Entwurf eines alternativen Antikörperfragmentformats, das im Zytoplasma von Escherichia coli produziert werden kann

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 14188 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Mit zunehmender Zugänglichkeit und Gewebedurchdringung erweisen sich kleinere Antikörperformate wie Antikörperfragmente (Fab) und einkettige variable Fragmente (scFv) als wirksame und kostengünstige Alternative zu Antikörpern voller Länge. Diese aus der modularen Architektur von Antikörpern abgeleiteten Formate könnten sich für bestimmte therapeutische und diagnostische Anwendungen als bahnbrechend erweisen. Mikrobielle Wirte haben sich als Produktionswirte für Antikörperfragmentformate als äußerst vielversprechend erwiesen. Allerdings führen niedrige Zielproteinausbeuten in Verbindung mit der Komplexität der Proteinfaltung zu Produktionseinschränkungen. Hier berichten wir über ein alternatives Antikörperfragmentformat „FabH3“, das darauf ausgelegt ist, einige wichtige Engpässe im Zusammenhang mit der Faltung und Produktion von Fabs zu überwinden. Das FabH3-Molekül basiert auf dem Fab-Format, wobei die konstanten Domänen durch konstruierte Immunglobulin-G1-CH3-Domänen (IgG1) ersetzt werden, die auf der Grundlage des elektrostatischen Steuerungsansatzes zur Heterodimerisierung fähig sind. Wir zeigen, dass dieses alternative Antikörperfragmentformat im Zytoplasma von E. coli unter Verwendung des katalysierten Disulfidbindungsbildungssystems (CyDisCo) in einem nativ gefalteten Zustand mit höheren löslichen Ausbeuten als sein Fab-Gegenstück und einer vergleichbaren Bindungsaffinität gegenüber dem hergestellt werden kann Zielantigen.

Unter den Biotherapeutika nimmt das Segment der monoklonalen Antikörper (Mabs) eine dominierende Marktstellung ein, dieser Trend scheint sich jedoch mit der Entwicklung neuartiger Antikörperformate und neuer Medikamente allmählich zu ändern1. Monoklonale Antikörper voller Länge haben eine lange Halbwertszeit im Umlauf, was sie für bestimmte therapeutische und diagnostische Anwendungen ungeeignet machen könnte2. Als mögliche Lösung haben sich Antikörperfragmente (Fabs) als Schlüsselakteure in der biopharmazeutischen Industrie herausgestellt. Sie bieten bestimmte Vorteile wie eine verbesserte und tiefe Tumorpenetration, Bindung an spezifische Epitope, die für Mabs unzugänglich sind, monovalente Antigenbindung mit potenziell verringerter Immunogenität, höhere Stabilität als kleinere Antikörperfragmentformate und schnellere Clearance3,4,5. Eine Vielzahl von Anwendungen antikörperbasierter Moleküle als therapeutische und diagnostische Wirkstoffe haben deren Nachfrage und damit auch den Bedarf an ihrer Produktion in hohen Ausbeuten erhöht.

Viele zugelassene Biosimilars und „Me-too“-Produkte wurden in mikrobiellen Expressionssystemen hergestellt, wobei E. coli nach wie vor ein bevorzugter Wirt ist6. Da Fab- und scFv-Antikörperfragmente nicht glykosyliert und relativ klein sind, kann ihre Produktion in E. coli einfacher und wirtschaftlicher sein als in herkömmlichen Zellkultursystemen für Säugetiere. Antikörperfragmente sind disulfidgebundene Proteine, die traditionell rekombinant im oxidierenden Periplasma oder als Einschlusskörper im reduzierenden Zytoplasma von E. coli hergestellt werden. Allerdings stellen beide Ansätze kritische Engpässe bei der effizienten Produktion dieser Proteine von Interesse dar. Die periplasmatische Expression von Fabs führt häufig zu geringen Proteinausbeuten, hauptsächlich aufgrund der ineffizienten Proteintranslokation und des geringen Volumens des Periplasmas, während die zytoplasmatische Expression Einschränkungen hinsichtlich des Proteinabbaus im nicht-nativen Zustand und der Aggregation zu Einschlusskörperchen unterliegt. Von den sieben vermarkteten Fabs werden zwei in E. coli in Form von Einschlusskörpern produziert3,7. Die Fab-Faltung ist ein komplexer Prozess, der die Bildung von Disulfidbrücken, die cis-trans-Prolylisomerisierung und die kontrollierte Oligomerisierung umfasst. Daher ist die Rückfaltung von Einschlusskörpern oft ineffizient und kostspielig8.

Fab-Fragmente bestehen aus zwei kovalent verbundenen Polypeptidketten, nämlich der schweren (HC) und der leichten (LC) Kette, die jeweils zwei konstante Domänen CH1 und CL und zwei antigenbindende variable Domänen VH und VL enthalten (Abb. 1A). Die CH1-Domäne ist isoliert ein intrinsisch ungeordnetes Protein und bleibt unabhängig von der Bildung von Disulfidbindungen in einem entfalteten Zustand9. Einer der entscheidenden geschwindigkeitsbestimmenden Schritte bei der Faltung von Antikörperfragmenten ist die Assoziation der konstanten Domänen, da die CH1-Domäne die typische Immunglobulin (Ig)-Faltung erst bei Interaktion mit der CL-Domäne annimmt9,10. Darüber hinaus rechtfertigt die geringe HC-Stabilität in Verbindung mit der Bildung kovalenter und nichtkovalent verknüpfter LC-Dimere die Notwendigkeit, die Synthese der beiden Ketten auszugleichen 11,12. Das Entwerfen und Screenen von Konstrukten mit unterschiedlichen Translationsstärken von LC und HC für eine optimale Fab-Expression kann mühsam und teuer sein und führt möglicherweise nicht unbedingt zum Erfolg. Es gab mehrere Ansätze, um eine effiziente Heterodimerisierung in einem Fab-Molekül voranzutreiben, beispielsweise Ojima-Kato et al. berichteten über die Fusion von Leucin-Zipper-Peptidpaaren mit den konstanten Domänen (Zipbody)13. Dies schränkt jedoch die therapeutische Anwendung von Fabs aufgrund der Notwendigkeit von Tag-Spaltungsschritten und den daraus resultierenden Bedenken hinsichtlich der Immunogenität ein.

Schematische Darstellung von (A) Antikörperfragment (Fab) und (B) Antikörperfragmentformat mit CH3-Domänen (FabH3). Die Umkehrung der symmetrischen Ladungskomplementarität an der CH3-Domänenschnittstelle ermöglicht die Unterdrückung der Homodimerisierung aufgrund ungünstiger abstoßender Ladungswechselwirkungen und ermöglicht so die Bildung eines Fab-ähnlichen Heterodimers.

Einschränkungen im Zusammenhang mit einer effizienten Fab-Produktion erhöhen den Bedarf an alternativen Antikörperfragmenten, die die vorteilhaften Eigenschaften von Fabs beibehalten und gleichzeitig deren Produktionsengpässe überwinden. Hier kommunizieren wir ein alternatives Antikörperfragmentformat namens „FabH3“, in dem die konstanten Domänen eines Fab-Moleküls, nämlich REGN10987 (PDB-ID: 6XDG) gegen die Rezeptorbindungsdomäne (RBD) von SARS-CoV-2, durch IgG1 ersetzt werden Domänen der schweren Kette Constant 3 (CH3) (Abb. 1B). Dadurch werden die mit der CH1-Domäne in Fabs verbundenen Einschränkungen aufgehoben. Der Grund für die Verwendung von IgG1-CH3-Domänen ist ihre hohe Löslichkeit und Stabilität gepaart mit ihrer bemerkenswerten Dimerisierungsneigung14,15. Da die Heterodimerisierung ein entscheidendes Merkmal von Fabs ist, haben wir die IgG1-CH3-Domänen mithilfe des zuvor etablierten „Charge-to-Charge-Swap-Designs“ modifiziert, das eine effiziente nicht-kovalente Heterodimerisierung der CH3-Domänen ermöglicht und die Unterdrückung der Homodimerisierung bei gleichzeitiger Reduzierung ermöglicht Thermostabilität16. Wir berichten, dass das FabH3-Format im Zytoplasma von E. coli in verschiedenen Stämmen und Kulturmedien mit vergleichsweise höheren Ausbeuten löslich produziert werden kann als das Wildtyp-Fab-Molekül. Darüber hinaus zeigen wir, dass das mit dem CyDisCo-System hergestellte REGN10987-basierte FabH3-Format ein nativ gefaltetes Heterodimer mit einer vergleichbaren Affinität zu seinem Fab-Gegenstück gegen die SARS-CoV-2-RBD ist.

In den letzten Jahrzehnten wurde über eine Reihe von Ansätzen zur Entwicklung kristallisierbarer Fragmente (Fc) für die Entwicklung bispezifischer proteinbasierter Therapien auf Basis der CH3-Heterodimerisierung berichtet17,18,19,20. Beispielsweise haben Wozniak-Knopp G. et al. berichteten über den Ersatz von CH1- und CL-Domänen durch kovalent verbundene CH3-Domänen mithilfe der „Knobs-into-Holes“-Technologie (KiH) für ein Trastuzumab-Molekül voller Länge, das in HEK293-6E-Zellen produziert wurde21. Der daraus resultierende monoklonale Antikörper mit Domänenaustausch zeigte jedoch eine geringe Löslichkeit und eine vierfach schwächere Bindungsaffinität zu seinem Ziel im Vergleich zum Ausgangsprodukt Trastuzumab. Neben der KiH-Technologie zur Ermöglichung der CH3-Heterodimerisierung ist die andere weit verbreitete Methode der asymmetrische Ladungspolaritätsansatz. Wir haben uns dafür entschieden, dies zu übernehmen, um das FabH3-Format zu testen, da es Berichten zufolge die Homodimerisierung effizienter unterdrückt als die „Knobs-in-holes“, ohne die Einführung einer zusätzlichen Disulfidbindung16,22, da dies den mit der oxidativen Faltung verbundenen Stress bei der Produktion erhöhen kann System sowie die Fehlfaltungs- und Aggregationsneigung erhöhen23.

Es wurde gezeigt, dass die IgG1-CH3-Domänenschnittstelle aus geladenen Resten besteht, die durch günstige elektrostatische Wechselwirkungen rund um einen zentralen hydrophoben Kern interagieren16,24. Da der hydrophobe Kern eine wichtige Rolle bei der Proteinfaltung und -stabilität spielt25, beinhaltet der elektrostatische Steuerungsansatz die Umkehrung der Ladungspolarität am Rand des Kerns an der Grenzfläche der CH3-Domänen, um die Heterodimerisierung gegenüber der Homodimerisierung zu begünstigen16. In dem von uns entworfenen FabH3-Konstrukt wurden die Mutationen K392D, K409D in die mit der VH-Domäne fusionierte CH3-Domäne und E356K, D399K in die mit der VL-Domäne fusionierte CH3-Domäne eingeführt (Nomenklatur basierend auf 16; PDB-ID: IL6X). Um eine ausreichende Flexibilität und Faltung der variablen Domänen zu gewährleisten und die sterische Hinderung während der Dimerisierung der CH3-Domäne zu minimieren, wurden die VH- und VL-Domänen des Ziel-Fab über flexible Linker aus Glycin- und Serinresten unterschiedlicher Länge mit den CH3-Domänen fusioniert.

Da die Schnittstellen zwischen den VL/VH- und CH3-Domänen nicht-nativ sind, besteht die Möglichkeit sterischer oder anderer Abstoßungen zwischen ihnen. Während In-silico-Modelle auf der Grundlage veröffentlichter Strukturen nahelegten, dass ein Linker mit einer Länge von nur vier Aminosäuren funktionieren könnte, wollten wir die optimale Linkerlänge zwischen Domänen experimentell validieren. Zu diesem Zweck verglichen wir die lösliche Expression von Wildtyp-REGN10987-Fab mit FabH3-Konstrukten mit unterschiedlichen Linkerlängen zwischen den variablen Domänen und CH3-Domänen mit einer Länge von 4 bis 17 Aminosäuren (Aminosäuresequenzen in der Ergänzungstabelle S1).

Da es sich bei allen interessierenden Proteinen um Disulfid-gebundene Proteine handelt, wurde ihre lösliche Expression in Gegenwart von CyDisCo-Komponenten im Zytoplasma von E. coli getestet. CyDisCo ist ein katalysiertes zytoplasmatisches Disulfidbildungssystem, das die Produktion disulfidgebundener rekombinanter Proteine in E. coli26,27 ermöglicht. Die Sulfhydryloxidase Erv1p (S. cerevisiae) katalysiert die Oxidation von Thiolen auf dem Protein unter Bildung von Disulfiden und die Isomerase PDI (H. sapiens) bewirkt die Isomerisierung nicht-nativer Disulfide und ermöglicht so die rekombinante Herstellung des Proteins in einer nativ gefalteten Form Disulfidgebundener Zustand im E. coli-Zytoplasma28.

Die SDS-PAGE-Analyse gereinigter Proteine auf Basis der immobilisierten Metallaffinitätschromatographie (IMAC) zeigte, dass FabH3 effizient in Form eines Heterodimers produziert wird, wobei die beiden Ketten im Verhältnis 1:1 vorliegen (Abb. 2). Das FabH3-Format wurde ohne weitere Prozessoptimierung in vergleichsweise höheren löslichen Ausbeuten hergestellt als das REGN10987-Wildtyp-Fab (Abb. 2). Die Linkerlänge hatte keinen Einfluss auf die Löslichkeitsausbeuten des FabH3-Formats oder das Verhältnis zwischen den Ketten. Die Linkerlänge hatte auch keinen Einfluss auf die thermische Stabilität von FabH3 (bestimmt durch Nano-Differential-Scanning-Fluorimetrie), da alle Varianten eine ähnliche Schmelztemperatur (Tm) aufwiesen (ergänzende Abbildung S1). Da die Linkerlänge keinen Einfluss auf die Löslichkeit oder die thermische Stabilität des FabH3-Formats hatte, wurden alle weiteren Analysen an FabH3 durchgeführt, das GS-G4 als Linker enthielt. Wir haben GS-G4 als Linkerlänge gewählt, da lange Linker möglicherweise zu viel strukturelle Flexibilität bieten, was für nachgelagerte Anwendungen nicht optimal sein kann, und zu kurze Linker zu sterischen oder anderen Abstoßungen zwischen Domänen für FabH3-Moleküle führen können, die auf anderen Fabs basieren.

SDS-PAGE-Analyse von IMAC-gereinigtem REGN10987 Fab und FabH3, die löslich mit CyDisCo im Zytoplasma von E. coli hergestellt wurden. FabH3-Varianten mit unterschiedlichen Linkerlängen (G: Glycin, S: Serin) wurden mit dem Wildtyp-Fab verglichen, um den Einfluss auf die Ausbeute an löslichem Protein (M: Proteinmarker) zu bestimmen. Das unbeschnittene Gelbild finden Sie in der ergänzenden Abbildung S2.

Um zu bestätigen, dass der Anstieg der löslichen Ausbeuten auf das Formatdesign zurückzuführen ist, d. h. auf die Beseitigung der mit der CH1-Domäne verbundenen Einschränkungen, und nicht auf die Expressionsbedingungen, haben wir die CyDisCo-basierte lösliche Expression von FabH3 (GS-G4-Linker) mit dem Fab-Gegenstück verglichen zwischen einem E. coli B- und K-Stamm (BL21 (DE3) bzw. MG1655) in reichhaltigen Autoinduktionsmedien. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die löslichen Ausbeuten des FabH3-Formats zwar zwischen den beiden getesteten E. coli-Stämmen vergleichbar sind, sie jedoch in beiden Stämmen etwa doppelt so hoch sind wie die des Fab-Gegenstücks (Tabelle 1). Wir untersuchten auch die CyDisCo-basierte lösliche Produktion von FabH3 und Fab in E. coli BL21 (DE3) in chemisch definierten minimalen Autoinduktionsmedien. Der Wildtyp REGN10987 Fab konnte nicht löslich produziert werden, während das FabH3-Format in löslicher Form produziert wurde, allerdings mit vergleichsweise geringeren Ausbeuten im Vergleich zu den Rich Media (Tabelle 1). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die höheren Löslichkeitsausbeuten, die für das FabH3-Format beobachtet wurden, darauf zurückzuführen sind, dass das Formatdesign unabhängig von den Expressionsbedingungen potenziell Faltungs- und Produktionsbeschränkungen des Fab-Formats überwindet.

Die Produktion disulfidgebundener therapeutischer Proteine im Zytoplasma von mikrobiellen Wirten wie E. coli stellt aufgrund ihrer begrenzten Möglichkeiten zur posttranslationalen Modifikation, die oft zu Proteinabbau und -aggregation führt, oft eine Herausforderung dar29. Obwohl der Einsatz des CyDisCo-Systems im E. coli-Zytoplasma die Produktion von REGN10987 Fab und FabH3 in löslicher Form ermöglichte, wobei letzteres vergleichsweise höhere Ausbeuten erzielte, ist die Entwicklung eines Antikörperformats, bei dem Quantität auf Qualität trifft, von größter Bedeutung. Wir haben den Faltungszustand der hergestellten Antikörperformate vor ihrer funktionellen Charakterisierung mithilfe einer Reihe orthogonaler analytischer Charakterisierungstools bewertet.

Die Sekundärstruktur des gereinigten REGN10987 Fab und FabH3 (GS-G4-Linker) wurde mittels Zirkulardichroismus (CD) untersucht. Da beide interessierenden Proteine aus Domänen bestehen, die die charakteristische Immunglobulin (Ig)-Faltung aufweisen, wurde erwartet, dass die CD-Spektren dieser Proteine Formen aufweisen, die typisch für Proteine mit einem hohen Gehalt an β-Struktur sind30. Die CD-Analyse ergab, dass beide Proteine CD-Spektren im fernen Ultraviolett (UV) mit einem Minimum um 217 nm aufwiesen, was mit einer charakteristischen Ig-Faltung übereinstimmt (Abb. 3A, B). Die Unterschiede in den Spektren können dadurch erklärt werden, dass sich gezeigt hat, dass sich die Spektren verschiedener Fab-Moleküle in Bezug auf Amplitude, Form und Abfang der Grundlinie aufgrund aromatischer Seitenketten- und/oder Disulfidbindungs-Chromophore unterscheiden31,32,33.

Fernultraviolette Zirkulardichroismus-Spektren (CD) von gereinigten Proteinen (A) REGN10987 Fab (B) REGN10987-basiertes FabH3. Beide Proteine zeigen Spektren, die mit ihrer erwarteten β-reichen Struktur der Immunglobulindomänen, dh Ig-fach, übereinstimmen.

Eine weitere Analyse mittels Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie (ESI-MS) des gereinigten REGN10987 Fab und FabH3 bestätigte, dass die Proteine die erwarteten Molekulargewichte hatten (Tabelle 2), was damit übereinstimmt, dass alle Cysteine in Disulfidbindungen vorliegen. Um das Vorhandensein freier Cysteine weiter zu bewerten, wurden die Proteine vor der massenspektrometrischen Analyse unter denaturierenden Bedingungen mit N-Ethylmaleimid (NEM) behandelt. Für die interessierenden Proteine wurde keine Massenzunahme entsprechend der NEM-Bindung (+ 125 Da) beobachtet, was die Abwesenheit freier Thiole bestätigt (Tabelle 2). Eine Kombination aus CD- und ESI-MS-Daten legt nahe, dass die mit CyDisCo im Zytoplasma von E. coli hergestellten Proteine nativ gefaltet sind.

Das Lösungsverhalten von gereinigtem REGN10987-Fab und FabH3 wurde mithilfe von SEC-MALS analysiert, um das Vorhandensein nativer Dimere sowie das Fehlen jeglicher Abbaumittel und oligomerer Spezies mit hohem Molekulargewicht zu bestimmen. Die Molekulargewichtsbestimmung der beiden Proteine unter nicht denaturierenden Bedingungen bestätigte das Vorhandensein beider in einem dimeren Zustand mit einheitlichen Molmassenpunkten, die über den Elutionspeak mit einer Genauigkeit von 2 % oder weniger berechnet wurden, was auf monodisperse Spezies hinweist (ergänzende Abbildung S4A). Die erhaltenen Ergebnisse belegen auch das Fehlen jeglicher Monomerfragmente oder oligomerer Aggregate (ergänzende Abbildung S4B).

Es ist allgemein bekannt, dass die Wildtyp-IgG1-CH3-Domäne eine äußerst thermostabile Immunglobulindomäne ist34,35. Allerdings ist die Heterodimerisierung für ein funktionelles Fab-Analogon von entscheidender Bedeutung, und die Einführung von Mutationen in der CH3-Domäne, um die Heterodimerisierung in bispezifischen monoklonalen Antikörpern zu ermöglichen, hat zuvor gezeigt, dass sie zu einer Verringerung der thermischen Stabilität führt16,17,21,24. Wir haben die thermische Stabilität des im Zytoplasma von E. coli produzierten FabH3-Formats mithilfe der Nano-Differential-Scanning-Fluorimetrie (NanoDSF) untersucht und festgestellt, dass sie mit der zuvor für das auf elektrostatischer Steuerung basierenden bispezifischen scFv-Fc-Fusionsproteinmoleküls berichteten Übereinstimmung übereinstimmt in einem Expressionssystem von Säugetieren16. Für das FabH3-Format wurde eine kooperative Entfaltung beobachtet, im Gegensatz zu der nichtkooperativen Faltung, die für sein Fab-Gegenstück beobachtet wurde (Abb. 4), in Übereinstimmung mit zuvor berichteten Entfaltungseigenschaften von λ-Lc-haltigen Fabs36. Die biphasische Fab-Entfaltung beinhaltet den Verlust der Antigenbindungsaktivität vor dem Zusammenbruch der Sekundärstruktur37. Wie aus den thermischen Entfaltungskurven hervorgeht, beginnt die Entfaltung des REGN10987-Fab vergleichsweise viel früher als bei der Schmelztemperatur (Abb. 4). Obwohl festgestellt wurde, dass das FabH3-Format eine vergleichsweise niedrigere End-Tm aufweist als das Fab, liegt es immer noch in einem Bereich, der eine brauchbare therapeutische Proteinproduktion ermöglicht, da die thermische Stabilität mit der patentierten Technologie von Amgen zur Erzeugung bispezifischer Antikörper durch elektrostatische Steuerung übereinstimmt16. 38.

Analyse der thermischen Stabilität von REGN10987 Fab und REGN10987-basiertem FabH3 mit NanoDSF. Die Einsatzpunkte für REGN10987 Fab und FabH3 lagen bei 50,0 °C bzw. 42,5 °C, während die endgültigen Tm-Werte bei 75,1 °C bzw. 59,9 °C lagen.

Eines der entscheidenden Qualitätsmerkmale, die bei der Entwicklung eines alternativen Antikörperformats untersucht werden müssen, ist die Wechselwirkung des vorgeschlagenen Moleküls mit dem Zielantigen. Die Bindungsfähigkeit eines Antikörpers ist eine Funktion der Complementarity Determining Regions (CDRs), die sich in den variablen Domänen befinden, was wiederum von der Stabilität und Assoziation der Domänenschnittstellen abhängt39.

Wir haben zuvor gezeigt, dass der mit dem CyDisCo-System hergestellte Wildtyp REGN10987 Fab funktionsfähig ist und an das Zielantigen SARS-CoV-2 RBD40 bindet. Nachdem wir sichergestellt hatten, dass das im Zytoplasma von E. coli produzierte REGN10987-FabH3 nativ gefaltet war, untersuchten wir empirisch, ob das entwickelte Molekül funktionell aktiv war, und verglichen seine Bindungsaffinität mit der des REGN10987-Fab mithilfe der Biolayer-Interferometrie (BLI). Die Bindungsaffinität zwischen Fab oder FabH3 gegenüber dem Zielantigen wurde anhand des Verhältnisses der Geschwindigkeitskonstanten der Dissoziation (kd) und der Assoziation (ka), d. h. als Funktion der Gleichgewichtsdissoziationskonstante (KD), beurteilt. Jeweils fünf Konzentrationen von Fab und FabH3 wurden parallel auf ihre Bindung an SARS-CoV-2 RBD getestet und die KD-Werte mithilfe einer globalen Fit-Analyse basierend auf einem 1:1-Interaktionsmodell bestimmt.

Sowohl Fab als auch FabH3 zeigten eine konzentrationsabhängige Bindung an das Zielantigen (Abb. 5A, B). Es wurde festgestellt, dass FabH3 eine vergleichbare Bindungsaffinität (KD = 20 ± 2,6 nM) wie sein Gegenstück REGN10987 Fab (KD = 43 ± 4,4 nM) gegen SARS-CoV-2 RBD aufweist. Die für den REGN10987-Fab beobachteten KD-Werte stimmen mit früheren Berichten überein40,41 und bestätigen damit unseren Befund. Diese Ergebnisse legen nahe, dass der Austausch konstanter Domänen in einem Fab-Molekül und die CH3-Domänen-basierte Heterodimerisierung die Faltung und Funktion der variablen Domänen nicht beeinträchtigt, sodass die Wechselwirkungen mit seinem Antigen aufrechterhalten bleiben.

Biolayer-Interferometrie (BLI)-basierte Analyse der Bindungsinteraktion zwischen (A) REGN10987 Fab, (B) REGN10987-basiertem FabH3 und der Rezeptorbindungsdomäne (RBD) von SARS-CoV-2. Beide getesteten Antikörperformate zeigen eine konzentrationsabhängige Bindung an das Zielantigen (Grau: 3 nM, Rot: 9 nM, Blau: 27 nM, Grün: 81 nM, Lila: 243 nM). Die Steady-State-Analysekurve für die Antikörper-Antigen-Wechselwirkung als Funktion der Proteinkonzentration ist in der ergänzenden Abbildung S3 dargestellt.

Fortschritte in der synthetischen Biologie, die zum zellulären Engineering mikrobieller Wirte führen, haben zu einer erhöhten Akzeptanz dieser Zellfabriken als Alternative zur Herstellung antikörperbasierter Therapeutika geführt42. Während monoklonale Antikörper die Behandlungsstrategien gegen lebensbedrohliche Krankheiten dominieren, haben Fortschritte in der Antikörpertechnik zu einer Reihe von etwa 100 verschiedenen Antikörperformaten geführt (umfassende Übersichten zu bispezifischen Antikörperformaten und -anwendungen finden Sie in 43, 44, 45). Es besteht kein Konsens über „ein ideales Format“, das für die meisten gewünschten Anwendungen geeignet ist. Vielmehr bietet die Entwicklung neuer Formate eine wertvolle Quelle zur Überwindung therapeutischer und produktionstechnischer Engpässe der aktuellen Formate.

Fab-Antikörperfragmente gehören zu den ersten untersuchten kleinen Antikörpermolekülen und haben gezeigt, dass sie eine wichtige Rolle bei diagnostischen und therapeutischen Interventionen spielen46. Angesichts der steigenden Nachfrage und des zukünftigen Potenzials von Fabs oder ihren Fusionsproteinen besteht ein ständiger Bedarf an der „Entwickelbarkeit“ dieses Formats, um effizient produziert zu werden. Aufbauend auf den Fortschritten bei der Entwicklung von Bispezifischen hat das FabH3-Format, das wir hier vorstellen, das Potenzial, bestimmte kritische Einschränkungen der Fab-Produktion in E. coli zu überwinden. Die zuvor bewährte Heterodimerisierungsstrategie der IgG1-CH3-Domäne, die hier verwendet wird, ermöglicht die Produktion heterodimerer Moleküle und verhindert so die Einschränkungen der Homodimerisierung der leichten Kette in Wildtyp-Fab-Molekülen11,47. Es ist bekannt, dass die mit der geringen intrinsischen Stabilität und Abbauneigung der CH1-Domäne in Fabs verbundenen Einschränkungen zu einer Produktion von Fabs mit geringer Ausbeute in E. coli führen3,10,48. Diese Engpässe können möglicherweise durch die starke Dimerisierungsneigung, hohe Löslichkeit und Stabilität der im vorgeschlagenen FabH3-Format verwendeten IgG1-CH3-Domänen überwunden werden. Diese Annahme wird durch die höheren löslichen Produktionsmengen des FabH3-Formats als das entsprechende Fab-Gegenstück bestätigt. Darüber hinaus ist das FabH3-Format biologisch aktiv und zeigt eine vergleichbare Bindungsaffinität wie das Fab-Format gegenüber dem Zielantigen. Obwohl berichtet wurde, dass die Wildtyp-IgG1-CH3-Domäne Redoxheterogenität aufweist, wenn sie mit CyDisCo im Zytoplasma von E. coli14 hergestellt wird, verlangsamt die Unterdrückung der Homodimerisierung möglicherweise die Faltungsgeschwindigkeit, was die Bildung von Disulfidbindungen und damit die native Faltung ermöglicht. Dies ist nicht der erste Bericht, der IgG-CH3-Homodimere oder -Heterodimere als Gerüste für die Produktion von Antikörperformaten verwendet, z. B. scDb-CH3 (KiH), Di-Diabody, Minibody usw.49,50,51. Nach unserem besten Wissen ist dies jedoch der erste Bericht über ein alternatives Fab-Format, das auf der CH3-Domänen-Heterodimerisierung basiert und mit dem CyDisCo-System im Zytoplasma von E. coli effizienter hergestellt werden kann.

Basierend auf dem hier berichteten „Proof-of-Concept“ kann dieses Formatdesign eine potenzielle Lösung für Fabs sein, die mit Produktionsengpässen konfrontiert sind. Die allgemeine Anwendbarkeit dieses Formats muss jedoch empirisch ermittelt werden, da sie von den Schnittstelleninteraktionen zwischen der variablen und der CH3-Domäne sowie der Löslichkeit der Partner der variablen Domäne abhängt. Mögliche zukünftige Arbeiten können die Entwicklung des FabH3-Formats umfassen, um die thermische Stabilität auf der Grundlage der zuvor berichteten ZW-Heterodimer-Varianten zu verbessern52. Darüber hinaus kann auch Protein-Engineering durchgeführt werden, um die Anwendbarkeit des FabH3-Formats auf der Grundlage von Fab-Fusionsproteinen für eine Vielzahl therapeutischer und diagnostischer Anwendungen zu erweitern53,54. Es wurde gezeigt, dass Mutationen in der IgG1-CH3-Domäne die Fcγ-Rezeptor-Interaktion ohne Glykosylierung fördern55. Da diese Mutationen in einem mikrobiellen Wirt produziert werden können, können sie möglicherweise auf das FabH3-Format angewendet werden, um die Halbwertszeit zu erhöhen und Effektorfunktionen für bestimmte therapeutische Anwendungen zu bewirken56.

Alle hier beschriebenen Expressionsvektoren wurden unter Verwendung von Standardtechniken der Molekularbiologie konstruiert (siehe Ergänzungstabelle S2 für die in dieser Studie verwendeten Vektoren). Ein polycistronisches Gen für den REGN10987-Wildtyp-Fab wurde codonoptimiert (GenScript Biotech Corp.) für die E. coli-Expression synthetisiert. Das Gen für die schwere Kette mit einem C-terminalen Hexahistidin-Tag wurde stromabwärts des Gens für die leichte Kette platziert und unter Verwendung von Xba1-EcoR1-basiertem Restriktionsverdau und Ligation in einem modifizierten pET23-basierten Vektor kloniert, wobei der T7-Promotor durch einen pTac-Promotor ersetzt wurde um den Vektor pAAT5026,40 zu erzeugen. Gene für die schweren und leichten Ketten von REGN10987-basierten FabH3-Varianten mit unterschiedlichen Linkerlängen wurden codonoptimiert (GenScript Biotech Corp.) für die E. coli-Expression synthetisiert. Diese Gene wurden mithilfe von Nde1-EcoR1-basiertem Restriktionsverdau und Ligation in denselben Rückgratvektor kloniert. Um einen polycistronischen Vektor mit einer ähnlichen Platzierung der Gene wie beim Wildtyp-Fab zu erzeugen, wurde das Gen für die VH-Domäne, fusioniert mit einer IgG1-CH3-Domäne (K392D, K409D) mit einem C-terminalen Hexahistidin-Tag, stromabwärts des Gens für die VL platziert Domäne fusioniert mit einer IgG1-CH3-Domäne (E356K, D399K). Das Gen für die schwere Kette von FabH3 wurde unter Verwendung von Xba1/Spe1-Xho1-basiertem Restriktionsverdau und Ligation in den Vektor kloniert, der die leichte Kette von FabH3 enthielt, um die Vektoren pAAT202–pAAT207 zu erzeugen. Gereinigte Plasmidvektoren wurden mit dem EZNA Plasmid DNA Mini Kit I (Omega Bio-Tek Inc.) erhalten und die Reinigung von DNA aus Agarosegelen wurde mit dem Gene/PCR DNA Fragments Extraction Kit (GeneAid Biotech) durchgeführt, jeweils gemäß den Richtlinien des Herstellers . Alle Geninserts in den konstruierten Vektoren wurden vor den Expressionstests vollständig sequenziert, um Fehler in den klonierten Genen zu vermeiden.

Erste Tests zum Screening der FabH3-Varianten mit mehreren Linkerlängen und zum Vergleich der löslichen Expressionsausbeuten wurden in 24-Deep-Well-Platten (DWPs) durchgeführt. Das polycistronische Plasmid mit den interessierenden Genen und das polycistronische Plasmid mit den CyDisCo-Komponenten Erv1p und PDI (pMJS205)26 wurden zur Cotransformation chemisch kompetenter E. coli BL21 (DE3) verwendet und über Nacht bei 37 °C auf Lysogeny Broth (LB)-Agar inkubiert Platten mit den entsprechenden Antibiotika (35 µg/ml Chloramphenicol für pLysS-Derivate und 100 µg/ml Ampicillin für pET23-Derivate). Die nach Wachstum über Nacht erhaltenen transformierten Kolonien wurden verwendet, um 2 ml LB-Medium, ergänzt mit 4 g/L Glucose und geeigneten Antibiotika pro Vertiefung, in einem 24-DWP zu inokulieren, das mit sauerstoffdurchlässigen AirOTop-Membranen (Thomson) bedeckt war. Diese Starterkulturen ließ man etwa 6–8 Stunden lang bei 30 °C und 250 U/min (2,5 cm Gyrationsradius) wachsen. Expressionskulturen, die 3 ml autoklaviertes Terrific-Bouillon-Autoinduktionsmedium (Formedium), ergänzt mit 0,8 % Glycerin und geeigneten Antibiotika pro Vertiefung, enthielten, wurden mit den Starterkulturen im Verhältnis 1:100 beimpft. Die Expressionskulturen wurden bei 30 °C und 250 U/min in 24 Deep-Well-Platten gezüchtet, die mit sauerstoffdurchlässigen AirOTop-Membranen (Thomson) bedeckt waren, um eine effiziente Sauerstoffversorgung für etwa 23–24 Stunden sicherzustellen. Die lösliche Fraktion des Zelllysats wurde verwendet, um die weiteren Reinigungs- und SDS-PAGE-Analyseschritte durchzuführen, um die Expressionsausbeuten löslicher Proteine zu bestimmen und zu vergleichen.

Zur Ertragsquantifizierung und zum Vergleich wurden pAAT50 oder pAAT203 zusammen mit pMJS205 zur Cotransformation chemisch kompetenter E. coli BL21(DE3)- oder MG1655-Zellen verwendet und auf LB-Agarplatten mit geeigneten Antibiotika gezüchtet. Expressionskulturen, die 20 ml autoklaviertes Terrific-Brühe-Autoinduktionsmedium (Formedium), ergänzt mit 0,8 % Glycerin, oder chemisch definierte minimale Autoinduktionsmedien, hergestellt gemäß 57, enthielten, wurden mit Starterkulturen im Verhältnis 1:100 beimpft. Die Expressionskulturen wurden mit sauerstoffdurchlässigen AirOTop-Membranen (Thomson) bedeckt und in 250-ml-Schüttelkolben bei 30 °C und 250 U/min für 23–24 Stunden für reichhaltige Medien und ~ 40 Stunden für chemisch definierte Medien gezüchtet. Die endgültigen optischen Dichtewerte der Kulturen wurden bei 600 nm gemessen und lagen im Bereich von 24,0–26,5 und 18,5–20,0 für E. coli BL21 (DE3) bzw. MG1655 in Rich Media und 15,0–17,0 für E. coli BL21 (DE3) bzw. MG1655 in Rich Media. coli BL21 (DE3) in chemisch definierten Medien. Die Proteinausbeuten wurden aus IMAC-gereinigten Fraktionen der löslichen Lysate in dreifacher Ausfertigung mittels Densitometrieanalyse unter Verwendung von gereinigtem REGN10987-Fab oder FabH3 als Konzentrationsstandards berechnet. Die densitometrische Analyse zur Bestimmung der Zielproteinausbeuten wurde mit der ImageJ-Software durchgeführt.

Nach Abschluss des Expressionsscreenings im kleinen Maßstab wurden E. coli BL21 (DE3)-Zellen, transformiert mit den Vektoren für REGN10987-Wildtyp-Fab (pAAT50) oder FabH3 mit einem GS-G4-Linker (pAAT203), zusammen mit dem Vektor für CyDisCo-Komponenten ( pMJS205) wurden in 1-L-Kolben gezüchtet, die 100 ml des Terrific-Bouillon-Autoinduktionsmediums (Formedium) enthielten. Diese Kulturflaschen wurden mit sauerstoffdurchlässigen AirOTop-Membranfiltern (Thomson) abgedeckt, um eine effiziente Sauerstoffversorgung zu gewährleisten, und bei 30 °C und 250 U/min für 23–30 Minuten inkubiert. 24 Std.

Die Kulturen im kleinen Maßstab in 24 DWPs oder Schüttelkolben wurden durch Zentrifugation bei 6500 × g und 4 °C geerntet und die Zellpellets wurden in 3 ml bzw. 20 ml Lysepuffer (50 mM Natriumphosphat, pH 7,4, 20 μg/l) resuspendiert. ml DNase, 0,1 mg/ml Eiweiß-Lysozym), 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und bei −20 °C eingefroren. Die Zellen wurden durch Einfrieren und Auftauen lysiert und da die interessierenden Proteine einen Hexahistidin-Tag enthalten, wurden sie nach der Clearance des Zelllysats durch standardmäßige immobilisierte Metallaffinitätschromatographie (IMAC) unter Verwendung von HisPur Cobalt Superflow Agarose (Thermo Scientific)-Harz unter nativen Bedingungen gereinigt Zentrifugation (4000 U/min, 20 min, 4 °C). Das für die Kobalt-IMAC-basierte Reinigung befolgte Protokoll wurde in14 beschrieben.

Für die Großkulturen in 1-L-Kolben wurden die Zellen geerntet und die lösliche Fraktion des Lysats zur Reinigung wie in40 beschrieben verarbeitet. REGN10987-Wildtyp-Fab und FabH3 (GS-G4-Linker) wurden mithilfe einer Kombination aus zwei Chromatographieschritten gereinigt: Nickelbasierte immobilisierte Metallaffinitätschromatographie (IMAC) und Anionenaustauschchromatographie (AnEx). Das detaillierte Protokoll für diese beiden Chromatographieschritte wurde in40 beschrieben. Das nach dem AnEx-Schritt erhaltene gereinigte Protein wurde in 20 mM Phosphat, 150 mM NaCl, pH 6,5 für REGN10987 Fab und pH 6,0 für FabH3 gepuffert. Aliquote der gereinigten Proteinfraktionen wurden mit flüssigem Stickstoff schockgefrostet und bis zur weiteren Analyse bei –20 °C gelagert. Die Methode zur Herstellung und Reinigung der mit mutiertem verkürztem DsbC (mtDsbC) markierten SARS-CoV-2-Rezeptorbindungsdomäne (RBD) wurde ausführlich in40 beschrieben.

Fernultraviolette Zirkulardichroismus-Spektren (CD) der gereinigten Proteine wurden mit einem Chirascan-Plus-Spektrophotometer gemessen. Die Scans wurden in Duplikaten als durchschnittlich 3 Scans bei 22 °C unter Verwendung einer Küvette mit einer Pfadlänge von 0,1 cm, einer spektralen Bandbreite und Schrittgröße von 1 nm und einer Scangeschwindigkeit von 1 nm/s durchgeführt. Für die Messung wurde ein Wellenlängenbereich von 195–250 nm verwendet und für die Scans wurde ein Hochspannungswert (HT) von unter 800 V sichergestellt. Die Endkonzentration der gereinigten Proteinprobe (in 20 mM Phosphat, 150 mM NaCl, pH 6,0/6,5), die für die Analyse verwendet wurde, betrug 0,1 mg/ml, verdünnt in hochreinem Wasser. Das endgültige Spektrum wurde als Durchschnitt der Scans erhalten und der Leerwert abgezogen.

Die thermische Stabilität der Proteine wurde von NanoDSF unter Verwendung des Prometheus NT.48-Systems (NanoTemper Technologies, Deutschland) in dreifacher Ausfertigung bewertet. Die gereinigten Proteine von Interesse wurden unter Verwendung eines Microcon-10-kDa-Zentrifugalfilters (Merck, USA) in 20 mM Natriumphosphat, pH 7,4, gepuffert und in Standardkapillaren (10 µL) der NanoDSF-Qualität geladen. Diese beladenen Proben wurden dann einem programmierten Temperaturanstieg (1 °C/Minute) von 20 °C auf 90 °C unterzogen. Zur Messung des Fluoreszenzsignals, das aus der thermischen Denaturierung des Proteins bei 330 nm und 350 nm resultiert, wurde ein dualer UV-Detektor verwendet. Die erste Ableitung des Verhältnisses zwischen den beiden Signalen wurde zur Bestimmung des/der Wendepunkte verwendet und die Schmelztemperatur (Tm) wurde mit der PR.ThermControl-Software (NanoTemper Technologies) berechnet.

SEC-MALS-Tests wurden auf einem Shimadzu HPLC-System mit einem Inline-UV-Detektor, einem RI-Detektor (Optilab, Wyatt Technology) und einem MALS-Detektor (miniDAWN, Wyatt Technology) durchgeführt. Die Trennung der gereinigten Proteine (1,5 mg/ml) wurde auf einer Superdex™ 200 Erhöhung 10/300 GL (Cytiva)-Säule bei einer Flussrate von 0,5 ml/min unter Verwendung von 20 mM Phosphat, 150 mM NaCl, pH 6,0, gefiltert, durchgeführt mit 0,1 μm Membran als mobile Phase. Die Datenverarbeitung und -analyse wurde mit der ASTRA-Software Version 7.3.2.19 (Wyatt Technology) durchgeführt.

Die Molekulargewichtsanalyse der gereinigten Proteine wurde mittels Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie in Kombination mit Flüssigkeitschromatographie (LC-ESI-MS) unter Verwendung eines Q-Exactive Plus-Massenspektrometers (Waters, MA, USA) durchgeführt. 0,5 mg/ml des gereinigten Proteins von Interesse wurden zunächst einer Denaturierung mit 5 M Guanidinhydrochlorid unterzogen. Nach der Denaturierung wurden NEM-eingefangene Proben mit 10 mM NEM behandelt, 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und die Alkylierungsreaktion wurde dann vor der Analyse mit 0,5 % Trifluoressigsäure (TFA) gequencht. Bei den nicht mit NEM eingeschlossenen Proben wurden den denaturierten Proteinproben vor der Analyse direkt 0,5 % TFA zugesetzt. Das experimentelle Molekulargewicht (Mexp) des Proteins wurde durch massenspektrometrische Analyse ermittelt und das theoretische Molekulargewicht (Mtheor) wurde mit dem ExPasy ProtParam Tool58 basierend auf der Aminosäuresequenz der Proteine berechnet.

Vor der In-vitro-Interaktionsanalyse wurde das gereinigte Antigen mtDsbC-SARS-CoV-2 Wildtyp einer Biotinylierung unter Verwendung des in40 beschriebenen Protokolls unterzogen. Die In-vitro-Wechselwirkung des biotinylierten Antigens mit Wildtyp-REGN10987-Fab und FabH3 wurde mit einem Octet RED384-Gerät (ForteBio, USA) analysiert. Die Tests wurden unter kontinuierlichem Rühren bei 1000 U/min und 30 °C durchgeführt. Alle Messungen wurden mit 1X Phosphate Buffer Saline (PBS) Kinetics Buffer (ForteBio) in 96-Well-Platten durchgeführt. Nach Erhalt einer anfänglichen Basislinie mit dem Laufpuffer wurden 5 µg/ml des biotinylierten Antigens 600 s lang auf Streptavidin (SA) Dip and Read™ Biosensors (ForteBio) immobilisiert. Jeweils fünf verschiedene Konzentrationen des gereinigten REGN10987 Fab und FabH3 wurden auf ihre Bindung an das Antigen getestet. Die Datenanalyse wurde mit der Octet Data Analysis High Throughput (HT)-Software 11.0 durchgeführt.

Die in dieser Studie präsentierten Daten sind im Artikel und im Zusatzmaterial enthalten. Die Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Diese Arbeit wurde durch das People-Programm (Marie-Skłodowska-Curie-Maßnahmen) des Horizont-2020-Programms der Europäischen Union im Rahmen der REA-Zuschussvereinbarung Nr. finanziert. 813979 (GEHEIMNISSE). Wir danken für die Nutzung der Einrichtungen der Kerneinrichtungen des Biocenter Oulu, einem Mitglied des Biocenter Finland. Besonderer Dank geht an Dr. Ulrich Bergmann und Dr. Hongmin Tu für ihre Hilfe bei der Massenspektrometrie bzw. Bioschicht-Interferometrie-Analyse.

Forschungseinheit für Protein- und Strukturbiologie, Fakultät für Biochemie und Molekulare Medizin, Universität Oulu, 90220, Oulu, Finnland

Aatir A. Tungekar & Lloyd W. Ruddock

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Experimentelle Untersuchung und Analyse AAT, Betreuung: LWR, Konzeptualisierung LWR, Manuskripterstellung und -bearbeitung: AAT, Manuskriptprüfung und -bearbeitung: LWR, Finanzierung: LWR Alle Autoren haben das Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Lloyd W. Ruddock.

Ein Patent für das CyDisCo-System liegt bei der Universität Oulu: Methode zur Herstellung nativ gefalteter Proteine in einem prokaryotischen Wirt (Patentnummer 9238817; Datum des Patents 19. Januar 2016). Erfinder: Lloyd W. Ruddock. Der andere Autor erklärt kein konkurrierendes Interesse.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Tungekar, AA, Ruddock, LW Design eines alternativen Antikörperfragmentformats, das im Zytoplasma von Escherichia coli produziert werden kann. Sci Rep 13, 14188 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-41525-3

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Eingegangen: 23. Mai 2023

Angenommen: 28. August 2023

Veröffentlicht: 30. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-41525-3

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