Spezifischer Nachweis der Tau-Seeding-Aktivität bei der Alzheimer-Krankheit mithilfe rational entwickelter Biosensorzellen

Molecular Neurodegeneration Band 18, Artikelnummer: 53 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die prionartige Ausbreitung von Tau bei neurodegenerativen Erkrankungen impliziert, dass fehlgefaltetes pathologisches Tau das normale Protein rekrutieren und dessen Aggregation steuern kann. Hier berichten wir über die Methoden zur Entwicklung empfindlicher Biosensor-Zelllinien zum Nachweis der Tau-Seeding-Aktivität.

Wir haben das rationale Design neuartiger Tau-Sonden auf der Grundlage des aktuellen Strukturwissens über pathologische Tau-Aggregate bei der Alzheimer-Krankheit durchgeführt. Wir haben auf Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) basierende biosensorstabile Zelllinien generiert und ihre Empfindlichkeit, Spezifität und Gesamtfähigkeit zum Nachweis von bioaktivem Tau in menschlichen Proben charakterisiert. Im Vergleich zur Referenz-Biosensorlinie führte das optimierte Sondendesign zu einer höheren Effizienz bei der Erkennung von Tau-Seeding. Die erhöhte Empfindlichkeit ermöglichte den Nachweis einer geringeren Tau-Seeding-Kompetenz in menschlichen Gehirnproben und bewahrte gleichzeitig die Spezifität für Tau-Seeds, die bei der Alzheimer-Krankheit vorkommen.

Diese nächste Generation von FRET-basierten Biosensorzellen ist ein neuartiges Werkzeug zur Untersuchung der Tau-Seeding-Aktivität in menschlichen Proben mit Alzheimer-Krankheit, insbesondere in Proben mit geringer Seeding-Aktivität, was bei der Untersuchung früher Tau-bedingter pathologischer Ereignisse hilfreich sein könnte.

Die Ansammlung des Mikrotubuli-assoziierten Proteins Tau (MAPT) im Gehirn in unlöslichen Aggregaten ist ein wichtiges neuropathologisches Merkmal der Alzheimer-Krankheit (AD) und anderer neurodegenerativer Erkrankungen, die als Tauopathien bezeichnet werden. Tau ist ein intrinsisch gestörtes Protein, das normalerweise im axonalen Kompartiment von Neuronen vorkommt und dort eine Rolle bei der Stabilisierung von Mikrotubuli spielt. Bei AD reichern sich hyperphosphorylierte Formen von Tau im Zytoplasma an und aggregieren zu gepaarten helikalen Filamenten (PHFs), bei denen es sich um beta-gefaltete Blattfilamentstrukturen handelt [1, 2]. Das stereotype Braak-Stadium der AD-Tau-Pathologie vom entorhinalen Kortex über den Hippocampus und später bis zu den limbischen Regionen [3] korreliert mit dem Verlust von Neuronen und dem Verlauf der klinischen Symptome [4,5,6,7,8]. Die Ausbreitung von Tau-Aggregaten über miteinander verbundene anatomische Regionen wird durch zahlreiche Beweise gestützt. Beispielsweise entwickeln transgene Tiere, die P301L-mutiertes Tau in Schicht II des entorhinalen Kortex überexprimieren, menschliche Tau-Aggregate im Gyrus dentatus und bilden dabei eine Schablone für endogenes Maus-Tau [9]. Die Fähigkeit fehlgefalteter Tau-Aggregate, normales Tau in einem „Prion-ähnlichen“ Mechanismus zu rekrutieren, wird als Seeding bezeichnet und wurde in zahlreichen experimentellen Modellen repliziert [10,11,12,13]. Die Rolle des Seedings bei der Ausbreitung der menschlichen Pathologie wird durch den Nachweis von Seeding-fähigem Tau (auch als bioaktives Tau bezeichnet) in Hirnregionen gestützt, die offensichtliche neurofibrilläre Knäuelpathologien enthalten, aber auch in nachfolgenden Regionen, die frei von offensichtlichen pathologischen Veränderungen sind. weiter entlang des Braak-Pfades [14]. Die Tau-Seeding-Neigung in postmortalen Gehirnen korreliert mit der Geschwindigkeit des klinischen Fortschreitens und bestätigt die grundlegende Rolle dieses Phänomens bei AD [15, 16].

Die Untersuchung der Seeding-Mechanismen in der AD-Pathologie wurde durch die Entwicklung einer Tau-Biosensor-Zelllinie basierend auf dem Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) erheblich beschleunigt [12]. Diese stabile humane embryonale Nierenzelllinie (HEK 293 T) exprimiert Sonden, bei denen es sich um eine P301S-pro-aggregierende Mutante der 4R-Tau-Repeat-Domäne (RD, Aminosäuren 244–372) handelt, die entweder mit einem Cyan-fluoreszierenden Protein (CFP) oder einem gelb-fluoreszierenden Protein fusioniert ist (YFP). Die Zugabe von aus dem AD-Gehirn stammendem, für die Aussaat geeignetem Tau-Material oder vorgeformten Tau-Fibrillen induziert die Aggregation dieser Fluoreszenzsonden und das anschließende FRET-Signal. Das FRET-Signal kann 24 Stunden nach der Inkubation mit Tau-Samen mittels Durchflusszytometrie quantifiziert werden. Um die Empfindlichkeit des Samennachweises zu erhöhen, werden Liposomen mit keimfähigem Material gemischt, um Samen in die Zellen zu übertragen [17]. In Abwesenheit von Liposomen können die Biosensorzellen verwendet werden, um die Mechanismen der Samenaufnahme zu untersuchen [18, 19]. Tau-Biosensorzellen wurden verwendet, um winzige Mengen bioaktiven Taus aus verschiedenen AD-Proben, einschließlich Gehirnextrakten unter Verwendung verschiedener Reinigungsmethoden, postmortalem Liquor (CSF), antemortem lumbalem Liquor oder aus dem Gehirn stammenden extrazellulären Vesikeln, spezifisch zu verstärken und zu quantifizieren [20,21,22]. ,23,24].

Eine weitere Analyse von Tau-Läsionen bei AD und anderen Tauopathien zeigt Unterschiede sowohl in den beobachteten posttranslationalen Modifikationen [25, 26] als auch in der Struktur der Fibrillen, wie durch Kryo-Elektronenmikroskopie-Technologie definiert. Während AD, primäre altersbedingte Tauopathie und die seltene autosomal-dominante familiäre dänische oder britische Demenz die gleiche Kernstruktur von Tau-Fibrillen aufweisen, gibt es auch andere Tauopathien, darunter progressive supranukleäre Parese (PSP), kortikobasale Degeneration (CBD) und Morbus Pick (PiD). oder chronische traumatische Enzephalopathie (CTE) weisen spezifische strukturelle Signaturen von Tau-Kernaggregaten auf [27]. Obwohl die spezifische pathologische Rolle der Tau-Vermehrung und der templatgesteuerten Aggregation bei Nicht-AD-Tauopathien noch untersucht wird, wurde die Existenz einer Tau-Seeding-Aktivität in verschiedenen experimentellen Systemen nachgewiesen, einschließlich der Injektion von menschlichen Gehirnextrakten in transgene oder reale Tiere [28]. -Zeitbeben-induzierte Konversion (RT-QuIC) [13, 29, 30], für jede Tauopathie. Diese Ergebnisse legen nahe, dass bestimmte Tau-Stämme oder Konformere die spezifischen Phänotypen von Tauopathien erklären könnten. Wir stellten die Hypothese auf, dass Biosensorzellen angesichts der oben genannten strukturellen Erkenntnisse so gestaltet werden könnten, dass sie eine Klasse von Tau-Strukturen im Vergleich zu anderen bevorzugen. Hier beschreiben wir die Methoden zur Entwicklung einer neuen Tau-Biosensor-Zelllinie mit einer Präferenz für AD-Tau.

Um das Expressionsniveau und die Wirksamkeit zur Erkennung des FRET-Signals nach der Aggregation der Sonde zu optimieren, wurden mehrere Modifikationen im Sondendesign implementiert. Die DNA-Sequenz basierte auf einem einzelnen Konstrukt, das ein selbstspaltendes T2A-Peptid umfasste, um eine nahezu äquimolare Expression der beiden fluoreszenzmarkierten Tau-Moleküle aufrechtzuerhalten [31]. Die Tau-Sequenz von den Aminosäuren 244 bis 378 deckte die Wiederholungsdomäne von Tau und zusätzliche Aminosäuren ab, die Teil der Kernstruktur der durch Kryo-Elektronenmikroskopie (EM) definierten AD-Tau-Filamente sind [32]. Modifiziertes Türkis 2 (mTurquoise2) und modifiziertes Neongrün (mNeonGreen) wurden aufgrund des hohen vorhergesagten Energietransfers als FRET-Donor bzw. -Akzeptor ausgewählt (33, 34). Da die DNA-Sequenz auf beiden Seiten des 2A-Peptids sehr analog war, wurde eine Codon-Optimierung durchgeführt, um eine Rekombination während der DNA-Integration in das Wirtszellgenom zu vermeiden (35). Die Effizienz der FRET-Energieübertragung korreliert umgekehrt mit dem Abstand zwischen den Fluorophoren. Wir postulierten, dass die Zusammensetzung und Konformation des Linkers die FRET-Effizienz beeinflussen könnte. Daher haben wir Konstrukte mit Linkern verglichen, die unterschiedliche Konformation und Flexibilität aufweisen [36]. Da bei menschlicher Alzheimer-Krankheit eine Tau-Acetylierung und/oder Ubiquitylierung an den Resten 311, 317 und 321 beobachtet wird und vermutet wird, dass sie die Anordnung zu gepaarten helikalen Filamenten vorantreibt [26, 37], mutierten wir Lysine an diesen Stellen zu Glutaminen, um die Acetylierung nachzuahmen (3xKQ Mutante) (Abb. 1A).

Das Design der Biosensorsonde beeinflusst die Erkennung bioaktiver Tau-Samen. A. Schematische Darstellung der verschiedenen Tau-Sonden, die entwickelt wurden. Die Tau-Sequenz (244:378) bestand aus der Wiederholungsdomäne und Aminosäuren, die im Kern der AD-Tau-Filamente enthalten waren. Im Konstrukt wurden Variationen in der Linkersequenzzusammensetzung zwischen Tau-Sequenz und fluoreszierendem Reporter eingeführt. Außerdem wurden 3 KQ-Mutationen eingeführt, um posttranslationale Modifikationen nachzuahmen. Die Aussaat von B. Tau wurde durch Durchflusszytometrie an Zellen quantifiziert, die vorübergehend mit Konstrukten transfiziert wurden, die Variationen in der Linkersequenz enthielten, und seriellen Verdünnungen von AD-Gehirnlysat ausgesetzt wurden (linkes Feld). Das rechte Feld stellt die Daten dar, die für eine Tau-Konzentration von 20 ng.C extrahiert wurden. Ein ähnliches Experiment wurde durchgeführt, um die Wirkung von 3xKQ-Modifikationen auf die Tau-Sequenz zu vergleichen. D. Schematische Darstellung der lentiviralen Vektoren, die zur Erzeugung stabiler Zelllinien hergestellt wurden. E. Stabile Zellpopulationen, die durch lentivirale Transduktion erzeugt wurden, wurden in einem auf Durchflusszytometrie basierenden Seeding-Assay mit der ursprünglichen Biosensorlinie verglichen. Jeder Punkt repräsentiert den Mittelwert von 4 biologischen Replikaten. Fehlerbalken beim Standardfehler des Mittelwerts

Um die Effizienz verschiedener Tau-Sonden beim Nachweis von aus dem menschlichen Gehirn stammendem, für die Aussaat zuständigem Tau zu vergleichen, wurden HEK293T-Zellen vorübergehend mit den verschiedenen Konstrukten transfiziert und 24 Stunden lang seriellen Verdünnungen menschlicher Gehirnhomogenate ausgesetzt. Als Referenz wurden die CFP- und YFP-Tau-RD-Konstrukte, die zur Erzeugung der ursprünglichen CRL-3275-Biosensorlinie verwendet wurden, in ein einzelnes Plasmid übertragen, das das 2A-Peptid enthielt [12]. Diese Tau-Sonde enthält einen Linker aus 21 zufälligen Aminosäuren (YPYGILQSTVPRARDPPVATAV). Die Verwendung flexibler Linker erzeugte im Vergleich zum ursprünglichen Konstrukt ein geringeres FRET-Signal, während das Fusionsprotein und der 15 Aminosäuren (EAAAK)3 starre Linker höhere FRET-Effizienzen ergaben, wenn Zellen seriellen Verdünnungen von Tau ausgesetzt wurden (Abb. 1B). Die Pseudoacetylierung erhöhte die Anzahl der FRET-positiven Zellen um etwa das Dreifache, was darauf hindeutet, dass pseudoacetylierte Tau-Sonden eine höhere Neigung zur durch Tau im menschlichen AD-Gehirn induzierten Aggregation aufweisen (Abb. 1C). Die Werte der Fläche unter den Kurven sind in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt. Basierend auf diesen Erkenntnissen wurden lentivirale Vektoren hergestellt, die die pseudoacetylierten Tau-Sonden kodieren (Abb. 1D) und zur Erzeugung stabiler HEK293T-Zelllinien verwendet wurden. Im Vergleich zur ursprünglichen Biosensorlinie zeigte die stabile pseudoacetylierte (EAAAK)3 exprimierende Zellpopulation eine etwa zehnfach verbesserte, robuste Fähigkeit, samenkompetentes Tau im menschlichen AD-Gehirnhomogenat nachzuweisen (Abb. 1E; Abb. 2).

Der neuartige Biosensor HEK293T-Klon 18 zeigt eine erhöhte Empfindlichkeit bei der Verstärkung bioaktiver Tau-Samen. A. Der ausgewählte Biosensor-Klon wurde in einem auf Durchflusszytometrie basierenden Seeding-Assay mit der ursprünglichen Tau-Biosensor-Zelllinie verglichen, nachdem er seriellen Verdünnungen von Gesamt-Tau in menschlichem AD-Hirnlysat oder Kontrollhirnlysat ausgesetzt wurde. B. Expansion von A im unteren Tau-Konzentrationsbereich. Jeder Punkt repräsentiert den Mittelwert von 4 biologischen Replikaten. Fehlerbalken beim Standardfehler des Mittelwerts. Die Tabelle fasst die berechnete untere Nachweisgrenze zusammen. Die Werte sind Mittelwerte aus zwei unabhängigen Experimenten ± Standardabweichung. C. Fluoreszenzbildgebung des ausgewählten Biosensor-Zellklons 24 Stunden nach der Aussaat mit AD-Gehirnlysat, Darstellung der repräsentativen fibrillären Struktur der aggregierten Tau-Sonde. Die unteren Tafeln zeigen den gleichen Zustand mit stärkerer Vergrößerung. D. Repräsentatives Bild von Tau-Kernflecken, die nach der Aussaat in einen neuen Biosensor-Zellklon entdeckt wurden. E. Nachweis von aus dem Gehirn stammenden menschlichen Tau-13-positiven Einschlüssen (Pfeilspitzen), eingebettet in fibrilläre Tau-Sondenaggregate 24 Stunden nach der Aussaat. Der Maßstabsbalken beträgt 10 μm

Aus der vielversprechendsten stabilen Zellpopulation wurden 52 einzelne Klone isoliert. Alle wurden in durchflusszytometrischen Seeding-Assays getestet (Daten nicht gezeigt). Der Klon mit dem höchsten Signal-Rausch-Verhältnis wurde für die weitere Charakterisierung ausgewählt. Im Vergleich zur ursprünglichen Biosensor-Zelllinie zeigte dieser HEK293T-Klon (Nr. 18) eine hohe Empfindlichkeit beim Nachweis bioaktiver Tau-Samen, wenn serielle Verdünnungen, die fünf Größenordnungen an Tau-Konzentrationen abdeckten, auf die Zellen angewendet wurden (Abb. 2A). Die berechnete untere Nachweisgrenze für Klon 18 lag bei 3 pg und damit mehr als zehnmal niedriger als bei der ursprünglichen Biosensor-Zelllinie (Abb. 2B). Um die morphologischen Merkmale der Tau-Sondenaggregate nach der Aussaat zu charakterisieren, wurde Klon 18 nach der Aussaat mit AD oder Kontrollhirnlysat auf einem konfokalen Mikroskop abgebildet. Die fluoreszierenden Tau-Sondenaggregate nahmen häufig die Form fibrillärer Strukturen an, die pathologischen Tau-Aggregaten sehr ähnlich waren (Abb. 2C). Bemerkenswerterweise fanden wir heraus, dass sich Aggregate nicht nur im Zytoplasma, sondern auch im Zellkern ansammelten, wie zuvor beschrieben (Abb. 2D) [38]. Eine Immunfärbung mit einem Antikörper, der die Sonde nicht erkennt, wurde unter Verwendung des N-terminalen Tau-13-Antikörpers durchgeführt. Nach der Aussaat mit AD-Gehirnlysat wurden in den Sondenaggregaten eingeschlossene Tau-13-positive Einschlüsse nachgewiesen (Pfeilspitzen, Abb. 2E). Diese Punktate stellen wahrscheinlich samenfähiges Material dar.

Der Aggregatzustand der Sonde nach der Beimpfung wurde weiter analysiert. Proteine wurden aus ausgesäten Zellen in 1 % Sarkosyl extrahiert und auf einem Western Blot unter Verwendung eines Nachweisantikörpers laufen gelassen, der an die Tau-RD bindet (Abb. 3A). Im Vergleich zu den CRL-3275-Zellen war das Basalexpressionsniveau der FRET-Sonde im HEK293T-Klon 18 wesentlich höher (ungefähr sechsfacher Anstieg, ergänzende Abbildung Abb. 1D). Darüber hinaus sammelte sich nach der Aussaat mit AD-Hirnmaterial der Großteil der Sonde im Gegensatz zur ursprünglichen Zelllinie in der Sarkosyl-unlöslichen Fraktion an. Der Western Blot zeigte auch das Vorhandensein einer kleinen Menge ungespaltenen Polypeptids, das sich ebenfalls in der unlöslichen Fraktion anreicherte. Unter Verwendung dieses Extraktionsprotokolls stellten wir fest, dass Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH), unsere Beladungskontrolle, im Einklang mit anderen Studien auch in der in Sarkosyl unlöslichen Fraktion nachgewiesen wurde [39, 40]. Im HEK293T-Klon 18 zeigte der Western Blot eine zusätzliche Bande um 40 kDa, die wahrscheinlich auf eine Spaltung innerhalb des fluoreszierenden Proteins zurückzuführen ist, da sie immer noch mit dem Tau 316–355-Antikörper nachgewiesen wird. Als nächstes wurde die Bildung der Beta-Faltblatt-Sekundärstruktur der Sonde mittels Thiazinrot-Färbung beurteilt. Thiazinrot ist ein fluoreszierender Farbstoff, der eine hohe Affinität zu Beta-Faltenfibrillenstrukturen aufweist und reife Tau-Aggregate im AD-Gehirn anfärbt [41]. Nach der Beimpfung mit AD-Gehirnlysat zeigte der neue Biosensor HEK293T ein robustes Thiazinrotsignal, das mit aggregiertem Fluoreszenzreporter kolokalisierte (Abb. 3C). In der ursprünglichen CRL-3275-Zelllinie wurde ebenfalls eine Thiazinrot-Positivität beobachtet, aber die Größe der Aggregate war viel kleiner (Abb. 3D).

Tau-Sonde in Biosensorzellen aggregiert nach der Aussaat in unlöslichen Beta-Faltenstrukturen. A. Schematische Darstellung des Extraktionsprotokolls für unlösliches und lösliches Tau nach der Aussaat. B. Western-Blot zum Vergleich der Tau-Sonden-Expression in der ursprünglichen Biosensor-Zelllinie und dem neuen Biosensor-HEK293T-Klon 18 nach der Aussaat in löslichen und Sarkosyl-unlöslichen Fraktionen. Als primärer Antikörper wurde ein Antikörper verwendet, der die Wiederholungsdomäne von Tau erkennt. GAPDH wurde als Ladekontrolle verwendet. Unbeschnittene Bilder von Western-Blot-Membranen sind in der ergänzenden Abbildung 2 dargestellt. Eine Thiazinrot-Färbung wurde durchgeführt, um die beta-gefaltete Konformation 24 Stunden nach der Aussaat mit AD-Gehirnlysat oder Kontroll-Gehirnlysat im neuartigen Biosensor-Klon HEK293T (C) und der ursprünglichen Biosensor-Linie D nachzuweisen . Der Maßstabsbalken beträgt 10 μm

Wir haben kürzlich gezeigt, dass ein Teil der Variabilität im klinischen Verlauf der AD mit der Tau-Seeding-Aktivität korreliert, wie sie mit der ursprünglichen Biosensor-Zelllinie (CRL-3275) im postmortalen AD-Gehirn gemessen wurde [15]. Um zu untersuchen, ob der neuartige Biosensor HEK293T-Klon 18 ähnliche pathologische Tau-Arten erkennt, wurden AD-Fälle, bei denen zuvor gezeigt wurde, dass sie eine hohe, mäßige und niedrige Seeding-Aktivität aufweisen, parallel in Seeding-Assays mit beiden Zelllinien getestet. Nach der Normalisierung lieferte die Quantifizierung der Aussaataktivität in beiden Zelllinien das gleiche Muster, was darauf hindeutet, dass die neue Biosensorlinie ähnliche klinisch relevante Tau-Arten erkennt (Abb. 4A).

Der neuartige Biosensor HEK293T-Klon 18 verstärkt bioaktive Tau-Samen mit hoher Empfindlichkeit und Spezifität. A. Gehirnextrakte aus AD-Fällen, ausführlich beschrieben bei Dujardin et al. [15], die als niedrige, mäßige und hohe Seeing-Aktivität eingestuft wurden, wurden in durchflusszytometrischen Seeding-Assays sowohl in der neuen als auch in der ursprünglichen Biosensor-Linie getestet. Das Signal wurde auf der Hochsämaschine normalisiert, um ein ähnliches Muster in beiden Linien zu zeigen. Die Balken stellen den Mittelwert aus zwei einzelnen unabhängigen Experimenten dar. B. Die Spezifität des neuen Tau-Biosensor-Klons wurde nach Immundepletion von Tau im AD-Gehirnhomogenat bestätigt. Tau wurde aus Hirnlysat immundepletiert und sowohl das zugeführte als auch das abgereicherte Material wurden in einem auf Durchflusszytometrie basierenden Seeding-Assay getestet. Die Immundepletion wurde durch Western Blot unter Verwendung eines polyklonalen Tau-Antikörpers als Nachweis (C) bestätigt: Spur 1 ist Eingabe, Spur 2 ist immundepletierte Probe. Die rechts gezeigte Membran zeigt eine lange Belichtungszeit und zeigt einen Ausstrich, der Tau mit hohem Molekulargewicht (HMW) entspricht. D. Vergleich der Tau-Seeding-Aktivität in beiden Biosensorlinien bei verschiedenen Tauopathien (jeder Punkt stellt den Mittelwert von 3 technischen Replikaten eines Falles dar, Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar). E. Ein stabiler CHO-Klon, der das Biosensor-Konstrukt überexprimiert, wurde mit aus AD-Gehirn stammendem HMW-Aussaat-kompetentem Tau oder Tau mit niedrigem Molekulargewicht (LMW) in Abwesenheit von Liposomen 48 Stunden lang inkubiert und die Aufnahme und Amplifikation der Samen wurde durch Durchflusszytometrie quantifiziert. Die Zugabe von 1 μM RAP, einem bekannten LRP-1-Inhibitor, verringerte die Aussaat

Im AD-Homogenat können mehrere Faktoren die Aggregation der Tau-Sonde vorantreiben. Um die Sondenspezifität für Tau-Samen zu beurteilen, wurde eine Immundepletion durchgeführt. Tau wurde im Lysat des menschlichen Gehirns unter Verwendung eines Antikörpers, der auf die mittlere Region abzielt, immunpräzipitiert. Das Ausgangsmaterial und die immungeschwächten Proben wurden im Seeding-Assay unter Verwendung des neuartigen Biosensors getestet. Im abgereicherten Material war das Seeding-Signal um 82,3 % verringert (Abb. 4B). Die Proben wurden mittels Western Blot analysiert, um die Tau-Menge zu bestimmen (Abb. 4C). Mit dem Ausgangsmaterial wurde ein Abstrich gefunden, der das Vorhandensein stark veränderter und aggregierter Formen von Tau im AD-Gehirn bestätigte. In der immungeschwächten Probe waren einige Restbanden vorhanden, was darauf hindeutet, dass die Immunpräzipitation unvollständig war, was erklärt, warum im Seeding-Assay ein Restsignal gefunden wurde.

Um die Sensitivität und Spezifität für verschiedene Tau-Samen zu vergleichen, wurden anschließend Gehirnlysate von AD, progressiver supranukleärer Parese (PSP), kortikobasaler Degeneration (CBD), Morbus Pick (PiD) und Kontrollfällen in den ursprünglichen und neuartigen Biosensorzellen getestet (Abb. 4D). In allen Fällen wurde die Eingabe auf den mittels Western Blot gemessenen Gesamt-Tau-Gehalt (50 ng) normalisiert. Wie erwartet war das Signal zwischen den Linien vergleichbar, als wir Gehirnlysate aus einer Region mit offensichtlicher Tau-Pathologie verwendeten, in der eine hohe Seeding-Aktivität zu erwarten war, wie etwa dem Frontalcortex (Brodmann-Bereich 8) in späten Braak-Stadien (V/VI). Darüber hinaus war die neuartige Biosensorlinie in der Lage, selbst in AD-Lysaten aus dem primären visuellen Kortex (Brodmann-Bereich 17), die frei von Tau-Pathologie sein sollten, um sich für das Braak-Stadium III oder IV zu qualifizieren, konsistent die Seeding-Aktivität nachzuweisen.

Die CRL-3275-Zellen sind in der Lage, Tau aus menschlichen Nicht-AD-Tauopathien zu erkennen, scheinen aber eindeutig AD-bezogene Tau-„Stämme“ zu bevorzugen (Abb. 4D). Wir stellten die Hypothese auf, dass wir durch die Verbesserung der FRET-Effizienz mit verbesserten Fluorophoren und optimierten Linkern bei gleichzeitiger Auswahl der Domäne, die eng mit den AD-Fibrillenkernen übereinstimmt, und durch die Einführung AD-bedingter posttranslationaler Veränderungen an bestimmten Lysinresten möglicherweise in der Lage sein könnten, technische Lösungen zu entwickeln eine empfindlichere Sonde, die weiterhin AD-bezogene Samen bevorzugt. Wir haben Proben von PiD, PSP, CBD und Kontrollen getestet (Abb. 4D) und festgestellt, dass Klon 18 tatsächlich keine erhöhte Empfindlichkeit für Nicht-AD-Tau zeigte, da beobachtet wurde, dass das Signal bei anderen Tauopathien niedrig blieb (trotz Übereinstimmung mit Äquivalenten). Mengen an Tau, die dem Assay zugesetzt wurden).

Bei AD breitet sich Tau über miteinander verbundene Gehirnregionen von einer Zelle zur anderen aus. Das LDL-Rezeptor-verwandte Protein 1 (LRP1) ist ein endozytischer Rezeptor für sowohl monomeres als auch pathologisches Tau und vermittelt die Aufnahme und Aussaat von Tau [19, 42]. In Abwesenheit von Liposomen zur Permeabilisierung der Zellmembran vermehrt der ursprüngliche Biosensor Samen mit geringer Effizienz, was möglicherweise auf die relativ geringen Mengen an LRP1 in HEK-Zellen zurückzuführen ist. Die erhöhte Empfindlichkeit des Reporters in der manipulierten Linie zeigt einen 10-fachen Anstieg des FRET-Signals nach Inkubation mit aus dem Gehirn stammendem Tau-Präparat mit hohem Molekulargewicht (HMW) im Vergleich zur ursprünglichen Linie. Obwohl HEK293-Zellen geringe Mengen an LRP1 exprimieren [19], wurde die Aussaat interessanterweise verringert, wenn HMW mit 1 μM RAP, einem bekannten Antagonisten von LRP1, koinkubiert wurde (ergänzende Abbildung 2A), was darauf hindeutet, dass die beobachtete erhöhte Empfindlichkeit nicht darauf zurückzuführen war zu einer Erhöhung der Tau-Aufnahme, aber zu einem empfindlicheren Reportersystem. Da Eierstockzellen des Chinesischen Hamsters (CHO) höhere Mengen an LRP1 exprimieren [19], haben wir eine klonale Zelllinie entwickelt, die dieselbe Tau-Biosensorsonde überexprimiert. Als dieser stabile CHO-Klon mit HMW-Tau in Abwesenheit von Liposomen inkubiert wurde, wurde eine Aussaat festgestellt. In Gegenwart von RAP verringerte sich die Aussaat um zwei Drittel, was darauf hindeutet, dass der Großteil der Tau-Aufnahme durch LRP1 vermittelt wurde (Abb. 4E). Dieses Experiment bestätigte, dass ein solches auf Lentiviren basierendes optimiertes Reporterkonstrukt nicht nur zur Untersuchung der templatgesteuerten Aussaat, sondern auch der Mechanismen der extrazellulären Tau-Aufnahme verwendet werden kann.

FRET-basierte Tau-Biosensor-Zelllinien sind eine effiziente Methode zur Quantifizierung der Aussaatkapazität von Tau-Arten in biologischen Proben. Hier beschreiben wir eine neuartige AD-Tau-Biosensorlinie mit verbesserter Empfindlichkeit und nutzen dabei das kürzlich erworbene Wissen über die Strukturmerkmale von Tau-Aggregaten bei AD. Wir haben Tau-FRET-Sonden basierend auf einem einzelnen DNA-Konstrukt unter Verwendung des selbstspaltenden T2A-Peptids entwickelt. Dieses Konstrukt ermöglichte die effiziente Überexpression des Tau-Reporters mithilfe eines einzigen lentiviralen Konstrukts. Im Gegensatz zu früheren Versuchen, die Expression der Tau-Sonde in Biosensorzellen zu erhöhen [43], führte diese Strategie zu einer dramatischen Verbesserung der Expression der Sonde im Vergleich zur ursprünglichen Biosensor-Linie. Wie bereits in einer anderen Studie berichtet, in der verschiedene Fluoreszenzreporter verwendet wurden, ermöglichte die Optimierung des Fluoreszenzproteinpaars die Erzeugung eines robusten FRET-Signals über einen weiten Dynamikbereich [44].

Die Tau-Fragmentsequenz wurde so ausgewählt, dass sie die vollständige Aminosäuresequenz der AD-Kernaggregate umfasst. Mithilfe einer transienten Transfektion in HEK 293 T-Zellen verglichen wir mehrere Linkersequenzen und stellten fest, dass ein starrer Linker mit 15 Aminosäuren ein optimiertes FRET-Signal lieferte, das durch Durchflusszytometrie gemessen wurde. Wie die ursprüngliche Biosensor-Linie enthielt auch die neue Tau-Sonde eine Mutation an Position 301. Es wurde gezeigt, dass Prolin-301-Substitutionen die lokale Struktur von Tau modifizieren und dessen Keimaggregation fördern [45, 46]. Die CRL-3275-Linie enthält eine P301S-Mutation, während der HEK293T-Klon 18 eine P301L-Mutation enthält. Die P301L-Mutante könnte möglicherweise einen Teil der verbesserten Empfindlichkeit der neuen Zelllinie erklären. Allerdings werden beide Mutanten gleichermaßen in der Praxis eingesetzt und frühere Studien, in denen die Wirkungen der beiden Mutanten verglichen wurden, berichteten über inkonsistente Ergebnisse [47, 48].

Die Kryo-EM-Struktur von Tau-Aggregaten bei AD hat das Vorhandensein von Dichten auf der Ebene der Lysine 317 und 321 gezeigt [32]. Später wurde über posttranslationale Modifikationen einschließlich Acetylierung und Ubiquitinierung an den Lysinen 311, 317 und 321 in aus dem Gehirn stammenden Tau-Aggregaten berichtet und als Mechanismus der Ladungsneutralisierung vorgeschlagen, der die Stapelung von Protofilamenten zu gepaarten helikalen Filamenten begünstigt [26, 37]. Die Modifikation der Tau-Sonde, die die Acetylierung an den Resten 311, 317 und 321 nachahmt, führte zu einem massiven Anstieg der Aggregatbildung in Biosensorzellen, was darauf hindeutet, dass die modifizierte Sonde möglicherweise eine höhere Neigung zur Aggregation aufweist.

Insgesamt führten die mehrfachen Optimierungen der Tau-Sonde zu einer Zelllinie mit einer mehr als zehnfachen Steigerung der Empfindlichkeit für Tau-Samen im AD-Gehirnextrakt. Klon 18 detektierte ein signifikantes FRET-Signal in der Gesamt-Tau-Konzentration im femtomolaren Äquivalent von Tau-Monomeren und behielt gleichzeitig die Spezifität für Tau-Samen bei, wie durch Immundepletion nachgewiesen wurde. Die erhöhte Empfindlichkeit ermöglichte den Nachweis der Tau-Seeding-Aktivität in Regionen mit geringem erwartetem Signal, wie z. B. dem primären visuellen Kortex bei Braak-III/IV-AD-Fällen. Darüber hinaus konnte der neu generierte Klon 18-Reporter, wie die ursprüngliche CRL-3275-Biosensorzelllinie, in einer früheren Studie eine konsistente Variation der Aussaataktivität in drei AD-Fällen feststellen, die als niedrige, mittlere und hohe Aussaat klassifiziert wurden [15].

Die Relevanz FRET-basierter Biosensorzellen wurde durch eine Studie mit rekombinanten Tau-Fusionsproteinen in Frage gestellt [49]. Wenn Tau an ein fluoreszierendes Protein fusioniert wird, kann laut den Autoren eine sterische Hinderung die Verlängerung der Aggregate zu vollständig ausgebildeten Filamenten verhindern. Folglich kann das in Biosensorzellen erzeugte FRET-Signal auf biologische Prozesse zurückzuführen sein, die von der Aggregation abweichen, einschließlich Stressgranulat oder Flüssig-Flüssig-Phasentrennung. In dieser Studie wurde eine kurze 13–14 Aminosäuren lange Linkersequenz zwischen dem Tau-Fragment und dem fluoreszierenden Reporter verwendet, die kürzer ist als der in der ursprünglichen Biosensorlinie vorhandene Linker und die in dieser Studie vorgestellte optimierte Sequenz. Darüber hinaus folgte die dynamische Quantifizierung der Aggregatbildung in den Biosensorzellen mithilfe der Bildgebung lebender Zellen durchweg einem Muster, das aus einer Verzögerungsphase, gefolgt von einer Wachstumsphase und einem Plateau (ergänzende Abbildung 3) bestand, wie zuvor in der ursprünglichen Biosensorreihe berichtet [ 50]. Dieses stereotype Muster erinnert an Modelle, die die Kinetik der Fibrillogenese beschreiben [51]. Hier haben wir gezeigt, dass in Biosensorzellen nach der Aussaat erzeugte Aggregate aus Sarkosyl-unlöslichen Beta-Faltblättern bestehen. Wir haben vorläufige EM-Studien durchgeführt, bei denen es nicht gelang, Einschlüsse in den Zellen zu identifizieren, die gepaarte helikale Filamente enthalten. Daher sollten die FRET-positiven Aggregate in diesem Modell als Beweis für die Samenkompetenz des den Zellen präsentierten Taus und nicht als Modell der PHF-Konformation an sich angesehen werden. Jüngste elegante KryoEM-Studien [52] zeigen schlüssig, dass sich Beta-Faltblattstrukturen zwar leicht bilden lassen, aber selbst kleine Änderungen der Pufferbedingungen oder der Peptidlänge die Wahrscheinlichkeit der Bildung von knochentreuen AD-Tau-Fibrillen in vitro beeinflussen. Unsere aktuellen Erfahrungen stimmen mit diesen Beobachtungen überein.

Hier beschreiben wir die Methoden für den Entwurf und die Erzeugung optimierter FRET-basierter Tau-Biosensor-Zelllinien zum Nachweis der Tau-Seeding-Aktivität. Während andere Methoden wie RT-QuIC zur Quantifizierung der Tau-Seeding-Aktivität vorgeschlagen wurden, ermöglichen Biosensorzellen Untersuchungen der templatgesteuerten Aggregation in einer zellulären Umgebung. Die Verwendung einer Zelllinie, die LRP1, einen bekannten Oberflächenrezeptor für Tau, exprimiert, ermöglicht die Untersuchung von Aufnahmemechanismen und zellulären Downstream-Ereignissen mit derselben Biosensorsonde.

Die Integration des aktuellen Wissens über die strukturellen Grundlagen von Tau-Falten bei AD und die Rolle posttranslationaler Modifikationen in das Design der Sonden führte zu einer verbesserten Empfindlichkeit und Spezifität. Dank der jüngsten Beschreibungen der Tau-Faltung bei verschiedenen Tauopathien könnten solche Methoden die Entwicklung anderer Biosensorlinien zur Erkennung krankheitsspezifischer Konformere leiten.

Die Tau RD P301S FRET Biosensor-Zelllinie (CRL-3275) wurde von Marc Diamond bereitgestellt. HEK293T-Zellen wurden bei ATCC (CRL-11268) bestellt. Die Zellen wurden in DMEM, ergänzt mit 10 % FBS und Penicillin-Streptomycin, bei 37 °C und 5 % CO2 in einer feuchten Atmosphäre gehalten. Die CHO-Zelllinie wurde von ATCC (CCL-61) erhalten und in DMEM/F12, ergänzt mit 10 % FBS und Penicillin-Streptomycin, kultiviert.

Die Erzeugung der lentiviralen Vektoren Tau-RD-P301S-CFP und Tau-RD-P301S-YFP wurde in [12] beschrieben. Plasmide wurden von Marc Diamond bereitgestellt. Fragmente, die für RD-P301S-CFP und RD-P301S-YFP kodieren, wurden in ein pcDNA3.1-Plasmid subkloniert, das eine selbstspaltende T2A-Peptidsequenz enthielt. Alle anderen DNA-Konstrukte, einschließlich der lentiviralen Vektoren, wurden synthetisiert und bei Twist Bioscience für Expressionsplasmide oder Vectorbuilder für lentivirale Konstrukte bestellt. Alle synthetisierten DNA-Sequenzen wurden mit dem Online-Tool GeneDesign codonoptimiert [53]. Die detaillierte Karte des effizientesten lentiviralen Konstrukts und seiner Sequenz finden Sie in ergänzendem Material.

Gefrorenes menschliches kortikales Gewebe wurde in PBS, ergänzt mit 1X Halt-Proteaseinhibitor-Cocktail (ThermoFisher Scientific) (500 μl PBS für 100 mg Gewebe), mit 20 Auf- und Abwärtsbewegungen in einem 2-ml-Dounce-Homogenisator aus Glas homogenisiert. Die Proben wurden in ein 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen überführt und 10 Minuten lang bei 10.000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt, aliquotiert und bis zur weiteren Verwendung bei –80 °C gelagert. Das Tau mit hohem Molekulargewicht (HMW) und Tau mit niedrigem Molekulargewicht (LMW) wurde durch Größenausschlusschromatographie wie zuvor beschrieben hergestellt [21]. Kurz gesagt, Gehirnhomogenate wurden auf Superdex200 10/300GL-Säulen (Nr. 17–5175-01, GE Healthcare) in PBS laufen gelassen. Es wurden Fraktionen von 500 μL gesammelt. Die HMW-Fraktionen 1 bis 4 wurden gepoolt und durch Ultrazentrifugation bei 150.000 g für 30 Minuten bei 4 °C konzentriert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet wurde in 75 μl PBS resuspendiert, um das HMW-Tau-Konzentrat zu erzeugen. Die LMW-Fraktionen 12 bis 14 wurden zusammengegeben und etwa 20-fach unter Verwendung eines Ultra-15 (10 k) (Amicon, Nr. UFC901024) für 10 Minuten bei 4.000 g konzentriert. Die Gesamt-Tau-Konzentration wurde durch Western Blot unter Verwendung einer seriellen Verdünnung des rekombinanten Tau-441-Proteins (Sigma-Aldrich Nr. T0576) und eines polyklonalen Kaninchen-Anti-Human-Tau-Antikörpers (A0024, Dako) als Primärantikörper quantifiziert. Die demografischen Daten und die neuropathologische Diagnose der verwendeten menschlichen Fälle sind in der Ergänzungstabelle 2 zusammengefasst.

Dreißigtausend HEK293T-Zellen pro Vertiefung wurden in einer Platte mit 24 Vertiefungen ausplattiert. Nach 24 Stunden wurden die Zellen gezählt und mit lentiviralen Partikeln mit einer Infektionsmultiplizität von 30 in 250 μl konditioniertem Medium, ergänzt mit 5 μg/ml Polybrene, infiziert. Am nächsten Tag wurden 250 μL frisches Kulturmedium hinzugefügt. Die Zellen wurden für die folgenden zwei Wochen expandiert, um die Eliminierung infektiöser Viruspartikel zu ermöglichen. Für die Selektion klonaler Zellen wurden die Zellen aus einer 75 % konfluenten T75-Kulturflasche mit 5 ml Accutase abgelöst und in 0,22 μm gefiltertem HBSS, das 1 % Rinderserumalbumin enthielt, resuspendiert. Die Zellen wurden auf dem Zellsortierer Biorad S3e laufen gelassen und die 10 % hellsten Zellen wurden mit 1 Zelle/Well in 96-Well-Platten ausplattiert, die 150 μl 0,22 μm gefiltertes konditioniertes Medium enthielten. Einzelne Klone wurden kultiviert und amplifiziert und in Aussaattests charakterisiert. Für die Transduktion von CHO-Zellen wurde das gleiche Verfahren befolgt, mit der Ausnahme, dass 10.000 CHO-Zellen in einer 24-Well-Platte zur Virusinfektion ausplattiert wurden.

Der Tau-Seeding-FRET-Biosensor-Assay unter Verwendung transienter Transfektion wurde wie folgt durchgeführt. HEK293T-Zellen wurden in 96-Well-Platten mit klarem Boden von Costar Black (Corning) (zuvor mit 50 μg/ml Poly-D-Lysin beschichtet) revers transfiziert, wobei 0,3 μl/Well trans-IT X2-Reagenz (Mirus) in 10 μl/Well verwendet wurden Opti-MEM gemäß Herstellerprotokoll mit 100 ng/Well Plasmid-DNA. Pro Vertiefung wurden 6 × 10E5-Zellen in einem Endvolumen von 100 μl ausplattiert. Nach 24 Stunden wurden die Zellen mit sterilem PBS gewaschen. Menschliche Gehirnextrakte wurden mit Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Endkonzentration 1 % Vol./Vol.) in Opti-MEM (Endvolumen 50 μl pro Vertiefung) 20 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, bevor sie zu den Zellen gegeben wurden. Jede Bedingung wurde dreifach oder vierfach getestet. Für den Aussaattest unter Verwendung der CRL-3275-Zelllinie des stabilen 293-T-Klons wurde ein ähnliches Verfahren verwendet, mit der Ausnahme, dass die Zellen nicht revers transfiziert wurden und die Platte mit 30.000 Zellen pro Vertiefung ausgesät wurde. Das Experiment wurde entweder durch Durchflusszytometrie oder Lebendzellbildgebung auf einem Cytation 5 Multimode-Lesegerät (BioTek) mit 1 Bild alle 30 Minuten analysiert. Für die Durchflusszytometrie wurden 24 Stunden nach der Inkubation mit Gehirnextrakten Zellen mit 50 μl Trypsin gesammelt und unter Verwendung von 50 μl 10 % FBS-Kulturmedium zur Neutralisierung von Trypsin in U-Bodenplatten mit 96 Vertiefungen (Corning) überführt. Die Zellen wurden 10 Minuten lang bei 1200 g pelletiert, 10 Minuten lang in kaltem 2 % Paraformaldehyd resuspendiert, bei 1200 g pelletiert und in FACS-Puffer, der BSA, EDTA und 0,09 % Azid (Miltenyi) enthielt, resuspendiert. Die Zellen wurden mit dem Durchflusszytometer MACSQuant VYB (Miltenyi) zur Quantifizierung von Fluoreszenz und FRET analysiert. CFP/mTurquoise2-Kanal und FRET wurden beide gemessen, indem die Zellen mit dem 405-nm-Laser angeregt und die Fluoreszenzemission am 405/50-nm- bzw. 525/50-nm-Filter gemessen wurde. Um das FRET-Signal zu quantifizieren, wurde ein Zwei-Parameter-Dichtediagramm von FRET im Vergleich zum CFP/mTurquoise2-Spender erstellt und Zellen, die nur mit Kontroll- oder Scheinbedingungen behandelt wurden, wurden verwendet, um die FRET-negative Population zu identifizieren. Der Prozentsatz FRET-positiver Zellen und die mittlere Fluoreszenzintensität wurden aufgezeichnet. Die integrierte FRET-Dichte wurde durch Multiplikation der beiden Parameter berechnet, wie zuvor vorgeschlagen [14]. Pro Well wurden etwa 40.000 Zellen analysiert. Die Daten der Durchflusszytometrie wurden mit der Software FlowJo v10.7 (BD Biosciences) analysiert.

Für die Fluoreszenzbildgebung wurden Seeding-Assays in 96-Well-Schwarzplatten mit μClear-Filmboden (Greiner Bio-One) durchgeführt. Die Vorgehensweise war die gleiche wie oben beschrieben. Alle Bilder wurden mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop Olympus FV3000 aufgenommen. Die Zellen wurden 15 Minuten lang in 4 % PFA in PBS fixiert. Für die Immunzytochemie wurde die Blockierung mit 1 % BSA, 0,1 % Tween20 in PBS für 30 Minuten durchgeführt. Der Primärantikörper Tau-13 (Abcam) wurde über Nacht bei 4 °C aufgetragen. Zur Thiazinrot-Färbung wurden die Zellen nach der Fixierung 15 Minuten lang in einer 0,005 % (Gew./Vol.) Lösung von Thiazinrot in 50 % Ethanol in TBS-Lösung inkubiert und dreimal in TBS gewaschen. Die nukleare Gegenfärbung wurde 5 Minuten lang mit 1 μg/ml DAPI-Lösung durchgeführt. Um Überlappungen mit mNeonGreen-Spektren zu vermeiden, wurde Thiazinrot bei 550 nm angeregt und bei 650 nm aufgezeichnet.

Zur Analyse der Tau-Reporter-Expression und -Löslichkeit nach der Aussaat wurden die Zellen in 6-Well-Platten (zuvor mit 50 μg/ml Poly-D-Lysin beschichtet) mit einer Dichte von 9 × 10E5 Zellen pro Well ausplattiert. Am nächsten Tag wurde menschlicher Gehirnextrakt (1 μg Gesamt-Tau pro Vertiefung) mit Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Endkonzentration 1 % Vol/Vol) in Opti-MEM (Endvolumen 2 ml pro Vertiefung) 20 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert bevor es den Zellen hinzugefügt wird. Nach 24 Stunden wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen und in RIPA-Puffer, der 1X Protease/Phosphatase-Inhibitor-Cocktail enthielt, lysiert. Der Gesamtproteingehalt wurde durch BCA quantifiziert. Das Volumen aller Proben wurde an den Proteingehalt angepasst. 1 % Sarkosyl-Endkonzentration wurde zugegeben und die Proben wurden 1 Stunde lang bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert. Anschließend wurden die Proben 1 Stunde lang bei 100.000 g ultrazentrifugiert. Das Pellet wurde in PBS mit 1X Protease/Phosphatase-Inhibitor-Cocktail resuspendiert. Western Blots wurden in 4–12 % Bis-Tris-Gel (Invitrogen) in MOPS durchgeführt und auf PVDF-Membranen übertragen. Als primärer Antikörper wurde der Anti-Tau-316–355-Antikörper gegen die Wiederholungsdomäne verwendet (Klon 77G7, BioLengend). Als Ladungskontrolle wurde Anti-GAPDH verwendet (Abcan, ab83956). Western Blots wurden auf einem Odyssey LI-COR-System entdeckt. Zur Immundepletion von Tau wurde ein Anti-Tau-Antikörper (Cell Signaling Technology-Klon D5D8N) mit Protein-G-Kügelchen vernetzt (5 μg Antikörper für 25 μl Kügelchen) und über Nacht in einer HMW-Tau-Probe (Endvolumen 100 μl) inkubiert 4 °C. Die Perlen wurden durch Zentrifugation pelletiert und der immunabgereicherte Überstand wurde zur Analyse gesammelt. Die Immunpräzipitation wurde durch Western Blot auf Ausgangsmaterial und Überstand unter Verwendung eines polyklonalen Kaninchen-Anti-Human-Tau-Antikörpers (A0024, Dako) als Primärantikörper bestätigt.

Grundlegende Statistiken und Grafiken wurden auf GraphPad Prism v9.1.1 (GraphPad) erstellt. Der P-Wert wurde als * für p < 0,05, ** für p < 0,01, *** für p < 0,001, **** für p < 0,0001 angegeben. Für alle statistischen Analysen wurde eine einfaktorielle ANOVA verwendet, mit Ausnahme von Abb. 4D, in der das Signal mithilfe eines nichtparametrischen Mann-Whitney-Tests verglichen wurde.

Die während der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich.

Die in diesem Manuskript beschriebenen Zelllinien werden in der American Type Culture Collection hinterlegt.

Mikrotubuli-assoziiertes Protein Tau

Alzheimer-Erkrankung

Förster-Resonanzenergieübertragung

Gepaartes spiralförmiges Filament

Menschliche embryonale Niere

Domain wiederholen

Cyan fluoreszierendes Protein

Gelb fluoreszierendes Protein

Progressive supranukleäre Parese

Corticobasale Degeneration

Pick-Krankheit

Durch Erdbeben verursachte Konvertierung in Echtzeit

Elektronenmikroskopie

Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase

LDL-Rezeptor-verwandtes Protein 1

Hohes Molekulargewicht

Eierstock des Chinesischen Hamsters

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Referenzen herunterladen

Unzutreffend.

Diese Arbeit wurde teilweise durch ein von Abbvie gefördertes Forschungsstipendium finanziert; Die Arbeit wurde auch durch Zuschüsse des Rainwater Foundation Tau Consortium (BTH), NIH R56AG061196, RF1AG059789, RF1AG058674 und P30AG062421 (BTH) unterstützt. AL wurde vom Schweizerischen Nationalfonds (P2ELP3_184403), der Alzheimer's Association (AACSF-19–617308), der Professor Dr. Max Cloetta Foundation und der Uniscientia Foundation, Vaduz sowie dem Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon 2020 der Europäischen Union im Rahmen des Marie Skłodowska-Programms unterstützt. Curie-Zuschussvereinbarung Nr. 839098.

Abteilung für Neurologie, Massachusetts General Hospital/Harvard Medical School, 114 16Th Street, Charlestown, MA, 02129, USA

Caitlin Commins, Noah Quittot, Zhanyun Fan, Rachel E. Bennett und Bradley T. Hyman

Harvard Medical School, Boston, MA, USA

Aurelien Lathuliere, Romain Perbet, Noé Quittot, Rachel E. Bennett und Bradley T. Hyman

Gedächtniszentrum, Abteilung für Rehabilitation und Geriatrie, Universitätsklinikum Genf und Universität Genf, Genf, Schweiz

Aurelien Lathuilière

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Konzeptualisierung: AL, BTH; Methodik: AL, BTH, ZF; Formale Analyse: AL, BTH; Untersuchung: AL, YJ, RB, CD, CC, NQ, ZF, REB; Ressourcen: BTH; Datenkuration: AL, YJ; Schreiben – Originalentwurf: AL, BTH; Schreiben – Rezension und Bearbeitung: AL, BTH, RB, NQ, REB.; Visualisierung: AL; Aufsicht: AL, BTH; Projektleitung: AL, BTH; Finanzierungseinwerbung: AL, BTH.

Korrespondenz mit Bradley T. Hyman.

Menschliches Gewebe wurde vom Massachusetts Alzheimer's Disease Research Center (ADRC) mit Genehmigung des Mass General Brigham IRB (1999P009556) bereitgestellt.

Unzutreffend.

Dr. Hyman hat ein Familienmitglied, das bei Novartis arbeitet und Aktien von Novartis besitzt; Er ist Mitglied des SAB von Dewpoint und besitzt Aktien. Er ist Mitglied eines wissenschaftlichen Beirats oder Berater für AbbVie, Aprinoia Therapeutics, Arvinas, Avrobio, Axial, Biogen, BMS, Cure Alz Fund, Cell Signaling, Eisai, Genentech, Ionis, Latus, Novartis, Sangamo, Sanofi, Seer, Takeda, das US-Justizministerium, Vigil, Voyager. Sein Labor wird durch Forschungsstipendien der National Institutes of Health, des Cure Alzheimer's Fund, des Tau Consortium und der JPB Foundation sowie durch gesponserte Forschungsvereinbarungen von Abbvie, BMS und Biogen unterstützt.

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Ergänzungstabelle 1. Berechnete Fläche unter den Kurven für die Panels 1B, 1C und 1E. Ergänzende Abbildung 1. Unbeschnittene Western-Blot-Membranen zur Herstellung von Abbildung 3B. A. Primärer Antikörper der Tau-Repeat-Domäne. B. GAPDH-Primärantikörper. C. Originales Fluoreszenzbild mit der Überlagerung beider Kanäle. Die Proben wurden in der folgenden Reihenfolge geladen: 1: CRL-3275-Linie, nur mit Lipofectamin transfiziert, lösliche Fraktion, 2: CRL-3275-Linie, nur mit Lipofectamin transfiziert, unlösliche Fraktion, 3: CRL-3275-Linie, transfiziert mit Tau-Samen, lösliche Fraktion, 4: CRL-3275-Linie, transfiziert mit Tau-Samen, unlösliche Fraktion, 5: HEK293T-Klon, transfiziert nur mit Lipofectamin, lösliche Fraktion, 6: HEK293T-Klon, transfiziert nur mit Lipofectamin, unlösliche Fraktion, 7: HEK293T-Klon, transfiziert mit Tau-Samen, lösliche Fraktion, 8: HEK293T-Klon, transfiziert mit Tau-Samen, unlösliche Fraktion. Andere auf der Membran abgebildete Proben sind für das vorliegende Manuskript nicht relevant. D. Western-Blot-Quantifizierung der Tau-Repeat-Domäne, normalisiert durch die GAPDH-Expression in den CRL-3275-Zellen und dem HEK293T-Klon. Ergänzende Abbildung 2. Nachweis von Tau-Samen in Abwesenheit von Liposomen. Sowohl CRL-3275 als auch HEK293T-Klon 18 wurden 48 Stunden lang HMW- oder LMW-AD-Tau aus dem Gehirn ausgesetzt. Die Zugabe von 1 μM RAP reduzierte die verminderte Aussaat. Ergänzende Abbildung 3. Kinetik der Aggregatbildung im neuartigen Biosensor-Klon 18. Der neuartige HEK293T-Biosensor-Klon 18 wurde seriellen Verdünnungen von AD-Gehirnlysat ausgesetzt und 60 Stunden lang auf einem Live-Cell-Imager laufen gelassen. Die Aggregate wurden alle 30 Minuten quantifiziert. Die durchgezogene Linie ist der Mittelwert aus 4 Wiederholungen. Die Fläche beträgt für jeden Punkt ±SEM. Ergänzende Tabelle 2. Demografische und neuropathologische Diagnose der für die Studie verwendeten menschlichen Fälle.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Lathuliere, A., Jo, Y., Perbet, R. et al. Spezifischer Nachweis der Tau-Seeding-Aktivität bei der Alzheimer-Krankheit mithilfe rational entwickelter Biosensorzellen. Mol Neurodegeneration 18, 53 (2023). https://doi.org/10.1186/s13024-023-00643-2

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Eingegangen: 09. März 2023

Angenommen: 28. Juli 2023

Veröffentlicht: 08. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s13024-023-00643-2

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