertroffene Vergleiche: zweiseitiger Wilcoxon-Rangsummentest; Matched-Vergleiche: Zweiseitiger Wilcoxon-Matched-Pair-Vorzeichen-Rang-Test.

Um zu testen, ob es Unterschiede in der ADCC-Aktivität zwischen Müttern und Säuglingen gab, verwendeten wir einen etablierten durchflusszytometrischen Zelltest, der den ADCC-Spiegel misst, wenn S-CEM-Zellen sowohl Plasma als auch mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) von gesunden Menschen ausgesetzt werden Individuen als Effektorzellen (Abb. S8)49,50. Säuglinge hatten im Gesamtvergleich eine signifikant höhere ADCC-Aktivität als Mütter (P = 0,002, Abb. 5C), und die Aktivität blieb bei Säuglingen bei der Stratifizierung nach HIV-Status (Tabelle S1) oder beim Vergleich asymptomatischer Mütter und Säuglinge (Tabelle S2) signifikant erhöht. . Als wir nur Säuglings-Mutter-Paare verglichen, wodurch sich die Gesamtzahl der Teilnehmer auf eine ähnliche Anzahl von Personen reduzierte, die im Neutralisationstest getestet wurden, blieben die Werte der ADCC-Aktivität bei Säuglingen signifikant höher als bei Müttern (P = 0,008, Abb. 5D). Dies deutet darauf hin, dass Säuglinge und Mütter unterschiedliche Grade der funktionellen Aktivität von SARS-CoV-2-Antikörpern aufweisen.

Bei allen Teilnehmern war die ADCC-Aktivität mit Spike-, RBD- und NTD-Antikörperbindung durch MSD verbunden (r = 0,7, p = <0,0001; r = 0,6, p = <0,0001; r = 0,6, p = <0,0001, Abb . S7C–E) und S-CEM-Zelloberflächenfärbung (r = 0,9, p < 0,0001, Abb. S7F). Die ADCC-Aktivität korrelierte nicht mit dem Neutralisationstiter, was die Unterschiede in der Antikörperfunktion in diesen Plasmaproben hervorhebt (r = 0,2, p = 0,4, Abb. S7G). Darüber hinaus war die ADCC-Aktivität mäßig mit der summierten FP-Anreicherung (r = 0,5, p = 0,0005, Abb. S7H) assoziiert, nicht jedoch mit der summierten SH-H-Anreicherung (r = 0,2, p = 0,2, Abb. S7I) bei aggregierten Säuglingen und deren Kindern Mütter, was auf eine mögliche Rolle von FP-Antikörpern bei der Vermittlung der ADCC-Aktivität schließen lässt.

Die Antikörperreaktionen auf Virusinfektionen und Impfungen können bei Säuglingen und Erwachsenen unterschiedlich sein. Studien zur Bindung und funktionellen Antikörperreaktionen auf SARS-CoV-2 bei Säuglingen sind jedoch selten, ebenso wie direkte Vergleiche zwischen Säuglingen und Erwachsenen im Zusammenhang mit einer SARS-CoV-2-Infektion. Das Verständnis dieser Unterschiede könnte die Bemühungen zur Behandlung und Prävention von COVID-19 im gesamten Altersspektrum beeinflussen. In dieser Studie beobachteten wir signifikante Unterschiede in der Antikörperbindung und funktionellen Aktivität im Plasma von SARS-CoV-2-seropositiven Frauen und ihren Säuglingen innerhalb einer einzigen Kohorte. Bemerkenswerterweise hatten Säuglinge höhere Werte an ADCC und Spike-bindenden Antikörpern, jedoch keine neutralisierenden Antikörper. Wir beobachteten auch Unterschiede in den Fluchtmustern für Säuglingsantikörper, die auf das FP-Epitop abzielen, im Vergleich zu Müttern.

Die ADCC-Aktivität war bei Säuglingen deutlich höher als bei Müttern, was darauf hindeutet, dass Säuglinge während einer SARS-CoV-2-Infektion entweder häufiger ADCC-Antikörper oder Antikörper mit höherer ADCC-Wirksamkeit entwickeln. Die ADCC-Aktivität wurde mit dem Schutz vor SARS-CoV-227,29,51 und anderen Viren, einschließlich HIV31,32,33,34, in Verbindung gebracht. Ob die bei Säuglingen beobachteten höheren ADCC-Werte zum Schutz oder zu anderen Aspekten der Pathogenese beitragen, ist ein wichtiger Bereich für zukünftige Untersuchungen.

Säuglinge wiesen nicht nur ein höheres Maß an Spike-spezifischer ADCC-Aktivität auf, sondern zeigten auch ein höheres Maß an Antikörperbindung an das SARS-CoV-2-Spike-Protein voller Länge als Mütter. Säuglinge hatten auch höhere Antikörperspiegel gegen RBD, NTD und FP, jedoch nicht gegen Nukleokapsid oder SH-H, was auf eine häufigere oder hochaffine humorale Immunantwort auf bestimmte Spike-Subdomänen bei Säuglingen schließen lässt. Die Beobachtung, dass die IgG-Titer gegen Nukleokapsid und SH-H in dieser Studie bei Säuglingen und Erwachsenen gleich waren, legt nahe, dass die stärkeren Reaktionen bei Säuglingen auf andere Domänen nicht einfach durch höhere B-Lymphozyten-Gesamtwerte bei Säuglingen im Vergleich zu Erwachsenen erklärt werden können52. Frühere Studien haben in pädiatrischen Kohorten im Vergleich zu Erwachsenen niedrigere53, höhere22,24 oder gleichwertige23,25 Niveaus der Antikörperbindung an Spike oder seine Subdomänen festgestellt. Ein möglicher Grund für diese Abweichung ist die Einbeziehung von Kindern aus einem breiten Altersbereich in früheren Studien, während sich diese Studie speziell auf Säuglinge (unter 19 Monaten) konzentrierte und die Proben im Rahmen einer einzigen Kohortenstudie gesammelt wurden35. Bemerkenswert ist, dass trotz berichteter Unterschiede in der Entwicklung von B-Zell-Reaktionen bei Menschen mit HIV54 die bei Säuglingen beobachtete Antikörperbindung und funktionelle Reaktionen nach der Stratifizierung nach HIV-Status im Allgemeinen signifikant erhöht blieben.

Unsere Epitopkartierungsexperimente zeigten, dass die Bindung von Antikörpern an Wildtyp-Peptide sowohl bei Säuglingen als auch bei Müttern in den FP- und SH-H-Regionen häufig war, wobei bei Säuglingen erhöhte Reaktionen auf FP auftraten. Darüber hinaus waren die Antikörper-Escape-Profile bei Säuglingen ähnlicher als bei Erwachsenen, insbesondere in der FP-Region. Die FP-Escape-Profile waren bei Säugling-Säugling-Paarungen ähnlicher als bei Säuglingen, die mit ihren Müttern gepaart wurden, was darauf hindeutet, dass das Alter ein wichtigerer Indikator für Antikörper-Escape-Wege sein könnte als die spezifische Genetik der Immunantwort bei einem Individuum. Insgesamt deuten diese Ergebnisse auf eine konvergente Immunantwort auf FP bei Säuglingen hin und können darauf hinweisen, dass sich die FP-Antikörperlinien bei Säuglingen anders entwickeln als bei Erwachsenen. Angesichts der robusteren Reaktion auf FP bei Säuglingen und der erhöhten ADCC-Spiegel bei Säuglingen kann es aufschlussreich sein, FP-spezifische monoklonale Antikörper von Säuglingen zu isolieren und in zukünftigen Studien zu beurteilen, ob sie über Fc-vermittelte Effektorfunktionen verfügen.

Obwohl wir bei Säuglingen eine erhöhte Spike-Protein- und RBD-Antikörperbindung beobachteten und RBD das Hauptziel neutralisierender Antikörper gegen SARS-CoV-215 ist, waren die Neutralisationstiter interessanterweise bei Säuglingen und Müttern ähnlich. Studien zum Vergleich der Neutralisierungsaktivität bei Säuglingen und Erwachsenen sind selten, und wie bei Studien zur SARS-CoV-2-Spike-Antikörperbindung gibt es bei den Analysen der SARS-CoV-2-Neutralisierung bei Kindern und Erwachsenen in verschiedenen Kohorten Unterschiede. Eine sehr kleine Studie mit Säuglingen (< 3 Monate alt, N = 4) und ihren Eltern berichtete über einen leichten Anstieg der neutralisierenden Antikörpertiter bei Säuglingen25, und eine andere Studie (0–4 Jahre alt, N = 15) ergab einen zweifachen Anstieg höhere Neutralisationsgrade bei Säuglingen22. In einer Studie mit älteren Kindern im Alter von 3–11 Jahren im Vergleich zu Erwachsenen war die Neutralisierung vergleichbar mit dem ursprünglichen Wuhan-Hu-1 SARS-CoV-2 und mehreren besorgniserregenden Varianten21.

Mehrere Faktoren können zu Konflikten bei der gemeldeten Antikörperbindungs- und Neutralisierungsaktivität zwischen pädiatrischen Kohorten und Erwachsenen beitragen. Unterschiede in der Bindungs- und Neutralisationsassay-Methodik könnten zur Variabilität von Studie zu Studie sowie zu Variationen im mittleren Kohortenalter, der Immungeschichte und dem Probenzeitpunkt in Bezug auf die Infektion beitragen, die von Studie zu Studie unterschiedlich sind. Während Säuglingen und Müttern in dieser Studie innerhalb eines definierten Zeitfensters in Abständen von etwa drei Monaten Proben entnommen wurden, kann es in diesem Zeitraum zu einem Abfall der Antikörpertiter kommen55. Allerdings ist die Variation aufgrund des Verfalls bei Säuglingen und Müttern wahrscheinlich ähnlich, da zwischen den beiden Gruppen kein signifikanter Unterschied in der geschätzten Zeit seit der Infektion bestand. Darüber hinaus wurde in einer früheren Studie festgestellt, dass die Raten des Antikörperabbaus bei Müttern und Säuglingen in dieser Kohorte ähnlich sind35.

Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass sich die Bindung von SARS-CoV-2-Plasmaantikörpern, die Fluchtwege und die Funktionsfähigkeit zwischen Säuglingen und Erwachsenen, die mit SARS-CoV-2 infiziert sind, unterscheiden. Die mechanistischen Treiber dieser Unterschiede sind wahrscheinlich komplex und könnten Unterschiede im Immunentwicklungsstadium, unterschiedliche Pathogenexpositionshistorien und mögliche Unterschiede in der Viruslast bei Säuglingen und Müttern umfassen, die in zukünftigen Arbeiten untersucht werden sollten. Diese Studie wirft auch die Frage auf, ob es analoge Unterschiede in der Reaktion auf die Impfung bei Säuglingen gibt. Insgesamt sollte die Feststellung, dass Säuglinge im Vergleich zu Erwachsenen ein höheres Maß an Bindungs- und ADCC-Antikörpern entwickeln, die Bewertung dieser Aktivitäten in der Pathogenese motivieren, insbesondere in Kohorten mit einem breiteren Spektrum an Krankheitsschweregraden, angesichts der dokumentierten altersbedingten Unterschiede im Schweregrad von COVID-196,7 ,8 und bietet eine wichtige Grundlage für die Bewertung und Entwicklung von auf Impfstoffen und Antikörpern basierenden Therapieoptionen für das gesamte Altersspektrum.

Mutter-Kind-Paare, die in einer bestehenden prospektiven Kohorte zur Mutter-Kind-Viromübertragung in Nairobi, Kenia (der Linda-Kizazi-Studie), eingeschrieben waren, gaben eine schriftliche Einverständniserklärung zur Teilnahme an der Elternkohortenstudie ab, die die Entnahme von Blutproben und immunologische Studien umfasste; Für SARS-CoV-2-Tests wurde eine zusätzliche schriftliche Einverständniserklärung eingeholt. Mütter und Säuglinge nahmen etwa alle drei Monate an Klinikbesuchen teil, bei denen klinische Daten und Proben, einschließlich Blut, gesammelt wurden. Die ersten SARS-CoV-2-seropositiven Plasmaproben von Müttern (N = 36) und Säuglingen (N = 14), die zwischen April 2019 und Dezember 2020 auf der Grundlage eines Nucleocapsid-ELISA zu SARS-CoV-2 serokonvertierten, wie in Lit. berichtet. 35, wurden in diese Studie einbezogen. Die geschätzte Zeit seit der Infektion wurde als Mittelwert zwischen der letzten seronegativen Probe und der ersten seropositiven Probe berechnet, es sei denn, die letzte negative Probe stammte vor dem 1. Mai 2020 (den wir als Schätzung für den Beginn des Risikozeitraums für SARS-CoV verwenden). 2-Infektion in Kenia), wobei in diesem Fall der 1. Mai 2020 als Datum der letzten seronegativen Probe verwendet wurde. Das Geschlecht der Säuglinge wurde erfasst, aber aufgrund der begrenzten Teilnehmerzahl im Studiendesign nicht berücksichtigt. Das Ethik- und Forschungskomitee des Kenyatta National Hospital-University of Nairobi (P472/07/2018), das CHUM Research Center sowie die Institutional Review Boards der University of Washington und des Fred Hutchinson Cancer Center (STUDY00004006) genehmigten alle Studienverfahren für menschliche Teilnehmer.

Die Konzentrationen von SARS-CoV-2 Spike-, RBD-, NTD- und Nukleokapsid-IgG-Antikörpern wurden mithilfe eines kommerziell erhältlichen Multiplex-Chemilumineszenz-Bindungstests (V-PLEX COVID-19 Coronavirus Panel 2 (IgG) Kit, Kat.-Nr. K15369U-2, Mesoscale) nachgewiesen Diagnostik, MSD). Plasmaproben wurden 60 Minuten lang bei 56 °C hitzeinaktiviert und gemäß den Anweisungen des Herstellers 1:5000 verdünnt. Verdünnte Proben sowie vom Hersteller bereitgestellte Kalibrator- und Kontrollproben wurden auf blockierte 96-Well-Testplatten aufgetragen und 2 Stunden lang bei Raumtemperatur (RT) inkubiert. Die Platten wurden gewaschen und 1 Stunde lang mit Detektionsantikörper inkubiert. Nach der Zugabe von MSD GOLD Read Buffer B wurden die Platten sofort auf dem MESO QuickPlex SQ 120MM-Instrument, das mit der Methodical Mind-Software (Mesoscale Diagnostics) verbunden war, unter Verwendung von Standardparametern ausgelesen. Rohdaten wurden in der Discovery Workbench-Softwareversion 4.0 (Mesoscale Diagnostics) verarbeitet. Die Probenintensität wurde auf der Grundlage der im Assay-Kit enthaltenen Kalibrator-Standardkurve als Teil des Discovery Workbench-Workflows in willkürliche Einheiten/ml (AU/ml) umgerechnet. Die Antikörperkonzentrationen für alle SARS-CoV-2-Antigene lagen über den berechneten unteren Nachweisgrenzen. Wie bereits erwähnt, wurden in die Studie nur Proben einbezogen, die im SARS-CoV-2-Nukleokapsid-ELISA positiv waren. Darüber hinaus wurde für jedes SARS-CoV-2-Antigen im MSD-Test ein Positivitätsschwellenwert innerhalb des Tests festgelegt, indem der mittlere AU/ml plus drei Standardabweichungen über dem Mittelwert in einer Population von 18 Proben aus der Zeit vor der Pandemie gemessen wurde, die im Rahmen von gesammelt wurden die Linda Kizazi-Studie56. Messungen in der experimentellen (SARS-CoV-2-positiven) Population, die diesen Schwellenwert unterschritten, wurden auf den Mittelpunkt zwischen Null und dem Schwellenwert gesetzt.

CEM.NKr CCR5-Zellen (Elternzellen) stammten ursprünglich aus dem HIV Reagent Program (Kat.-Nr. 4376) und wurden durch STR-Profiling authentifiziert. CEM.NKr CCR5-Spike-Zellen (Wuhan-Hu-1-Isolat, S-CEM) wurden von CEM.NKr CCR5-Zellen abgeleitet und die Spike-Expression wurde durch Zelloberflächenfärbung und Durchflusszytometrie bestätigt49. Etwa 300.000 Eltern- oder S-CEM-Zellen wurden 45 Minuten lang bei RT mit Plasma (1:500 Endverdünnung) oder Kontroll-mAbs (1 µg/ml Endkonzentration) gefärbt. Die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und 100 μl Ziegen-Anti-Human-IgG (H + L) Alexa647-Sekundärantikörper (2 μg/ml, Invitrogen #A-21445) und Aqua-Lebensfähigkeitsfarbstoff (Thermo Fisher Scientific, Kat.-Nr. L34957) wurden zugegeben für 20 Min. bei RT. Nach der Färbung wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und mit 2 % Formaldehyd in PBS fixiert. Die Zellen wurden auf einem LSRII-Instrument (BD Biosciences) erfasst, wobei pro Probe 10.000 Lebendzellereignisse aufgezeichnet wurden. Die Gating-Strategie für die Zelloberflächenfärbung ist in Abb. S3 dargestellt. Die Zellen wurden anhand der Zellmorphologie anhand von Lichtstreuungsparametern und unter Ausschluss von Dublettzellen identifiziert. Abgestorbene Zellen (AquaHigh) wurden dann ausgeschlossen. Schließlich wurden die GFP+-Zellen zum Nachweis und zur Messung der im Plasma vorhandenen Spike-spezifischen Antikörper verwendet. Die Datenanalyse wurde mit FlowJo v10.7.1 (TreeStar) durchgeführt. Die Spike-spezifische Oberflächenantikörperfärbung wurde definiert als: (Alexa647 MFI von lebenden GFP+ S-exprimierenden Zellen + Plasma/Antikörper) – (Ax647 MFI von lebenden GFP-Elternzellen + Plasma/Antikörper). Der Mittelwert der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) von SARS-CoV-2-seronegativen Plasmaproben plus drei Standardabweichungen wurde als Positivitätsschwellenwert verwendet und Färbungsmessungen unterhalb dieses Schwellenwerts wurden auf den Mittelpunkt zwischen Null und dem Schwellenwert festgelegt.

Die Zusammensetzung, Vorbereitung und Verwendung der in dieser Studie verwendeten T7-Phagen-Display-Bibliothek wurde zuvor in Lit. beschrieben. 13,40. Um Plasmaproben zu untersuchen, wurde die Phagenbibliothek mit Phagenextraktionspuffer (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl, 6 mM MgSO4) auf 4,96 × 109 Plaque-bildende Einheiten/ml verdünnt, was dem etwa 200.000-fachen entspricht Darstellung aller 24.820 in der Bibliothek enthaltenen Peptide. Ein ml der verdünnten Bibliothek wurde mit 10 μl hitzeinaktiviertem Plasma (56 °C für 60 Minuten) inkubiert und über Nacht in 1,1 ml tiefen 96-Well-Platten (Costar) bei 4 °C unter Schütteln inkubiert. Eine 1:1-Mischung aus Protein A- und Protein G-Dynabeads (Invitrogen) wurde hergestellt und 40 μl der Mischung in jede Vertiefung gegeben. Die Platte wurde erneut 4 Stunden lang unter Schütteln bei 4 °C inkubiert. An Antikörper-Phagen-Komplexe gebundene Dynabeads wurden mit einem Magneten isoliert, dreimal mit 400 μl Waschpuffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 0,1 % (v/v) NP-40, pH 7,5) gewaschen und darin resuspendiert 40 μL Wasser. Gebundene Phagenpartikel wurden durch 10-minütige Inkubation resuspendierter Proben bei 95 °C lysiert. Um die Starthäufigkeiten der Peptide in der Bibliothek zu bewerten, wurde parallel auch die ursprüngliche verdünnte Phagenbibliothek (nicht mit Plasma inkubiert) lysiert. Plasmaproben wurden an verschiedenen Tagen in technischen Duplikaten getestet.

Phagen-DNA wurde zwei PCR-Runden unter Verwendung von Q5 High-Fidelity 2X Mastermix (NEB) unterzogen. In der ersten Runde wurden 10 μl des lysierten Phagen als Matrize mit den Primern R1_FWD (TCGTCGGCAGCGTCTCCAGTCAGGTGTGATGCTC) und R1_REV (GTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGCAAGACCCGTTTAGAGGCCC) in einem Reaktionsvolumen von 25 μl verwendet. Für die zweite PCR-Runde wurden 2 μl der Reaktion der ersten Runde zu den eindeutigen doppelt indizierten Barcode-Primern R2_FWD (AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACxxxxxxxxTCGTCGGCAGCGTCTCCAGTC) und R2_REV (CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATxxxxxxxxGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG) hinzugefügt, wobei „xxxxxxx“ einer eindeutigen 8-nt-Indizierung entsprach Reihenfolge. Die Produkte wurden mit dem Quant-iT Pico Green Kit (Thermo Fisher) gemäß den Anweisungen des Herstellers quantifiziert. Die Proben wurden in äquimolaren Mengen gepoolt und die Eingangsprobe der Bibliothek wurde mit einem zehnfachen molaren Überschuss hinzugefügt. Der endgültige Pool wurde gelgereinigt, mit dem KAPA Library Quantification Kit (Roche) quantifiziert und zur Sequenzierung auf einem Illumina HiSeq unter Verwendung von 125 Basenpaar-Single-End-Reads eingereicht.

Das Phippery-Software-Framework (https://matsengrp.github.io/phippery/) wurde zur Analyse von Phagen-DMS-Sequenzierungsdaten verwendet. Zunächst wurden Probenlesevorgänge in einer Nextflow57-Pipeline zu Peptidzahlen verarbeitet, die Bowtie2, v2.4.258, für das Short-Read-Alignment und Samtools, v1.359, zum Sammeln von Sequenzierungsstatistiken verwendet. Die Peptidzahlen aller Proben wurden in einem Xarray-Datensatz v0.16.160 gesammelt, wobei Proben- und Peptidmetadaten mit ihrer jeweiligen Zahl zusammengeführt wurden. Die Peptidanreicherung und die differenzielle Auswahl wurden mithilfe von Python-Modulen (v3.6.12) berechnet, die in Phippery bereitgestellt werden.

Der Vergleich der Fluchtprofile wurde wie zuvor in Lit. beschrieben durchgeführt. 46. Weitere Details finden Sie unter https://matsengrp.github.io/phippery/esc-prof.html.

Pseudoviren, die das SARS-CoV-2-Spike-Protein exprimieren, wurden mit etablierten Methoden hergestellt und titriert47. HEK293T-Zellen wurden von ATCC (Kat.-Nr. CRL-3216) erhalten und durch STR-Profiling authentifiziert. HEK293T-Zellen wurden mit einer Dichte von 5 × 105 Zellen pro Vertiefung in vollständigem DMEM (10 % fötales Rinderserum, 2 mM L-Glutamin und Penicillin/Streptomycin/Fungizon) in Schalen mit sechs Vertiefungen ausgesät. Nach 16–23 Stunden wurden die Zellen unter Verwendung von FuGene-6 (Promega #E2692) mit den folgenden Konstrukten transfiziert: dem Luciferase_IRES_ZsGreen-Rückgrat, den lentiviralen Helferplasmiden Gag/Pol, Rev und Tat und dem Plasmid HDM_Spikedelta21, das die Codon-optimierte Spike-Sequenz von enthält der Wuhan-Hu-1-Stamm und eine Deletion von 21 Aminosäuren im zytoplasmatischen Schwanz36. Nach 25 Stunden wurde das Medium durch frisches komplettes DMEM ersetzt. 50–60 Stunden nach der Transfektion wurden Virusüberstände gesammelt, durch 0,22-μm-Steriflip-Filter filtriert, konzentriert und bei –80 °C gelagert. Um das Pseudovirus zu titrieren, wurden 1,25 × 104 HEK293T-ACE2-Zellen in schwarzwandige Platten mit 96 Vertiefungen ausgesät, und 16–24 Stunden später wurden 100 μl seriell verdünnter viraler Überstand pro Vertiefung in zweifacher Ausfertigung zugegeben. Positive und negative Kontrollvertiefungen für VSV-G und kein virales Eintrittsprotein (VEP) waren enthalten. Nach 60 Stunden wurden 100 μl Überstand aus jeder Vertiefung entfernt und 30 μl Bright-Glo (Promega #E2620) hinzugefügt. Relative Luciferase-Einheiten wurden mit einem LUMIstar Omega-Plattenlesegerät (BMG Labtech) gemessen, das mit Omega-Software (v5.50 R4) ausgestattet war. HEK293T-ACE2-Zellen wurden freundlicherweise von Dr. Jesse Bloom zur Verfügung gestellt, und die ACE2-Expression wurde zuvor mit polyklonalem Anti-Human-ACE2-Ziegen-IgG47 bestätigt.

SARS-CoV-2-Spike-pseudotypisierte lentivirale Neutralisationstests wurden in einem 384-Well-Plattenformat durchgeführt, wie zuvor in Lit. beschrieben. 48. Kurz gesagt, schwarzwandige, mit Poly-L-Lysin beschichtete 384-Well-Platten mit klarem Boden (Thermo Scientific #142761) wurden mit 3,75 × 103 HEK293T-ACE2-Zellen (BEI Resources, NR-52511) pro Well in 30 beimpft μL komplettes DMEM. Nach 12–16 Stunden wurden die Plasmaproben in vollständigem DMEM beginnend bei 1:20 seriell dreifach verdünnt, also insgesamt sechs Verdünnungen. Pseudotypisierte lentivirale Spike-Δ21-Partikel wurden 1:5 verdünnt und in gleichem Volumen zu verdünnten Plasmaproben gegeben. Pseudovirus und Plasma wurden 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert und 30 μl der Virus-Plasma-Proben wurden zu den Zellen gegeben. Als Negativkontrollen wurden plasmafreie Vertiefungen einbezogen, die nur Viren und Zellen enthielten.

Nach 55 Stunden wurde die Luciferase-Aktivität mit dem Bright-Glo Luciferase Assay System (Promega E2610) auf einem LUMIstar Omega-Plattenlesegerät (BMG Labtech) gemessen, das mit Omega-Software (v5.50 R4) ausgestattet war. Die Infektiosität der Fraktionen wurde berechnet, indem der mittlere RLU-Wert jeder Plasmaverdünnungsprobe durch den Mittelwert der plasmafreien (nur Virus plus Zellen) Vertiefungen dividiert wurde. Die Plasmaverdünnung, die die Infektion um 50 % hemmte (IC50), wurde in Prism berechnet, indem die Infektiosität der Fraktionen an eine Hill-Kurve angepasst wurde, wobei der untere und obere Wert auf 0 bzw. 1 und der IC50 auf > 0 beschränkt waren. Der NT50-Wert für jede Plasmaprobe wurde als Kehrwert des IC50-Werts berechnet. Plasmaproben mit nicht nachweisbarer Neutralisationsaktivität wurde ein NT50-Wert von 20 zugewiesen, was die Untergrenze der Plasmaverdünnungsreihe darstellte.

Alle Proben wurden im technischen Duplikat untersucht und zusätzliche Replika-Experimente wurden unter Verwendung separat transfizierter Pseudoviren und frisch aufgetauter Zellen durchgeführt. Wenn zwischen den NT50-Werten zweier Replikate ein mehr als dreifacher Unterschied bestand, schlossen wir diese Plasmaprobe in eine dritte Replik ein, mit Ausnahme einer alleinerziehenden Mutter, für die die Probe nicht verfügbar war. Daher handelt es sich bei den gemeldeten NT50-Werten um den Mittelwert von mindestens zwei oder drei Wiederholungen.

Die SARS-CoV-2 Spike-Glykoprotein-spezifische ADCC-Aktivität wurde gegen CEM.NKr CCR5+-Zellen gemessen, die GFP-markiertes S-Protein stabil exprimieren (Wuhan-Hu-1-Isolat, S-CEM-Zellen)49,50. S-exprimierende Zellen wurden im Verhältnis 1:1 mit CEM.NKr CCR5+-Elternzellen (HIV-Reagenzprogramm Nr. 4376) gemischt und die Zielzellmischung wurde mit Aqua Viability Dye (Thermo Fisher Scientific, Kat. Nr. L34957) und eBioScience eFluor670-Zellen markiert Proliferationsfarbstoff (Thermo Fisher Scientific, Kat.-Nr. 65-0840-85). Parallel dazu wurden PBMCs von gesunden, nicht infizierten erwachsenen Personen nach einer Ruhephase über Nacht mit dem Zellproliferationsfarbstoff eBioScience eFluor450 (Thermo Fisher Scientific, Kat.-Nr. 65-0842-85) markiert, um sie als Effektoren im Assay zu verwenden. In allen Wiederholungsexperimenten wurden PBMCs eines einzelnen Spenders verwendet. Markierte Ziel- und Effektorzellen wurden im Verhältnis 1:10 zu 96-Well-V-Bodenplatten hinzugefügt. Plasma (1:500 Endverdünnung) oder monoklonale Kontrollantikörper (1 µg/ml Endkonzentration) wurden in die entsprechenden Vertiefungen gegeben und die Vertiefungen wurden durch Auf- und Abpipettieren gemischt. Anschließend wurden die Platten 1 Minute lang bei 300 × g zentrifugiert, um die Zellen in eine enge Verbindung zu bringen. ADCC ließ man 5 Stunden lang bei 37 °C einwirken, danach wurden die Zellen in 2 % Formaldehyd in PBS fixiert. Die Zellen wurden auf einem LSRII-Instrument (BD Biosciences) mit der integrierten BD FACSDiva-Software (v6) erfasst, wobei pro Probe 10.000 Live-eFluor670+ eFluor450−-Zielzellereignisse aufgezeichnet wurden. Die Gating-Strategie für ADCC-Aktivitätsmessungen ist in Abb. S8 dargestellt. Zielzellen wurden anhand der Zellmorphologie anhand von Lichtstreuungsparametern und unter Ausschluss von Dubletts identifiziert. Die Zellen wurden dann auf eFluor670+-Zellen (mit Ausnahme der mit eFluor450 markierten Effektorzellen) gesteuert. Schließlich wurde der Prozentsatz der GFP+-Zielzellen zur Berechnung der ADCC-Aktivität verwendet. Die Datenanalyse wurde mit FlowJo v10.7.1 (TreeStar) durchgeführt. Die ADCC-Aktivität wurde unter Verwendung der folgenden Formel nach Gating auf Zielzellen berechnet: 100 × [(% GFP+-Zellen in Zielen plus Effektoren) – (% GFP+-Zellen in Zielen plus Effektoren plus Plasma/Antikörper)]/(% GFP+-Zellen in Zielen allein) . Die folgenden mAbs wurden als Positivkontrollen in jedes Experiment einbezogen: CR3022 (Abcam, Kat.-Nr. ab278112), CV3-1, CV3-13, CV3-25 und CV3-25 GASDALIE50. Als Negativkontrollen wurden der HIV-spezifische humane monoklonale Antikörper 17b (hausintern aus öffentlich verfügbaren Sequenzen hergestellt) und Plasma von fünf SARS-CoV-2-seronegativen Personen einbezogen. Der mittlere %ADCC von SARS-CoV-2-seronegativen Plasmaproben plus drei Standardabweichungen wurde als Positivitätsschwellenwert verwendet und ADCC-Messungen unterhalb dieses Schwellenwerts wurden auf den Mittelpunkt zwischen Null und dem Schwellenwert festgelegt.

Wilcoxon-Rangsummentests (auch bekannt als Mann-Whitney-U-Tests) oder Wilcoxon-Matched-Pairs-Rangtests mit Vorzeichen wurden in Prism (v9, Graphpad) durchgeführt. P-Werte für Bindungsdaten, die mit dem MSD-Immunoassay gesammelt wurden, für den mehrere Antigene gleichzeitig untersucht wurden, wurden für die Post-hoc-Testung mehrerer Hypothesen mit der Bonferroni-Methode korrigiert, was vier Hypothesen berücksichtigte. P-Werte <0,05 wurden als signifikant angesehen.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die in dieser Studie generierten unverarbeiteten Phagen-DMS-Sequenzierungsdaten wurden bei der SRA unter dem Zugangscode PRJNA872509 hinterlegt. Die in dieser Studie generierten Daten zur Antikörperbindung, Zelloberflächenfärbung, Neutralisierung und ADCC werden in der Quelldatendatei als Teil der Zusatzinformationen bereitgestellt. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Code für die Datenverarbeitung und Visualisierung nach Leseausrichtungen finden Sie unter https://github.com/ksung25/LK-SARS-CoV-2 und https://doi.org/10.5281/zenodo.8095491. Die Pipeline zur Ähnlichkeitsbewertung des Escape-Profils und die zugehörige Dokumentation finden Sie unter https://matsengrp.github.io/phippery/esc-prof.html.

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Wir danken dem Studienteam von Linda Kizazi für ihre Beiträge und insbesondere den teilnehmenden Müttern und ihren Säuglingen für die Bereitstellung von Proben. Wir danken den Kerneinrichtungen und Mitarbeitern für Genomik und Durchflusszytometrie im Fred Hutchinson Cancer Center für die Unterstützung bei der Datenerfassung. Wir danken den Mitgliedern der Labore Overbaugh und Matsen für hilfreiche Diskussionen und Ratschläge. Diese Arbeit wurde durch die NIH-Zuschüsse R01 AI138709 (PI Overbaugh) und R01 AI146028 (PI Matsen) unterstützt. Frederick Matsen ist Forscher am Howard Hughes Medical Institute und der Scientific Computing Infrastructure am Fred Hutchinson Cancer Center, finanziert durch den ORIP-Zuschuss S10OD028685. CIS ist Träger der NIH K99-Auszeichnung AI171000. ZAY ist Träger des NIH F30 Award AI165112. Die Arbeit im Finzi-Labor wurde durch ein CIHR-Stiftungsstipendium Nr. 352417, ein CIHR-Stipendium für die Forschung zu Pandemien und Gesundheitsnotfällen Nr. 177958 und einen Sonderfonds COVID-19 der Canada Foundation for Innovation (CFI) Nr. 41027 an AFAF unterstützt of Canada Research Chair on Retroviral Eintragsnr. RCHS0235 950-232424. GB-B. ist Empfänger eines FRQS-Doktorandenstipendiums. Die Kohortenstudie von Linda Kizazi wurde durch Zuschüsse der Canadian Institutes of Health Research (COVID-19 May 2020 Rapid Research Funding Opportunity Operating Grant 202005, Project Grant 201709 an SG) und der US National Institutes of Health (Zuschussnummern R01HD092311 an DAL und) unterstützt R00DK107923 bis ESL). Das folgende Reagenz wurde über das NIH HIV Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH erhalten: CEM.NKR CCR5+ Cells, ARP-4376, bereitgestellt von Dr. Alexandra Trkola.

Diese Autoren haben diese Arbeit gemeinsam betreut: Dara A. Lehman, Julie Overbaugh.

Abteilung für Humanbiologie, Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle, WA, USA

Caitlin I. Stoddard, Zak A. Yaffe, Haidyn Weight, Dara A. Lehman und Julie Overbaugh

Abteilung für öffentliche Gesundheitswissenschaften, Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle, WA, USA

Kevin Sung, Jared Galloway, Frederick A. Matsen IV und Julie Overbaugh

Ausbildungsprogramm für medizinische Wissenschaftler, University of Washington, Seattle, WA, USA

Zak A. Yaffe

CHUM Research Center, Universität Montreal, Montreal, QC, Kanada

Guillaume Beaudoin-Bussières & Andrés Finzi

Abteilung für Mikrobiologie, Infektiologie und Immunologie, Universität Montreal, Montreal, QC, Kanada

Guillaume Beaudoin-Bussières, Soren Gantt und Andrés Finzi

CHU Sainte-Justine Research Center, Universität Montreal, Montreal, QC, Kanada

Sören Gantt

Abteilung für Pädiatrie und Kindergesundheit, Universität Nairobi, Nairobi, Kenia

Judith Adhiambo, Ednah Ojee und Dalton Wamalwa

Abteilung für globale Gesundheit, University of Washington, Seattle, WA, USA

Emily R. Begnel, Jennifer Slyker, John Kinuthia und Dara A. Lehman

Abteilung für Forschung und Programme, Kenyatta National Hospital, Nairobi, Kenia

John Kinuthia

Howard Hughes Medical Institute, Chevy Chase, MD, USA

Frederick A. Matsen IV

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JO, DAL und CIS haben die Studie konzipiert und Experimente entworfen, mit Unterstützung von AF und GB-B. für ADCC-Experimente. Das Software- und Sequenzierungsdatenmanagement wurde von KS und JG unter der Aufsicht von FAM durchgeführt. Experimente und formale Analysen wurden von CIS mit zusätzlicher Unterstützung von KS, HW, ZAY und GB-B unter der Aufsicht von JO, DAL, AF und geleitet Die Ressourcen und Verwaltung der FAM-Kohorte wurde von EO, JA, ERB, JS, SG, JK, DW und DAL durchgeführt. Der ursprüngliche Manuskriptentwurf wurde von CIS, JO und DAL erstellt, und alle anderen trugen zur Bearbeitung und Genehmigung des endgültigen Manuskripts bei Manuskript.

Korrespondenz mit Dara A. Lehman oder Julie Overbaugh.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Stoddard, CI, Sung, K., Yaffe, ZA et al. Erhöhte Bindungs- und funktionelle Antikörperreaktionen auf SARS-CoV-2 bei Säuglingen im Vergleich zu Müttern. Nat Commun 14, 4864 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40554-w

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Eingegangen: 3. Februar 2023

Angenommen: 01. August 2023

Veröffentlicht: 11. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-40554-w

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