Die 18S-rRNA-Gene von Haemoproteus (Haemosporida, Apicomplexa)-Parasiten europäischer Singvögel mit Anmerkungen zu einer verbesserten Parasitendiagnostik

Malaria Journal Band 22, Artikelnummer: 232 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Es wird angenommen, dass sich die nuklearen ribosomalen RNA-Gene von Plasmodium-Parasiten nach einem Geburt-und-Tod-Modell entwickeln, wobei neue Varianten durch Duplikation entstehen und andere gelöscht werden. Für einige Plasmodium-Arten wurde gezeigt, dass bestimmte Varianten der 18S-rRNA-Gene in Wirbeltierwirten und Mückenvektoren unterschiedlich exprimiert werden. Das zentrale Ziel bestand darin, zu bewerten, ob hämosporidische Vogelparasiten der Gattung Haemoproteus auch im Wesentlichen unterschiedliche 18S-Varianten aufweisen, wobei der Schwerpunkt auf Abstammungslinien der Artengruppen Haemoproteus majoris und Haemoproteus belopolskyi lag.

Die nahezu vollständigen 18S-rRNA-Gene von 19 Haemoproteus-Linien der Untergattung Parahaemoproteus, die bei Sperlingsvögeln aus der Paläarktis häufig vorkommen, wurden sequenziert. Die PCR-Produkte von 20 Blut- und Gewebeproben mit 19 Parasitenlinien wurden einer molekularen Klonierung unterzogen, und im Mittel wurden jeweils zehn Klone sequenziert. Die Sequenzmerkmale wurden analysiert und phylogenetische Bäume berechnet, einschließlich zuvor veröffentlichter Sequenzdaten von acht weiteren Parahaemoproteus-Linien. Die geografische und Wirtsverteilung aller 27 Abstammungslinien wurde als CytB-Haplotyp-Netzwerke und Kreisdiagramme visualisiert. Basierend auf den 18S-Sequenzdaten wurden artspezifische Oligonukleotidsonden entwickelt, die durch In-situ-Hybridisierungstests auf die Parasiten im Wirtsgewebe abzielen.

Die meisten Haemoproteus-Linien hatten wie viele Plasmodium-Arten zwei oder mehr Varianten des 18S-Gens, aber die maximalen Abstände zwischen den Varianten waren im Allgemeinen geringer. Darüber hinaus gruppierten sich, anders als bei den meisten Säugetier- und Vogel-Plasmodium-Arten, die 18S-Sequenzen aller Parasitenlinien bis auf eine in reziprok monophyletischen Kladen. Erheblich unterschiedliche 18S-Cluster wurden nur in Haemoproteus tartakovskyi hSISKIN1 und Haemoproteus sp. gefunden. hROFI1. Das Vorhandensein chimärer 18S-Varianten in einigen Haemoproteus-Linien weist darauf hin, dass sich ihre ribosomalen Einheiten eher in einer halbkonzertierten Art und Weise entwickeln als nach einem strengen Modell der Evolution von Geburt und Tod.

Parasiten der Untergattung Parahaemoproteus enthalten unterschiedliche 18S-Varianten, die intraspezifische Variabilität ist jedoch geringer als bei den meisten Säugetier- und Vogelarten von Plasmodium. Die neuen 18S-Daten bieten eine Grundlage für gründlichere Untersuchungen zur Entwicklung von Haemoproteus-Parasiten im Wirtsgewebe mithilfe von In-situ-Hybridisierungstechniken, die auf bestimmte Parasitenlinien abzielen.

Die ribosomalen RNAs bilden den Kernbestandteil der Ribosomen, die für die Proteinsynthese in allen Zellen essentiell sind. Die ribosomalen Kerneinheiten von Eukaryoten enthalten die Gene für 18S-rRNA, 5,8S-rRNA und 28S-rRNA, getrennt durch die internen transkribierten Spacer ITS1 und ITS2. Die 5S-rRNA-Gene befinden sich in verschiedenen Genomregionen. Die 18S-rRNA ist Teil der kleinen ribosomalen Untereinheit (SSU), und 28S-rRNA, 5,8S-rRNA und 5S-rRNA sind Teil der großen ribosomalen Untereinheit (LSU). Die ribosomalen Einheiten der meisten Eukaryoten sind in Clustern von Tandemwiederholungen auf einem oder mehreren Chromosomen angeordnet, wobei jeder Cluster mehrere Kopien ribosomaler Einheiten enthält. Aufgrund funktioneller Einschränkungen gehören die nuklearen ribosomalen RNAs zu den am besten konservierten Genen in Eukaryoten. Es wird angenommen, dass sich ribosomale Einheiten nach einem Modell der konzertierten Evolution entwickeln, das zur Homogenisierung führt [1, 2]. Zu den Mechanismen der konzertierten Evolution gehören wahrscheinlich ungleiche Überkreuzungen während der Rekombination, Genduplikation und interchromosomalen Genumwandlung [3]. Allerdings sind die nuklearen ribosomalen Gene von Plasmodium-Parasiten eine Ausnahme, da angenommen wird, dass sich ihre ribosomalen Einheiten nach einem Geburt-und-Tod-Modell entwickeln, wobei neue Varianten durch Duplikation entstehen und andere gelöscht werden [4]. Studien an den 18S-rRNA-Genen menschlicher und Nagetier-Plasmodium-Arten ergaben, dass die Sequenzen einzelner Einheiten erheblich variieren können [5] und dass bestimmte Varianten in den Wirbeltier- und Mückenwirten unterschiedlich exprimiert werden [6]. Die in den Wirbeltierwirten und Mückenvektoren exprimierten 18S-Sequenzen wurden als A-Typ- bzw. S-Typ-Varianten bezeichnet [6, 7]. Dieses Muster wurde bei Nagetier-, Affen- und menschlichen Plasmodium-Arten (mit Ausnahme von Plasmodium malariae) gefunden, wobei sich A-Typ und S-Typ um 10 % bis 17 % unterscheiden [8].

Die erste umfassende Studie über nukleäre ribosomale Gene von hämosporidischen Vogelparasiten wurde von Harl et al. veröffentlicht. [8], der die 18S-Gene von sieben Plasmodium-, neun Haemoproteus- und 16 Leucocytozoon-Linien sequenzierte. Die meisten untersuchten Vogel-Plasmodium-Linien weisen auch Cluster unterschiedlicher 18S-Varianten auf, die sich um bis zu 14,9 % unterscheiden. Ein ähnliches Muster wurde in der Leucocytozoon toddi-Gruppe gefunden, aber die 18S-Sequenzen anderer Leucocytozoon- und Haemoproteus-Parasiten waren weniger variabel und es fehlten stark divergierende Variantencluster, mit Ausnahme von Haemoproteus tartakovskyi [8].

Die Gattung Haemoproteus umfasst derzeit etwa 180 morphologisch beschriebene Arten, es liegen jedoch molekulargenetische Daten von weniger als der Hälfte der Arten vor [9]. Die MalAvi-Datenbank (http://130.235.244.92/Malavi/; abgerufen im Dezember 2022) enthält mehr als 1500 einzigartige Haemoproteus-Linien, die die gesamte oder fast die gesamte 478 bp große CytB-Barcode-Region abdecken. Die überwiegende Mehrheit wurde noch nicht mit Morphospezies in Verbindung gebracht, daher machen die bekannten Arten nur einen Bruchteil der Artenvielfalt aus. Die Gattung umfasst die beiden Untergattungen Haemoproteus und Parahaemoproteus. Parasiten der Untergattung Haemoproteus kommen vor allem bei Vögeln der Ordnungen Columbiformes, Suliformes und Charadriiformes vor und werden durch Lausfliegen (Hippoboscidae) übertragen. Parasiten der Untergattung Parahaemoproteus sind bei Sperlingsvögeln weltweit, insbesondere auf der Nordhalbkugel, äußerst vielfältig und werden durch Stechmücken (Ceratopogonidae) übertragen.

Für die vorliegende Studie wurden die 18S-rRNA-Gene von 19 Haemoproteus-Linien sequenziert. Etwa die Hälfte der untersuchten Abstammungslinien sind derzeit mit den Gruppen Haemoproteus majoris (hCCF5, hCWT4, hEMSPO03, hPARUS1, hPHSIB1 und hWW2) und Haemoproteus belopolskyi (hACDUM2, hARW1, hMW3 und hSW1) verbunden, zu denen einige der häufigsten Vogelarten gehören Hämosporidische Abstammungslinien bei paläarktischen Sperlingsvögeln. Darüber hinaus wurden die 18S-Sequenzen von Haemoproteus balmorali hCOLL3, Haemoproteus fringillae hCCF3, Haemoproteus sp. hROFI1, Haemoproteus nucleokondensus hGRW01, Haemoproteus parabelopolskyi hSYAT02, Haemoproteus payevskyi hRW1, Haemoproteus cf. magnus hCCF6 und die noch nicht verknüpften Abstammungslinien hCCF2 und hCWT7. Die Sequenzen von acht Haemoproteus-Linien, die zuvor von Harl et al. [8] wurden in die Analysen einbezogen.

Die Hauptfrage war, ob aviäre Haemoproteus-Parasiten wie viele Plasmodium-Arten Cluster unterschiedlicher 18S-Varianten aufweisen, was darauf hindeutet, dass ihre ribosomalen Gene auch in den Vogelwirten und Dipterenvektoren unterschiedlich exprimiert werden könnten. Darüber hinaus stellen die ribosomalen Gene einen großen Teil der RNA-Moleküle in Zellen dar und sind daher geeignete Ziele für molekulargenetische Ansätze wie In-situ-Hybridisierungstests. Die 18S-Sequenzen bildeten die Grundlage für die Entwicklung art-/linienspezifischer Oligonukleotidsonden, die zur gezielten Bekämpfung von Parasiten in histologischen Schnitten und zur Differenzierung von Parasiten bei Koinfektionen verwendet werden können.

Für die vorliegende Studie wurden die 18S-rRNA-Gene von 19 Haemoproteus-Linien sequenziert, die in Passeriform-Vögeln in der Paläarktis gefunden wurden. Die Proben waren Teil der Sammlungen des Naturforschungszentrums in Vilnius (Litauen) und des Instituts für Pathologie der Veterinärmedizinischen Universität Wien (Österreich). Wildvögel wurden zwischen 2018 und 2021 in der Ornithologischen Station am Kap Ventė (Litauen) mit stationären Fallen (große „Rybachy“-, Zickzack- und Trichterfallen) und Nebelnetzen gesammelt und nach Punktion der Brachialvene wurden Blutproben mit heparinisierten Mikrokapillaren entnommen . Mit frischen Blutstropfen wurden Blutflecken auf Filterpapier für die DNA-Analyse und mehrere Blutausstriche auf Objektträgern für die mikroskopische Untersuchung vorbereitet. Die Blutausstriche wurden eine Minute lang in absolutem Methanol fixiert und dann mit 10 % Giemsa gefärbt [10]. Die Blutausstriche wurden durch mikroskopische Untersuchung analysiert und 60 Vögel mit hoher Parasitämie wurden gemäß den Genehmigungen durch Enthauptung eingeschläfert (siehe Ethische Erklärung). Bei der routinemäßigen Vogelberingung an der Biologischen Station Neusiedler See (Illmitz, Burgenland) im Jahr 2018 wurden wie oben beschrieben Blutproben von zwei Vögeln (AH1663 und AH1664) entnommen. Von einem toten Vogel (AH2023), der 2020 für eine Citizen-Science-Studie an das Institut für Pathologie (Vetmeduni Vienna) geschickt wurde [11], wurden Gewebeproben (Leber) entnommen und zur DNA-Analyse bei minus 80 °C gelagert. Organproben der toten Vögel wurden in Formalin fixiert und in Paraffin (FFPE) eingebettet und in der Gewebesammlung des Instituts für Pathologie (Vetmeduni Vienna) deponiert. Belege aus Blutausstrichen der litauischen Proben wurden im Naturforschungszentrum hinterlegt. Die DNA wurde entweder aus Blutflecken auf Filterpapier oder aus gefrorenem Lebergewebe mit dem DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN, Venlo, Niederlande) isoliert. Für die Isolierung von DNA aus Gewebe wurde das Protokoll des Herstellers befolgt, jedoch wurden zwei Eluate von jeweils 100 µl aus derselben Säule hergestellt, das erste bei 8.000 U/min und das zweite bei 13.000 U/min. Das zweite Eluat wurde für die PCRs verwendet. Informationen zu den für die vorliegende Studie analysierten Proben finden Sie in Tabelle 1. Die Tabelle enthält auch Informationen zu den Proben, die von [8] untersucht wurden, der zuvor 18S-Sequenzen von acht Parahaemoproteus-Linien veröffentlicht hat.

Der von [12] beschriebene Nested-PCR-Assay wurde verwendet, um ein 478-bp-Fragment des Cytochrom-B-Gens (CytB) zu erhalten, der üblichen DNA-Barcodesequenz für hämosporidische Vogelparasiten. PCRs wurden unter Verwendung der Primer HaemNFI (5′-CAT ATA TTA AGA GAA NTA TGG AG-3′) und HaemNR3 (5′-ATA GAA AGA TAA GAA ATA CCA TTC-3′) in der ersten PCR und HaemF (5 ′-ATG GTG CTT TCG ATA TAT GCA TG-3′)/HaemR2 (5′-GCA TTA TCT GGA TGT GAT AAT GGT-3′) und HaemFL (5′-ATG GTG TTT TAG ATA CTT ACA TT-3′) /HaemR2L (5′-CAT TAT CTG GAT GAG ATA ATG GNG C-3′) in den verschachtelten PCRs [12]. Die Primer CytB_HPL_intF1 (5′-GAG AAT TAT GGA GTG GAT GGT G-3′) und CytB_HPL_intR1 (5′-ATG TTT GCT TGG GAG CTG TAA TC-3′) [8] wurden verwendet, um 885-bp-Abschnitte des CytB zu erhalten , die zur Berechnung der phylogenetischen Bäume verwendet wurden.

Um die fast gesamten 18S-rRNA-Gene der Haemoproteus-Linien zu amplifizieren, werden die Primer 18S_H_1F (5′-TGG TTG ATC TTG CCA GTA ATA TAT GT-3′) und 18S_H_1R (5′-CGG AAA CCT TGT TAC GAC TTTTG-3′) verwendet. verwendet, die sich am 5′-Ende bzw. 22 bp vom 3′-Ende des 18S befinden [8]. Da sich die 18S-Sequenzablesungen einiger Haemoproteus-Linien nicht überlappten, wurden die Haemoproteus-spezifischen Primer 18S_H_int_F (5′-AGA TCA AGT TGA AGT GCC AGC ATT-3′) und 18S_H_int_R (5′-CGT TAA ACA CGC GAC GTC-3′) verwendet. ) wurden entworfen, die etwa 550 bp und 1700 bp vom 5′-Ende des 18S entfernt liegen, um einen 1100 bp langen Abschnitt zu sequenzieren, der den mittleren Teil abdeckt. Letztere Primer zielen nur auf die 18S-rRNA-Gene der Untergattung Parahaemoproteus ab, nicht jedoch auf die der genetisch stark divergierenden Untergattung Haemoproteus [8].

Die PCRs, die auf den 478 bp großen CytB-Barcode-Abschnitt abzielten, folgten dem Protokoll von [12] und wurden unter Verwendung der GoTaq® G2 Flexi DNA Polymerase (Promega, Wisconsin, Madison, USA) durchgeführt. Die PCRs begannen mit einer anfänglichen Denaturierung für 2 Minuten bei 94 °C, gefolgt von 35 Zyklen mit 30 Sekunden bei 94 °C, 30 Sekunden bei 50 °C, 1 Minute bei 72 °C und einer abschließenden Verlängerung für 10 Minuten bei 72 °C °C. Jeweils 1 µl des ersten PCR-Produkts wurde als Vorlage in den beiden verschachtelten PCRs verwendet. Die PCRs, die auf das 885 bp große CytB-Fragment abzielten, wurden mit dem GoTaq® Long PCR Master Mix (Promega, Wisconsin, Madison, USA) durchgeführt. Die PCRs begannen mit einer anfänglichen Denaturierung für 2 Minuten bei 94 °C, gefolgt von 35 Zyklen mit 30 Sekunden bei 94 °C, 30 Sekunden bei 55 °C, 2 Minuten bei 68 °C und einer abschließenden Verlängerung für 10 Minuten bei 72 °C °C. Die PCRs, die auf die 18S-Sequenzen abzielten, wurden mit dem GoTaq® Long PCR Master Mix unter den gleichen Bedingungen, jedoch mit einer Verlängerungszeit von 2 Minuten, durchgeführt. Es wurden jeweils zwei PCRs durchgeführt, um ausreichend PCR-Produkt für die direkte Sequenzierung und molekulare Klonierung zu erhalten. Die PCR-Produkte wurden auf 1 % LB-Agarose-Gelen sichtbar gemacht und zur Reinigung und Sequenzierung in beide Richtungen unter Verwendung der PCR-Primer an Microsynth Austria GmbH (Wien, Österreich) geschickt.

Die 18S-PCR-Produkte wurden dann weiterverarbeitet und einer molekularen Klonierung unterzogen, wie in [8] beschrieben. Jeweils 20 µl PCR-Produkt wurden auf 1 % LB-Agarose-Gelen laufen gelassen und die Banden wurden mit Flammenspateln herausgeschnitten. Die Gelbanden wurden mit dem QIAquick Gel-Extraction Kit (QIAGEN) nach dem Standardprotokoll gereinigt und mit 20 µl destilliertem Wasser eluiert. Die Klonierung wurde mit dem TOPO™ TA Cloning™ Kit (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornien, USA) unter Verwendung des pCR™4-TOPO®-Vektors und kompetenter One Shot® TOP10-Zellen durchgeführt. Nach der Ligation und Transformation wurden die Escherichia coli-Zellen 1 Stunde lang bei 37 °C in SOC-Medium gewonnen, auf LB-Agarplatten ausplattiert und 20 Stunden lang bei 37 °C gezüchtet. Aus jedem Klonierungstest wurden 15 bis 20 einzelne Klone mit sterilisierten (geflammten) Zahnstochern entnommen und auf frische LB-Agarplatten übertragen. Die gleichen Zahnstäbchen mit restlichen E. coli wurden in PCR-Röhrchen mit 25 µl Mastermix für die Kolonie-PCRs gedreht. Kolonie-PCRs wurden mit dem GoTaq® Long PCR Master Mix (Promega) unter den gleichen Bedingungen wie die 18S-PCRs (siehe oben) durchgeführt, jedoch unter Verwendung der Primer M13nF (5′-TGT AAA ACG ACG GCC AGT GA-3′) und M13nR (5′-GAC CAT GAT TAC GCC AAG CTC-3′) [8]. Die PCR-Produkte von bis zu 15 Klonen, die Inserts der erwarteten Größe trugen, wurden zur Reinigung und Sequenzierung unter Verwendung der Kolonie-PCR-Primer an Microsynth Austria GmbH (Wien, Österreich) geschickt.

Die Vorwärts- und Rückwärtsablesungen und Elektropherogramme der CytB- und 18S-Sequenzen wurden manuell abgeglichen und in BioEdit v.7.0.8.0 mit dem Auge überprüft [13]. Anschließend wurden die Sequenzen mit MAFFT v.7 [14] unter Verwendung der Standardoption (FFT-NS-2) ausgerichtet und sortiert, und Primer- und Klonierungsvektorsequenzen wurden aus den 18S-Alignments herausgeschnitten. Da einige 18S-Klone nicht überlappten, wurde der mittlere Teil aus 65 Klonen mit den Primern 18S_H_int_F und 18S_H_int_R neu sequenziert. Die langen und kurzen 18S-Sequenzen wurden kombiniert und mit MAFFT v.7 neu ausgerichtet. und alle abweichenden Positionen wurden in den entsprechenden Elektropherogrammen erneut überprüft.

Um die geografische und Wirtsverteilung der H.-majoris- und H.-belopolskyi-Linien zu visualisieren, wurden zwei DNA-Haplotyp-Netzwerke berechnet. Die CytB-Linien beider Gruppen gruppieren sich in reziprok monophyletischen Kladen, die derzeit 21 (H. Majoris) und 40 (H. Belopolskyi) Linien enthalten, von denen die meisten noch nicht mit Morphospezies verknüpft wurden. Die Kladen wurden durch Berechnung eines Maximum-Likelihood-Baums (ML) identifiziert, der auf allen vollständigen Haemoproteus-Linien basiert, die in der MalAvi-Datenbank (http://130.235.244.92/Malavi/index.html) aufgeführt sind, und einigen anderen Linien, die nur bei NCBI GenBank erhältlich sind. Die Sequenzen wurden mit MAFFT v.7 abgeglichen. [14] Bei Anwendung der Standardoption (FFT-NS-2) wurden die ersten und letzten beiden Bp gekürzt, da sie in einigen Sequenzen fehlerhaft oder unvollständig waren. Ein ML-Bootstrap-Baum (1000 Replikate) wurde mit IQ-TREE v.1.6.12 berechnet. [15] basierend auf dem gekürzten 474-bp-Alignment (1325 eindeutige Abstammungslinien) unter Anwendung des Substitutionsmodells GTR+F+I+G4. Für jede Abstammungslinie, die in den Kladen H. majoris und H. belopolskyi enthalten ist, wurden die Informationen zu Wirten, Ländern und Referenzen aus der MalAvi-Tabelle „Hosts und Sites“ (http://130.235.244.92/Malavi/) extrahiert und in organisiert eine Microsoft Excel-Tabelle (Microsoft, Redmond, WA, USA). Darüber hinaus wurden Sequenzen und zugehörige Informationen für einige Abstammungslinien hinzugefügt, die nur auf NCBI GenBank verfügbar waren. Die Median-Joining-Haplotyp-Netzwerke wurden mit Network 10.2.0.0 (Fluxus Technology Ltd, Suffolk, UK) unter Verwendung der Standardeinstellungen berechnet. Die Netzwerke wurden grafisch angeordnet und mit Informationen zu Wirtsarten/-familien und geografischen Regionen gemäß dem Geoschema der Vereinten Nationen mit Network Publisher v.2.1.2.5 (Fluxus Technology Ltd) versehen. Um die geografische und Wirtsverteilung der anderen Abstammungslinien darzustellen, wurden Kreisdiagramme mit Microsoft Excel basierend auf den MalAvi-Daten „Wirte und Standorte“ erstellt. Alle Grafiken wurden mit Adobe Illustrator CC v.2015 (Adobe Inc., San José, CA, USA) finalisiert.

ML- und Bayesian Inference (BI)-Bäume wurden sowohl für die CytB- als auch für die 18S-Datensätze berechnet. CytB-Bäume wurden basierend auf dem 885-bp-Alignment der 19 MalAvi-Linien, die in der vorliegenden Studie erhalten wurden, und acht von [8] veröffentlichten Linien berechnet. Als Fremdgruppe wurde eine Sequenz von Plasmodium matutinum pLINN1 (MT912161) einbezogen. Das am besten geeignete Substitutionsmodell, das von IQ-TREE v.1.6.12 vorgeschlagen wird. [15] laut dem korrigierten Akaike Information Criterion (AICc) war GTR+F+I+G4. Der ML-Bootstrap-Baum wurde mit IQ-TREE v.1.6.12 berechnet. [15] durch die Durchführung von 10.000 Bootstrap-Replikationen. Der BI-Baum wurde mit MrBayes v.3.2 berechnet. [16]. Die Analyse wurde über 5 Millionen Generationen durchgeführt (2 Durchgänge mit jeweils 4 Ketten, von denen eine beheizt war) und jeder tausendste Baum wurde beprobt. Die ersten 25 % der Bäume wurden als Burn-in verworfen und aus den verbleibenden 3750 Bäumen wurde ein 50 %-Mehrheitsregel-Konsensbaum berechnet.

Das Alignment der 18S-Sequenzen umfasste 201 Klone von 19 MalAvi-Linien, die in der vorliegenden Studie erhalten wurden, und 71 Klone von sieben MalAvi-Linien, die von [8] veröffentlicht wurden. Dreizehn Klone wurden von den Analysen ausgeschlossen, da sie aus anderen bei Koinfektionen vorhandenen Abstammungslinien stammten. Die 18S-Sequenzen der Probe AH0002H (hRB1) aus [8] wurden ebenfalls ausgeschlossen, da ihnen am 5′-Ende ein 115-bp-Abschnitt fehlte. Die Sequenzen wurden mit MAFFT v.7 abgeglichen. [14] unter Verwendung der Option G-INS-I (globale Ausrichtung basierend auf dem Needleman-Wunsch-Algorithmus). Um die Anzahl der Sequenzen zu reduzieren, wurden Untergruppen von zwei bis fünf verschiedenen Klonen pro MalAvi-Linie (insgesamt 74 Sequenzen) ausgewählt. Eine Fremdgruppe wurde nicht einbezogen, da sich die 18S-Sequenzen anderer Hämosporidien-Gattungen stark von denen von Parahaemoproteus spp. unterscheiden. und die Entfernung der Lückenposition hätte zu einem Informationsverlust geführt. Die Teilmenge der Sequenzen wurde mit MAFFT v.7 neu ausgerichtet. (G-INS-I-Option), was zu einem Alignment von 2526 bp führt. Die ersten 65 und die letzten 18 Positionen wurden entfernt, da sie in den Sequenzen der Proben AH1982 (hCOLL3) und AH1895 (hSYAT02) (erhalten durch direkte Sequenzierung) und in der Probe AH0608 (hEMCIR01; [8]) nicht vorhanden waren. Nach dem Beschneiden der letztgenannten Standorte umfasste die Ausrichtung 2443 Positionen. Nachdem alle Seiten mit Lücken mit trimAl v.1.2 entfernt wurden. [17] umfasste die endgültige Ausrichtung 1605 Positionen. Das am besten geeignete Substitutionsmodell, das von IQ-TREE v.1.6.12 vorgeschlagen wird. [15] laut dem korrigierten Akaike Information Criterion (AICc) war TVM+F+I+G4. Da das letztere Modell in MrBayes v.3.2 nicht implementiert ist. [16] wurde das zweitbeste Modell GTR+F+I+G4 sowohl für die ML- als auch für die BI-Analyse verwendet. Der ML-Bootstrap und die BI-Bäume wurden mit IQ-TREE v.1.6.12 berechnet. [15] und MrBayes v.3.2. [16] unter Anwendung der gleichen Parameter wie für die Ableitung der CytB-Bäume.

Vor der Analyse der Sequenzen wurden die 18S-Klone jeder MalAvi-Linie in separate Dateien gelegt, um die minimale und maximale Länge der Sequenzen zu bestimmen. Der mittlere GC-Gehalt der 18S-Sequenzen aus jeder MalAvi-Linie wurde mit Microsoft Excel berechnet. Die Sequenzen jeder MalAvi-Linie wurden separat mit MAFFT v.7 abgeglichen. [14] unter Verwendung der Option G-INS-I und maximale p-Abstände zwischen den Varianten wurden mit MEGA X v.10.0.5 berechnet [18]. Die letztgenannten Alignments wurden auch verwendet, um zu testen, ob verschiedene 18S-Klone aus denselben MalAvi-Abstammungslinien chimäre Merkmale aufwiesen, was auf eine Rekombination zwischen verschiedenen 18S-Varianten aus denselben MalAvi-Abstammungslinien hinweist. RDP5 v.5.3. [19]) wurde zur Durchführung der folgenden Rekombinationstests verwendet: RDP [20], Bootsscan [21], GENECONV [22], Maxchi [23], Chimaera [24], SiSscan [25] und 3Seq [26].

Basierend auf den Alignments aller Haemoproteus 18S-Sequenzen wurden Oligonukleotidsonden entworfen, die speziell auf die untersuchten Abstammungslinien abzielen. Die Ausrichtung wurde mit dem Auge überprüft, um geeignete Regionen für die Sondenbindung zu identifizieren. Die meisten Sonden wurden in Regionen mit variabler Sequenz platziert, die für jede MalAvi-Linie spezifisch sind. Die Qualität der Sonden wurde mit AmplifX v.2.0.7 überprüft (Nicolas Jullien, Aix-Marseille Univ., CNRS, INP, Marseille, Frankreich; https://inp.univ-amu.fr/en/amplifx-manage- Testen und entwerfen Sie Ihre Primer für die PCR). Alle Sonden wurden gegen Genome von Apicomplexan-Parasiten und Vögeln in der NCBI GenBank gestrahlt, um eine unbeabsichtigte Bindung auszuschließen.

Die 18S-Sequenzen von 19 Parahaemoproteus-Linien, von denen die Hälfte zu den Gruppen H. Majoris und H. Belopolskyi gehört, wurden analysiert. Die von [8] für sieben Haemoproteus-Linien veröffentlichten 18S-Sequenzen wurden in die statistischen Analysen und phylogenetischen Bäume einbezogen.

Um die geografische und Wirtsverteilung von CytB-Linien der Gruppen H. Majoris und H. Belopolskyi zu visualisieren, wurden DNA-Haplotyp-Netzwerke auf der Grundlage von 474-bp-Alignments berechnet, die Daten aller Linien enthielten, die in zwei Kladen gruppiert waren.

Die H.-majoris-Gruppe umfasste 21 einzigartige Abstammungslinien, die sich in der 474-bp-CytB-Sequenz um bis zu neun bp unterschieden (Abb. 1). Die meisten Abstammungslinien wurden überwiegend bei Singvögeln in Europa und Westasien sowie gelegentlich in Nordafrika und Südasien gefunden, mit Ausnahme von hPOEATR01, hTUMIG08, hTUMIG21 und hPHYBOR04, die hauptsächlich von nordamerikanischen Drosseln stammen. Laut der MalAvi-Datenbank (http://130.235.244.92/Malavi/) wurden die folgenden sechs Abstammungslinien von [27, 28] H. Majoris zugeschrieben: hCCF5, hCWT4, hPARUS1, hPHSIB1, hPHYBOR04 und hWW2. Die 18S-Sequenzen wurden von allen letztgenannten Linien mit Ausnahme von hPHYBOR04 erhalten, da die einzige verfügbare Probe nicht genügend DNA enthielt. Die drei Abstammungslinien hPARUS1, hPHSIB1 und hWW2 gehören zu den häufigsten Abstammungslinien hämosporidischer Parasiten bei eurasischen Singvögeln. hPARUS1 (876 Datensätze) wurde hauptsächlich in Nordeuropa (510), Westeuropa (135), Osteuropa (104), Westasien (65) und Südeuropa (48) gefunden; Die Hauptwirte sind Cyanistes caeruleus (463) und Parus major (244) aus der Familie der Paridae. hPHSIB1 (868) wurde hauptsächlich in Nordeuropa (791) und Osteuropa (44) gefunden; die Muscicapidae-Arten Ficedula albicollis (499) und Ficedula hypoleuca (172) sind die häufigsten Wirte. hWW2 (505) wurde hauptsächlich in Nordeuropa (445) gefunden und weist ein breiteres Wirtsspektrum auf, wobei etwa die Hälfte der Nachweise von Sylviidae (247) stammt, gefolgt von Phylloscopidae (138), Paridae (55) und Muscicapidae (31); Die häufigsten Wirtsarten sind Phylloscopus trochilus (108), Sylvia borin (90), Sylvia atricapilla (79) und Sylvia communis (64). hCCF5 (36) wurde fast ausschließlich in Fringilla coelebs (35) in Nordeuropa (32) und Nordafrika (4) gefunden. hCWT4 (22) wurde hauptsächlich in Nordeuropa (8), Osteuropa (7) und Westasien (5) gefunden, wobei die meisten Nachweise von Sylviidae (15), insbesondere S. communis (8), stammen. hEMSPO03 (8) wurde noch nicht mit einer Morphospezies in Verbindung gebracht; Es wurde in Westasien (5), Westeuropa (2) und Osteuropa (1) in Pyrrhula pyrrhula (3) und Phylloscopus nitidus (2) und anderen gefunden. Aufzeichnungen von hEMSPO03 aus Phylloscopus humei (1) und Phylloscopus trochiloides (3) in Indien (29) wurden nicht berücksichtigt, da die Sequenzen nur 448 bp der CytB-Barcode-Region abdeckten.

Median-verbindendes DNA-Haplotyp-Netzwerk partieller (474 ​​bp) CytB-Sequenzen, die zur Haemoproteus-majoris-Gruppe gehören. Die beiden Abbildungen zeigen die Verteilung in Vogelfamilien A und geografischen Gebieten B gemäß dem Geoschema der Vereinten Nationen. Jeder Kreis repräsentiert einen einzigartigen Haplotyp/eine einzigartige Abstammungslinie. Die Häufigkeit wird für alle Haplotypen mit mehr als einem Datensatz angegeben und entspricht in etwa der Größe von Kreisen. Balken auf Zweigen geben die Anzahl der Substitutionen zwischen zwei Haplotypen an. Kleine weiße Kreise stellen Medianvektoren dar, bei denen es sich um hypothetische (häufig angestammte oder nicht abgetastete) Sequenzen handelt, die erforderlich sind, um vorhandene Haplotypen mit maximaler Sparsamkeit zu verbinden. Die in der vorliegenden Studie analysierten Abstammungslinien sind mit Sternchen gekennzeichnet

Die H. belopolskyi-Gruppe umfasste 40 einzigartige Abstammungslinien, die sich in der 474 bp langen CytB-Sequenz um bis zu 38 bp unterschieden (Abb. 2). Daher sind die Abstände zwischen einigen Abstammungslinien viel größer als in der H.-majoris-Gruppe. Sie kamen fast ausschließlich bei verschiedenen Arten der Familie Acrocephalidae (Sumpf- und Baumsänger) in Europa, Asien und Afrika vor. Laut der MalAvi-Datenbank (http://130.235.244.92/Malavi/) gehören die folgenden neun Abstammungslinien zu H. belopolskyi: hARW1, hHIICT1, hHIICT3, hHIICT4, hHIICT5, hMW1, hRW3, hSW1 und hSW3. Allerdings wurden nur HIICT1 und hMW1 morphologisch untersucht [30], und hHIICT5 (1 bp Unterschied zu hHIICT3) deckt nicht die gesamte Barcode-Region ab. Die Gruppe enthält auch die Linie hGRW01, die von [31] mit H. nucleokondensus verknüpft wurde, sich jedoch nur in 2 bp von H. belopolskyi hMW1 unterscheidet. Weitere taxonomische Studien könnten ergeben, dass die Abstammungslinien der H. belopolskyi-Gruppe zu mehreren kryptischen Arten gehören. 18S-Sequenzen wurden aus den folgenden fünf Abstammungslinien erhalten: hACDUM2, hARW1, hGRW01, hMW3 und hSW1. hACDUM2 (52 Datensätze) wurde hauptsächlich in Acrocephalus agricola in Osteuropa (22) und Acrocephalus dumetorum in Südasien (22) gefunden. hARW1 (25) wurde in Acrocephalus scirpaceus (12), Acrocephalus palustris (5) und einigen anderen Vogelarten in Nord-, West- und Osteuropa, Westasien sowie Nord- und Ostafrika gefunden. hGRW01 (225) wurde fast ausschließlich in Acrocephalus arundinaceus (216) in seinem gesamten Verbreitungsgebiet in Europa (195), Afrika (18) und Westasien (3) nachgewiesen. hMW3 (6) wurde bisher nur in A. palustris in der Türkei (3) und in der vorliegenden Studie in Litauen (2) gefunden. hSW1 (171) wurde hauptsächlich in Acrocephalus schoenobaenus (158) in Osteuropa (152), Nordeuropa (2), Westeuropa (1), Westasien (2) und Westafrika (1) sowie in A. scirpaceus nachgewiesen (8) in Osteuropa (3), Südeuropa (2), Westasien (3) und Westafrika (1). Die Verteilungen der anderen Abstammungslinien (hCCF2, hCCF3, hCCF6, hCOLL3, hCWT7, heMCIR01, hCULKIB01, hLK03, hROBIN1, hROFI1, hRW1, hSISKIN1, hSTAL2, hTURDUS2 und hSYAT02) in Vogelwirten und geografischen Gebieten (UN-Geoschema) werden angezeigt als Tortendiagramme (Abb. 3). Haemoproteus sp. hCCF2 (95 Datensätze) wurde hauptsächlich in Fringilla coelebs (81) in Nordafrika (52), Nordeuropa (18) und Südeuropa (16) gefunden. Haemoproteus fringillae hCCF3 (58) wurde hauptsächlich in F. coelebs (31), Carduelis chloris (14) und Pyrrhula pyrrhula (7) in Nordeuropa (36), Westasien (12), Osteuropa (5) und Nordafrika nachgewiesen (4) und Südeuropa (1). Haemoproteus vgl. magnus hCCF6 (87) wurde fast ausschließlich in F. coelebs (85) in Nordafrika (53), Europa (27), Westasien (5) und Südasien (2) gefunden. Haemoproteus balmorali hCOLL3 (108) wurde in Ficedula albicollis (76), F. hypoleuca (24) und anderen Muscicapidae (9) in Nordeuropa (56), Osteuropa (41), Südeuropa (7) und Westasien nachgewiesen ( 2) und Nordafrika (1). Haemoproteus sp. hCWT7 (29) wurde hauptsächlich in S. communis (26) in Westasien (24) gefunden. Haemoproteus syrnii hCULKIB01 (22) wurde in Europa in den Eulenarten Strix aluco (10), Strix uralensis (9), Bubo bubo (1) und Strix nebulosa (1) gefunden. Haemoproteus dumbbellus hEMCIR01 (47) wurde in Europa fast ausschließlich in Emberiza citrinella (40) gefunden. Haemoproteus brachiatus hLK03 (19) wurde hauptsächlich in Falco tinnunculus (13) und anderen Falken (2) in Ostasien (8), Westasien (1) und Europa (6) gefunden. Haemoproteus sp. hROFI1 (61) wurde hauptsächlich in F. coelebs (22), Carduelis chloris (20) und anderen Fringillidae-Arten (12) in Nordeuropa (38), Nordafrika (16), Osteuropa (4) und Westasien gefunden (3). Haemoproteus attenuatus hROBIN1 (103) wurde hauptsächlich in den Muscicapidae-Arten Erithacus rubecula (40), Luscinia luscinia (34), Luscinia megarhynchos (7) und Saxicola rubetra (7) in Europa und Westasien gefunden. Haemoproteus sp. hRW1 (115) wurde in A. scirpaceus (62) und anderen Acrocephalidae (4), in Cinclus cinclus (24), Lanius meridionalis (16), Luscinia svecica (8) und Cisticola nigriloris (1) in Südeuropa (87) nachgewiesen ), Osteuropa (12), Nordeuropa (11) und andere Regionen (5). Haemoproteus tartakovskyi hSISKIN1 (87) wurde hauptsächlich in Fringillidae (83) in Mittelamerika (37), Nordamerika (22) und Europa (26) gefunden. Die häufigsten Wirte waren Haemorhous mexicanus (42), Acanthis flammea (7), Loxia curvirostra (6), Loxia leucoptera (5) in Amerika und Spinus spinus (16) in Europa. Haemoproteus parabelopolskyi hSYAT02 (250) wurde fast ausschließlich in S. atricapilla (246) in Westeuropa (103), Südeuropa (69), Osteuropa (38), Nordeuropa (30), Westasien (8) und Afrika gefunden (2). Haemoproteus syrnii hSTAL2 (37) wurde bei Eulen in Europa (36) und Nordafrika (1) nachgewiesen, hauptsächlich bei Strix aluco (19) und Strix uralensis (15). Haemoproteus minutus hTURDUS2 (170) wurde hauptsächlich in Turdidae (140) in Europa (92), Westasien (37) und Amerika (14) gefunden. Die meisten Belege stammen von Turdus merula (121).

Median-verbindendes DNA-Haplotyp-Netzwerk partieller (474 ​​bp) CytB-Sequenzen, die zur Haemoproteus belopolskyi-Gruppe gehören. Die beiden Abbildungen zeigen die Verteilung in Vogelfamilien A und geografischen Gebieten B gemäß dem Geoschema der Vereinten Nationen. Jeder Kreis repräsentiert einen einzigartigen Haplotyp/eine einzigartige Abstammungslinie. Die Häufigkeit wird für alle Haplotypen mit mehr als einem Datensatz angegeben und entspricht in etwa der Größe von Kreisen. Balken auf Zweigen und Zahlen in Quadraten geben die Anzahl der Substitutionen zwischen zwei Haplotypen an. Kleine weiße Kreise stellen Medianvektoren dar, bei denen es sich um hypothetische (häufig angestammte oder nicht abgetastete) Sequenzen handelt, die erforderlich sind, um vorhandene Haplotypen mit maximaler Sparsamkeit zu verbinden. Die in der vorliegenden Studie analysierten Abstammungslinien sind mit Sternchen gekennzeichnet

Kreisdiagramme, die die Verteilung der Parasitenlinien in geografischen Gebieten gemäß dem Geoschema der Vereinten Nationen (links) und den Vogelwirten (rechts) zeigen.

Die in den DNA-Haplotyp-Netzwerken und Kreisdiagrammen angezeigten Informationen sind in der Zusatzdatei 1: Tabelle S1 zusammengefasst.

In den meisten Fällen war zur Gewinnung der 18S-Sequenzen eine molekulare Klonierung erforderlich, da sich die Varianten in ihrer Länge unterschieden. Nur die Proben AH1895H (hSYAT02) und AH1982H (hCOLL3) wurden nicht geklont, da ihre 18S-Sequenzen nach direkter Sequenzierung vollständig lesbar waren. Fast die vollständigen 18S-Sequenzen wurden aus 20 Proben mit 17 Haemoproteus-Linien kloniert. Pro Probe wurden zwei bis 15 Klone sequenziert (insgesamt 201, durchschnittlich 10,1 Klone). Wir hatten vor, bis zu 15 Klone pro Linie zu sequenzieren, aber die Ausbeute an Klonen war in einigen Fällen äußerst gering. Von den 201 Klonen wurden 13 von den Analysen ausgeschlossen, da sie aus Koinfektionen stammten, die bei der Sequenzierung des CytB-Barcodeabschnitts mit den Standardprimern von [12] nicht erkannt wurden. In einigen Fällen waren jedoch Koinfektionen entweder in den 885-bp-Sequenzen sichtbar, die mit den Primern CytB_HPL_intF1 und CytB_HPL_intR1 von [8] erhalten wurden, oder in den 18S-Klonen. Meist konnten die 18S-Klone eindeutig einer der MalAvi-Linien zugeordnet werden, da in anderen Proben einzelne Infektionen mit den gleichen Linien auftraten. Die Probe AH2168H wies eine Mischinfektion mit den Abstammungslinien hCCF3 (6 Klone), hCCF6 (7 Klone) und hCCF5 (2 Klone) auf, von denen nur die hCCF3-Klone in die Analysen einbezogen wurden; Die hCCF6-Klone wurden ausgeschlossen, weil die Proben AH2153H und AH2154H einzelne Infektionen mit derselben Abstammungslinie enthielten, und die beiden hCCF5-Klone wurden ausgeschlossen, weil die mittleren Teile der Sequenzen nicht lesbar waren. Die Probe AH1973H wies eine Koinfektion mit den Abstammungslinien hCCF3 (9 Klone), hCCF5 (2 Klone) und hROFI1 (1 Klon) auf. Der hROFI1-Klon wurde von den Analysen ausgeschlossen, da die Probe AH2171H genügend Klone der Abstammungslinie hROFI1 lieferte, die beiden hCCF5-Klone wurden jedoch behalten, da es sich um die einzigen vollständigen 18S-Sequenzen dieser Abstammungslinie handelte. Die Probe AH2171H enthielt eine Koinfektion mit hROFI1 (12 Klone) und hCCF6 (3 Klone); Die hCCF6-Klone wurden von den Analysen ausgeschlossen, da in den Proben AH2153H und AH2154H genügend hCCF6-Klone verfügbar waren. Darüber hinaus enthielt die Probe AH1664H wahrscheinlich eine Koinfektion mit hSW1 und einer anderen H. belopolskyi-Linie. Die Probe enthielt vier Klone (3, 5, 6, 14), die denen von H. belopolskyi hARW1 (AH1903H) und hMW3 (AH1899 und AH1902) sehr ähnelten, sowie sieben Klone (2, 4, 7, 8, 10, 11, 12). ) bilden einen separaten Zweig innerhalb der H. belopolskyi-Gruppe. Die ersten vier Klone könnten zur Linie hSW3 gehören, die ausschließlich in derselben Wirtsart (A. schoenobaenus) vorkam und sich nur in einem bp von hARW1 unterscheidet (Abb. 2). Doppelpeaks in den Elektropherogrammen des 885 bp großen CytB-Fragments stimmten mit der Linie hSW3 überein, waren jedoch zu schwach, um deren Vorhandensein eindeutig zu bestätigen. Abgesehen von AH1973H, AH2168H, AH2171H und AH1664H enthielten die anderen Proben höchstwahrscheinlich Monoinfektionen mit 18S-Klonen, die zu einzelnen Parasitenlinien gehörten. Die 18S-Sequenzen von H. majoris hEMSPO03 (AH2023H) konnten nicht vollständig abgerufen werden, da es Poly-A- und Poly-T-Motive von Position 1660 bis 1800 aufwies. Die 18S-Sequenzen wurden unter den Zugangsnummern OR337936–OR338136 in die NCBI GenBank hochgeladen. Die 885-bp-Abschnitte des mitochondrialen CytB wurden unter den Zugangsnummern OR283176–OR283196 hinterlegt.

Phylogenetische Bäume wurden mit den 18S- und CytB-Sequenzen der vorliegenden Studie und den von [8] veröffentlichten Sequenzen berechnet. Der 18S-Baum (Abb. 4), der eine Auswahl von zwei bis fünf verschiedenen 18S-Klonen pro MalAvi-Linie (insgesamt 74 Sequenzen) enthielt, hatte eine mittlere Wurzel. Der CytB-Baum (Abb. 5) wurde mit den 885-bp-Sequenzen berechnet und mit einer Sequenz von Plasmodium matutinum pLINN1 verwurzelt. Die tieferen Knoten erzielten in beiden Bäumen niedrige Unterstützungswerte und die Topologie unterschied sich teilweise, aber die 18S- und CytB-Bäume hatten einige gemeinsame Muster. Die Abstammungslinien H. brachiatus hLK03, H. minutus hTURDUS2, H. syrnii hCULKIB01 und H. syrnii hSTAL2 nehmen basalere Positionen in den Bäumen ein, während sich die anderen Abstammungslinien in einer Klade mit niedrigem (18S; bs/bp = 72/ 0,76) und mäßige Unterstützung (CytB; bs/pp = 82/0,98). Die letztere Gruppe wies in beiden Bäumen vier stark unterstützte Untergruppen auf. Die erste Unterklasse umfasst H. dumbbellus hEMCIR01, H. fringillae hCCF3, Haemoproteus sp. hROFI1, H. tartakovskyi hSISKIN1 und Haemoproteus sp. hCCF2. Die zweite Unterklasse umfasst H. balmorali hCOLL3 und H. attenuatus hROBIN1. Die dritte Unterklasse umfasst die H.-majoris-Linien hCCF5, hPARUS1, hWW2, hCWT4, hPHSIB1 und hEMSPO03 (noch nicht mit einer Morphospezies verknüpft). Die vierte Unterklasse umfasst die Gruppe der vier H. belopolskyi-Linien hMW3, hARW1, hSW1, hACDUM2, H. nucleokondensus hGRW01 und die Linien H. parabelopolskyi hSYAT02, H. payevskyi hRW1, H. vgl. magnus hCCF6 und H. sp. hCWT7. Die 18S-Klone der meisten Abstammungslinien gruppierten sich zu reziprok monophyletischen Kladen. Allerdings gehören die Klone der Probe AH1664H, wie oben erwähnt, wahrscheinlich zu zwei verschiedenen Haemoproteus-Linien (hSW1 und hSW3).

Bayesianischer Inferenzbaum von Haemoproteus 18S-Sequenzen. Posterior-Wahrscheinlichkeiten und Maximum-Likelihood-Bootstrap-Werte werden an den meisten Knoten angezeigt. Der Maßstabsbalken gibt die erwartete mittlere Anzahl von Substitutionen pro Stelle gemäß dem angewandten Modell der Sequenzentwicklung an. Der Baum hatte eine mittlere Wurzel, es wurde keine Außengruppe verwendet

Bayesianischer Inferenzbaum von Haemoproteus-CytB-Sequenzen (885 bp). Posterior-Wahrscheinlichkeiten und Maximum-Likelihood-Bootstrap-Werte werden an den meisten Knoten angezeigt. Der Maßstabsbalken gibt die erwartete mittlere Anzahl von Substitutionen pro Stelle gemäß dem angewandten Modell der Sequenzentwicklung an. Der Baum wurde mit einer Sequenz von Plasmodium matutinum pLINN1 bewurzelt

Die p-Abstände zwischen den 18S-Varianten der 27 Parahaemoproteus-Linien reichten von 0,46 % in H. lanii hRB1 bis 20,54 % in H. tartakovskyi hSISKIN1 (Tabelle 2). Die letztgenannte Linie ist außergewöhnlich, da sie zwei ähnliche 18S-Varianten und eine stark voneinander abweichende dritte Variante enthielt. Ohne diese Probe betrug der mittlere maximale p-Abstand zwischen 18S-Klonen der anderen Abstammungslinien 1,84 %. Wie oben erwähnt, könnten einige Klone der Probe AH1664H bei einer Koinfektion zu hSW3 gehören (nicht bestätigt). Beim getrennten Testen der beiden Sequenzcluster waren die maximalen p-Abstände zwischen den Klonen von hSW1 und hSW3 mit 1,26 bzw. 0,73 geringer (Tabelle 2).

Die ungefähren Gesamtlängen der 18S-Sequenzen (einschließlich fehlender Teile und Primerregionen) reichten von 1943 bp in H. minutus hTURDUS2 bis 2278 bp in H. majoris hCCF5. Die größten Unterschiede zwischen den kürzesten und längsten 18S-Sequenzen wurden bei H. tartakovskyi hSISKIN1 mit 53 bp und bei H. fringillae hCCF3 mit 40 bp gefunden; der mittlere Unterschied über alle 27 Parahaemoproteus-Linien betrug 6,8 bp. Der GC-Gehalt reichte von 39,4 % in H. tartakovskyi hSISKIN1 bis 47,4 % in H. syrnii hSTAL2; der Gesamtmittelwert lag bei 45,2 % (Tabelle 2). Interessanterweise wies H. tartakovskyi hSISKIN1 drei 18S-Klone mit 42,7 % (kurze Zweige in Abb. 4) und sieben Klone mit 37,4 % GC-Gehalt (lange Zweige in Abb. 4) auf.

Tests auf rekombinante Signale wurden separat für die Alignments von 18S-Klonen aus jeder Parahaemoproteus-Linie unter Verwendung von RDP5 durchgeführt (19). Rekombinante Signale wurden in zehn der 27 untersuchten Abstammungslinien nachgewiesen, darunter H. fringillae hCCF3, Haemoproteus sp. hROFI1, H. nucleokondensus hGRW01, H. syrnii hCULKIB01, H. syrnii hSTAL2, H. tartakovskyi hSISKIN1 und die H.-majoris-Linien hCWT4, hPHSIB1, hPARUS1 und hWW2 (Tabelle 2). Die stärksten Rekombinationssignale wurden in hPHSIB1, hWW2 und hCCF3 nachgewiesen, wobei jeweils fünf oder mehr der sieben Tests signifikante Ergebnisse lieferten (Zusatzdatei 2: Tabelle S2).

Basierend auf dem Alignment, das alle verfügbaren Haemoproteus-18S-Sequenzen enthält, wurden Oligonukleotidsonden entwickelt, die speziell auf die 18S-rRNA der in dieser Studie untersuchten Abstammungslinien abzielen. Die 18S-Sequenzen der meisten Haemoproteus-Linien wiesen einzigartige Sequenzregionen auf, die durch In-situ-Hybridisierung mit Oligonukleotidsonden angesteuert werden konnten (Tabelle 3). Allerdings waren die 18S-Sequenzen der H. belopolskyi-Linien hARW1, hMW3 und hSW3 zu ähnlich und es wurde eine Sonde entwickelt, die alle drei Linien parallel angreift. Die für die hROFI1-Linie entwickelte Sonde zielt nur auf eine der beiden Hauptvarianten (C02, C08, C09, C11); Die Sonde wurde bereits getestet und bestätigte die Expression in den Vogelwirten (unveröffentlichte Ergebnisse). Die Längen der Sonden und die Annealing-Temperaturen lagen zwischen 23 und 31 Nukleotiden und 54,2 °C bzw. 68,1 °C. Die meisten Sonden erreichten in AmplifX v.2.0.7 einen maximalen Qualitätsfaktor (100).

Für die vorliegende Studie wurden die 18S-rRNA-Gene von 19 Haemoproteus-Linien, die alle zur Untergattung Parahaemoproteus gehören, sequenziert. Mehr als die Hälfte dieser Abstammungslinien waren zuvor mit den Artengruppen H. majoris (hCCF5, hCWT4, hEMSPO03, hPARUS1, hPHSIB1, hWW2) und H. belopolskyi (hACDUM2, hARW1, hMW3, hGRW01, hSW1) verbunden oder sind eng damit verwandt auf morphologischen Merkmalen ihrer Blutstadien und/oder ähnlichen CytB-Barcodesequenzen. Die beiden Artengruppen umfassen einige der häufigsten Haemoproteus-Abstammungslinien, die bei Singvögeln der Paläarktis vorkommen. Darüber hinaus wurden die 18S-rRNA-Gene von acht anderen Haemoproteus-Linien sequenziert: hCOLL3, hCCF2, hCCF3, hCCF6, hCWT7, hROFI1, hRW1 und hSYAT02. Die von [8] veröffentlichten Daten zu acht Haemoproteus-Linien, hCULKIB01, hEMCIR01, hLK03, hROBIN1, hRB1, hSISKIN1, hSTAL2 und hTURDUS2, wurden in die Sequenzanalysen einbezogen.

Die meisten Plasmodium-Arten von Säugetieren weisen zwei stark divergierende Sequenzcluster auf, die jeweils eine oder zwei ähnliche 18S-Varianten enthalten. Es wurde gezeigt, dass die 18S-Varianten von Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax und Plasmodium berghei in den Wirbeltierwirten (A-Typ) und den Mückenvektoren (S-Typ) unterschiedlich exprimiert werden [32,33,34]. Plasmodium vivax ist die einzige Art mit einer zusätzlichen O-Typ-Variante, die in den Ookineten und Oozysten exprimiert wird [33]. Eine weitere Ausnahme ist Plasmodium malariae, da seine 18S-Gene nahezu identisch sind und keine separaten Cluster bilden. Vergleichsweise hoch waren die Abstände zwischen 18S-Varianten auch bei Plasmodium vaughani pSYAT05 (9,3 %), Plasmodium matutinum pLINN1 (10,8 %) und Plasmodium elongatum pGRW06 (14,9 %) [8]. Rekombinationstests entdeckten chimäre Merkmale in den 18S-Sequenzen mehrerer Plasmodium-Arten, was darauf hindeutet, dass sich unterschiedliche Varianten nicht unabhängig voneinander nach einem Modell der Geburt-und-Tod-Evolution unter starker reinigender Selektion entwickeln [4], sondern eher in einer halbkonzertierten Art und Weise [8]. , 35].

Die untersuchten Haemoproteus-Parasiten wiesen auch ausgeprägte 18S-Varianten auf, die durchschnittlichen maximalen Abstände zwischen den Varianten waren jedoch erheblich geringer (Mittelwert 1,84 % ohne den aberranten H. tartakovskyi hSISKIN1) als bei den meisten untersuchten Plasmodium-Arten. Anders als bei vielen Plasmodium-Arten gruppierten sich die 18S-Varianten der meisten Abstammungslinien in reziprok monophyletischen Kladen. Eine Ausnahme bildete die Probe AH1664H, deren 18S-Varianten sich um 5,64 % unterschieden und innerhalb der H. belopolskyi-Gruppe in separate Kladen fielen. Letztere Probe wies jedoch wahrscheinlich eine Koinfektion mit H. belopolskyi hSW3 und H. belopolskyi hSW1 auf (siehe „Ergebnisse“) “). Haemoproteus sp. hROFI1 wies zwei 18S-Varianten auf, die um 7,5 % voneinander abweichen, sich jedoch in einer schwach unterstützten Gruppe zusammenballen (Abb. 4); Abgesehen von Doppelpeaks, die mit hCCF6 in den langen CytB-Sequenzen übereinstimmen, wurde keine andere Abstammungslinie bei der Koinfektion identifiziert. Die außergewöhnlichsten Muster wurden in H. tartakovskyi hSISKIN1 gefunden, das drei 18S-Varianten aufwies, zwei ähnliche Varianten mit einem Abstand von 6,5 % und eine dritte mit einem Abstand von 18,3 % bzw. 20,5 % von den beiden letztgenannten. Die dritte Variante zeigte eine hohe Anzahl an Substitutionen (hauptsächlich Änderungen von G/C zu A/T) in Sequenzregionen, die in den meisten anderen Haemoproteus-Linien konserviert waren, weshalb ihr GC-Gehalt mit 37,4 % im Vergleich zu dem der anderen Variante deutlich niedriger war Varianten mit 43,2 % und 42,4 %. Diese aberrante 18S-Variante ist möglicherweise nicht funktionsfähig und hat daher im Vergleich zu anderen Kopien der 18S-rRNA-Gene von Haemoproteus eine viel höhere Anzahl an Substitutionen erhalten. Trotz der hohen Sequenzdivergenz gruppierten sich alle drei Varianten in einer gut unterstützten Gruppe (Abb. 4). Die von Bensch et al. veröffentlichten Kerngenomsequenzen von H. tartakovskyi hSISKIN1. [36] umfasste auch die abweichende dritte Variante (PRJNA309868, Contig 65), aber nur eine der beiden anderen (PRJNA309868, Contig 602). Der mittlere GC-Gehalt aller analysierten Haemoproteus 18S-Sequenzen betrug 45,2 %, was deutlich höher ist als der von Vogel-Plasmodium spp. mit 34,0 % und häufigem Leucocytozoon spp. mit 37,3 %. Der GC-Gehalt war nur in Parasitenlinien der Leucocytozoon toddi-Artengruppe mit 49,3 % höher [8]. Die ungefähren Gesamtlängen der Haemoproteus 18S-Sequenzen reichten von 1943 bp in H. minutus hTURDUS2 bis 2278 bp in H. majoris hCCF5 und waren daher variabler als bei Vogel-Plasmodium spp. (2100 bis 2177 bp), Leucocytozoon spp. (2094 bis 2138 bp) und die Leucocytozoon toddi-Artengruppe (2125 bis 2308 bp). Die mit den 18S-Sequenzen der Haemoproteus-Parasitenlinien durchgeführten Rekombinationstests zeigten auch chimäre Merkmale, die möglicherweise aus der Rekombination zwischen 18S-Varianten derselben Art oder Linie resultieren. Die Ergebnisse unterschieden sich zwischen den Arten, z. B. wurden in der H. belopolskyi-Gruppe keine rekombinanten 18S-Varianten nachgewiesen, im Vergleich zur H.-majoris-Gruppe, wobei vier von fünf Abstammungslinien rekombinante Varianten aufwiesen. Somit deuten die Ergebnisse darauf hin, dass sich die nukleären ribosomalen Gene von Haemoproteus-Arten eher in einer halbkonzertierten Art und Weise entwickeln, wie Corredor und Enea [35] für mehrere Plasmodium-Arten vorgeschlagen haben, als nach einem Modell der Evolution von Geburt und Tod, wie es von Rooney vorgeschlagen wurde [4]. Corredor und Enea [35] verwendeten den Begriff semi-konzertierte Evolution, weil sie herausfanden, dass einige (aber nicht alle) 18S-rRNA-Genkopien von Plasmodium spp. entwickeln sich gemeinsam und erfordern daher eine andere Form der Sequenzinteraktion (Konvertierung) als ungleiches Überkreuzen. Im Gegensatz dazu entwickeln sich die ribosomalen Gene der meisten Eukaryoten vollständig konzertiert, was zur Homogenisierung einzelner Genkopien führt [3], wobei Mechanismen wie ungleiches Crossover während der Rekombination, Genduplikation und interchromosomale Genumwandlung beteiligt sind [1, 2]. , 37]. Das Modell der Evolution von Geburt und Tod geht hingegen davon aus, dass sich Multigenfamilien, die am Immunsystem beteiligt sind, wie etwa Immunglobuline und der Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC), nicht auf konzertierte Weise entwickeln; Neue Kopien entstehen durch Genduplikation, während andere im Laufe der Zeit nicht mehr funktionsfähig sind und gelöscht werden (38, 39).

Das 18S-rRNA-Gen wurde als Standardreferenzsequenz beim Screening auf Apicomplexan-Parasiten und der Bestimmung ihrer phylogenetischen Verwandtschaft verwendet. Allerdings sind die 18S-Sequenzen hämosporidischer Parasiten als phylogenetischer Marker weniger geeignet als bei anderen Gruppen apikomplexer Parasiten, da es verschiedene Varianten und Rekombinationen zwischen ihnen gibt, lange Insertionen/Deletionen und zwischen Gattungen/Untergattungen stark variierende GC-Gehalte (z. B. Eucoccidiorida, Piroplasmorida und Eugregarinorida), die meist identische und stärker konservierte Kopien nukleärer ribosomaler Gene besitzen. Daher zielen PCR-Screening-Assays auf menschliche Plasmodium-Arten nur auf eine der wichtigsten 18S-Varianten ab [40, 41]. Neuere Ansätze etablierten sogar eine quantitative Reverse-Transkriptions-PCR (qRT-PCR), um direkt auf die 18S-rRNA abzuzielen, was zu einer noch höheren Empfindlichkeit führte [42, 43]. Diese Ansätze sind beim Screening auf menschliche Plasmodium-Infektionen praktisch, da sie nur vier Arten umfassen, sind jedoch beim Screening auf hämosporidische Parasiten von Wildvögeln weniger geeignet, da sie eine weitaus größere Anzahl von Arten umfassen und der Erhalt ihrer 18S-Sequenzen molekulares Klonen oder den Einsatz von erfordern würde Sequenzierungsmethoden der nächsten Generation.

Allerdings sind die 18S- und andere nukleare ribosomale RNA-Gene bzw. die entsprechenden ribosomalen RNAs äußerst nützliche Ziele für In-situ-Hybridisierungstests zur Markierung von Parasiten im Wirtsgewebe. Dies eröffnet neue Perspektiven für die Pathologieforschung, indem es auf bestimmte Parasitenarten/-linien während der Vogelhämoproteose abzielt, die verschiedene Vogelorgane deutlich schädigen können, aber noch unzureichend untersucht sind [44, 45]. Einer der Hauptvorteile im Vergleich zu anderen Zielsequenzen besteht darin, dass jede Zelle zahlreiche Ribosomen enthält, was zu einer höheren Empfindlichkeit führt. Darüber hinaus sind ribosomale RNAs deutlich stabiler als andere RNAs, was insbesondere bei der Analyse pathologischer Proben, die nicht aus frischem Material hergestellt wurden, wichtig ist [46]. Gattungsspezifische Oligonukleotidsonden für die In-situ-Hybridisierung wurden etabliert, um aviäre Plasmodium-, Haemoproteus- und Leucocytozoon-Parasiten im Vogelgewebe anzusprechen und zwischen ihnen zu unterscheiden (47, 48). Eine Plasmodium-spezifische Sonde wurde erfolgreich zum Nachweis von Blut- und Gewebestadien in in Paraffin eingebetteten Organen von in Gefangenschaft gehaltenen Pinguinen und wilden Sperlingsvögeln eingesetzt und zeigte, dass Gewebestadien von Plasmodium spp. kann in beiden Gruppen zum Tod führen [47, 49]. Chromogene In-situ-Hybridisierungstests wurden auch durchgeführt, um Gewebemeronten bei Accipitriformen Greifvögeln [50], Strigiformen Greifvögeln [51], Drosseln [52] und anderen Singvögeln [11] zu charakterisieren. Die letztgenannten Studien lieferten wertvolle Informationen über die Entwicklung exoerythrozytischer Parasitenstadien im Wirtsgewebe. Beispielsweise führte die Kombination von histologischen Methoden und In-situ-Hybridisierung zum ersten Bericht über Megalomeronten in Haemoproteus syrnii hSTAL2 und zur Charakterisierung eines neuen Modus der exoerythrozytischen Entwicklung in Leucocytozoon sp. lSTAL5 [51]. Die neuen Haemoproteus 18S-Sequenzen und Oligonukleotidsonden könnten verwendet werden, um gezielt auf bestimmte Parasitenlinien/-arten im Wirtsgewebe abzuzielen. Dies ist besonders wichtig und bleibt der einzige verfügbare Ansatz, wenn Proben Koinfektionen enthalten, die bei Wildtieren vorherrschen.

Für die vorliegende Studie wurden die 18S-rRNA-Gene von 19 Haemoproteus-Linien der Untergattung Parahaemoproteus, den häufigsten Blutparasiten paläarktischer Vögel, sequenziert, wobei der Schwerpunkt auf den Artengruppen H. belopolskyi und H. Majoris lag. Die 18S-Sequenzen von acht weiteren Haemoproteus-Arten, zuvor veröffentlicht von Harl et al. [8] wurden in die Analysen einbezogen. Um die geografische und Wirtsverteilung der untersuchten Abstammungslinien darzustellen, wurden DNA-Haplotyp-Netzwerke und Kreisdiagramme auf der Grundlage der in der MalAvi-Datenbank verfügbaren CytB-Daten erstellt. Wie die meisten Plasmodium-Parasiten wiesen auch die Haemoproteus-Linien zwei oder mehr 18S-Varianten auf, die intraspezifischen Abstände zwischen Varianten derselben Linien waren jedoch im Allgemeinen geringer. Darüber hinaus gruppierten sich die 18S-Sequenzen aller bis auf eine Parasitenlinie in reziprok monophyletischen Kladen, was bei den meisten Säugetier- und Vogel-Plasmodium-Arten nicht der Fall war. Das Vorhandensein chimärer Merkmale in den 18S-Varianten von mehr als einem Drittel der Haemoproteus-Linien weist darauf hin, dass sich ihre ribosomalen Einheiten in einer halbkonzertierten Art und Weise entwickeln und nicht nach einem strengen Modell der Evolution von Geburt und Tod. Basierend auf einem Alignment der 18S-Sequenzen wurden in silico Oligonukleotidsonden entworfen, die mit chromogenen oder fluoreszierenden In-situ-Hybridisierungsmethoden gezielt auf Parasitenarten/-linien im Wirtsgewebe abzielen könnten. Dies würde den Nachweis bestimmter Parasitenlinien auch in Proben mit Koinfektionen ermöglichen, die bei Singvögeln äußerst häufig vorkommen.

Die 18S- und CytB-Sequenzdaten wurden in der NCBI GenBank unter den folgenden Zugangsnummern hinterlegt: OR337936–OR338136 (18S) und OR283176–OR283196 (CytB).

18S-ribosomales RNA-Gen

Cytochrom B-Gen

kleine ribosomale Untereinheit

große ribosomale Untereinheit

Akaike-Informationskriterium korrigiert

affinis (die vorgeschlagene Art ist mit der Art dieses Binomialnamens verwandt, aber nicht mit ihr identisch).

Die Abstammungslinie ist genetisch eng mit der genannten Art verwandt, ihre Morphologie wurde jedoch noch nicht untersucht.)

conferatur (vergleiche mit der genannten Art)

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Die Autoren danken Dr. Tatjana A. Iezhova und Dr. Ivan Maggini für ihre Teilnahme an der Feldforschung und ihre Unterstützung bei der Entnahme von Blutproben.

Open-Access-Förderung durch den Österreichischen Wissenschaftsfonds (FWF). Diese Forschung wurde vom Österreichischen Wissenschaftsfonds (FWF) gefördert [P 33480]. Zum Zweck des offenen Zugangs hat der Autor eine öffentliche CC BY-Urheberrechtslizenz auf alle vom Autor akzeptierten Manuskriptversionen angewendet, die sich aus dieser Einreichung ergeben.

Abteilung für Pathobiologie, Institut für Pathologie, Veterinärmedizinische Universität Wien, Wien, Österreich

Josef Harl, Tanja Himmel & Herbert Weißenböck

Naturforschungszentrum, Vilnius, Litauen

Mikas Ilgūnas und Gediminas Valkiūnas

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JH, TH, HW: Studium Konzeption und Design; JH: Originalentwurf schreiben; MI, TH, JH: Entnahme von Blut- und Gewebeproben; JH: Laborarbeiten und molekulargenetische Analysen; GV, TH, HW: Rezension und Redaktion; HW: Projektverwaltung und Fördermittelakquise. Alle Autoren haben das Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Josef Harl.

Die Umweltschutzbehörde, Litauen (Genehmigungen 2018-04-13, Nr. 24; 2019-04-19, Nr. 23; 2020-04-07, Nr. 21; 2021-05-05, Nr. 26-SR- 96) genehmigte die gezielte Probenahme von Vögeln durch das Naturforschungszentrum in Vilnius. Die Entnahme von Blutproben von Vögeln in Österreich wurde von der Institutionellen Ethik- und Tierschutzkommission und der Landesbehörde gemäß §§ 26ff genehmigt. Tierversuchsgesetz, Tierversuchsgesetz 2012-TVG 2012, Österreich (BMWFW-68.205/0036-WF/V/3b/2017), und Gewebeproben wurden von Schlachtkörpern entnommen, die routinemäßig pathologischen Untersuchungen unterzogen wurden.

Unzutreffend.

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

CytB-Sequenzdaten, die für die DNA-Haplotyp-Netzwerke und Kreisdiagramme verwendet werden, die die Verteilung der Haemoproteus-Abstammungslinien in Vogelwirten und geografischen Regionen zeigen.

Ergebnisse der RDP5-Rekombinationstests zur Analyse der 18S-Sequenzen der untersuchten Haemoproteus-Linien.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Harl, J., Himmel, T., Ilgūnas, M. et al. Die 18S-rRNA-Gene von Haemoproteus (Haemosporida, Apicomplexa)-Parasiten europäischer Singvögel mit Anmerkungen zu einer verbesserten Parasitendiagnostik. Malar J 22, 232 (2023). https://doi.org/10.1186/s12936-023-04661-9

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Eingegangen: 19. April 2023

Angenommen: 27. Juli 2023

Veröffentlicht: 10. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s12936-023-04661-9

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