Screening nicht

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 5294 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Saccharomyces cerevisiae ist ein Arbeitspferd der industriellen Biotechnologie, da der Organismus bei der Alkoholfermentation eine herausragende Rolle spielt und über eine Reihe hochentwickelter genetischer Werkzeuge zur Manipulation seines Stoffwechsels verfügt. Allerdings ist S. cerevisiae nicht für die Überproduktion vieler Massenbioprodukte geeignet, da die Toxizität die Produktion bei hohen Titern einschränkt. Hier verwenden wir einen Hochdurchsatztest, um 108 öffentlich zugängliche Hefestämme auf Toleranz gegenüber 20 g L−1 Adipinsäure (AA), einem Nylonvorläufer, zu untersuchen. Wir identifizieren 15 tolerante Hefen und wählen Pichia occidentalis für die Produktion von cis,cis-Muconsäure (CCM), der Vorstufe von AA, aus. Durch die Entwicklung eines Genomeditierungs-Toolkits für P. occidentalis demonstrieren wir die Fed-Batch-Produktion von CCM mit einem maximalen Titer (38,8 g L−1), einer Ausbeute (0,134 g g−1 Glucose) und einer Produktivität (0,511 g L−1 h−1). ), der alle mit S. cerevisiae erzielten Messwerte übertrifft. Diese Arbeit bringt uns der industriellen Bioproduktion von AA näher und unterstreicht die Bedeutung der Wirtsauswahl bei der Bioverarbeitung.

Historisch gesehen war Bierhefe (Saccharomyces cerevisiae) der bevorzugte mikrobielle Wirt für die Überproduktion von Kraftstoffen, Chemikalien und Pharmazeutika. Aufgrund des geringen Werts vieler Massenchemikalien und Biokraftstoffe sind die für die Produktion im kommerziellen Maßstab erforderlichen Konzentrationen jedoch häufig toxisch für S. cerevisiae und andere Modellorganismen. Beispielsweise ist S. cerevisiae nicht in der Lage, das Wachstum in niedrigen bis mäßigen Konzentrationen von Butanol (2 %)1, Vanillin (0,05 %)2, Benzaldehyd (0,1–0,2 %)3 und vielen organischen Säuren (0,25–2,5 %) aufrechtzuerhalten. 4,5,6. Organische Säuren stellen eine besondere Herausforderung bei der Bioverarbeitung dar, da ein idealer Bioprozess mit organischen Säuren bei saurem pH-Wert durchgeführt würde, was die nachgelagerte Gewinnung der undissoziierten Form vereinfacht und die Notwendigkeit der Aufrechterhaltung des pH-Werts während der Fermentation umgeht. Allerdings ist die Säuretoxizität umgekehrt proportional zum pH-Wert, da undissoziierte Säuren (pH < pKa) frei in die Zellen diffundieren und im Zytosol dissoziieren (pH 5–7)7. Um Produkttoxizität zu vermeiden, wird die Kultivierung der meisten organische Säuren produzierenden Stämme von S. cerevisiae und anderen Mikroben daher bei einem pH-Wert > pKa8,9,10 durchgeführt.

Adipinsäure ist eine C6-Dicarbonsäure, die bei der Herstellung von Nylon 6,6 verwendet wird. Mit einer jährlichen Produktion von drei Millionen Tonnen und einem Weltmarkt von sechs Milliarden US-Dollar11 wurde Adipinsäure vom US-Energieministerium12 als „Superrohstoff“ eingestuft. Der weltweite Bedarf an Adipinsäure wird derzeit über einen chemischen Prozess mit Cyclohexan und Salpetersäure gedeckt. Diese Methode nutzt jedoch petrochemische Ressourcen und setzt Lachgas, ein starkes Treibhausgas, frei, was die Suche nach nachhaltigeren Wegen zu seiner Herstellung anregt. Es gibt keine natürlichen Wege für die Adipinsäure-Biosynthese, es wurden jedoch mindestens acht manipulierte biochemische Wege für ihre Bioproduktion vorgeschlagen11. Von diesen Wegen wurden große Fortschritte mit der cis,cis-Muconsäure (CCM)-Route erzielt. Diese Strategie nutzt drei heterologe Enzyme, 3-Dehydroshikimat-Dehydratase, Protocatechinsäure-Decarboxylase und Catechol-Dioxygenase, für die Synthese von CCM aus 3-Dehydroshikimat, einem Zwischenprodukt des Shikimat-Weges. CCM wird durch Hydrierung durch Enoat-Reduktase-Enzyme in Adipinsäure umgewandelt, doch bisher charakterisierte Bakterienvarianten funktionieren in Hefewirten schlecht13 und erreichen eine molare Umwandlung von CCM in Adipinsäure von <0,9 %14. In Abwesenheit einer geeigneten hefeaktiven Enoatreduktase wurde S. cerevisiae so manipuliert, dass es CCM mit einem Titer, einer Ausbeute und einer Produktivität von bis zu 22,5 g L−1, 0,1 g g−1 Glucose und 0,21 g L−1 synthetisiert h−1 bzw.9,10. Trotz dieser Fortschritte werden Hefe-CCM-Prozesse bei pH 5–6 durchgeführt, was deutlich über dem pKa von CCM (3,87) liegt und die Säure in ihrer dissoziierten Form hält, um die Produkttoxizität zu begrenzen.

Als Reaktion auf die schlechte Verträglichkeit von S. cerevisiae gegenüber vielen Massenbioprodukten hat sich der Schwerpunkt auf das Screening nichtkonventioneller Hefearten auf Phänotypen verlagert, die für industrielle Anwendungen besser geeignet sind15. Die Stammauswahl ist ein kritischer und oft übersehener Aspekt der Bioprozessentwicklung, da die Auswahl eines mikrobiellen Wirts, der auf das Zielendprodukt zugeschnitten ist, wahrscheinlich die Eingriffe in die Stammtechnik reduziert, die nachgeschaltete Trennung vereinfacht, die Produkttoxizität begrenzt und die Gesamtprozessmetriken verbessert16. Beispielsweise ist Yarrowia lipolytica ein ölhaltiger und osmotoleranter Wirt, der sich gut für die Produktion von Fettsäuren und Alkanen eignet17, Kluyveromyces marxianus ist eine schnell wachsende thermotolerante Hefe18 und Pichia kudriavzevii ist ein robuster säuretoleranter Wirt, der für die Produktion verschiedener Arten verwendet wird organische Säuren19. Ungefähr 1500 Hefearten wurden in mehr als 100 Gattungen klassifiziert und öffentliche Kulturarchive enthalten Tausende verschiedener Hefestämme. Die meisten dieser Hefearten können im Labor mit Standardmedien20 kultiviert werden, und große Fortschritte in der Genomsequenzierung, Systembiologie und Stammtechnik haben die Kosten und den Arbeitsaufwand für die genetische Domestizierung nichtkonventioneller Wirte drastisch reduziert. Für verschiedene Hefearten, darunter Y. lipolytica21, K. marxianus18 und P. pastoris22, wurden ausgefeilte genetische Toolkits entwickelt, die über Saccharomyces hinaus neue Möglichkeiten für die Wirtsauswahl bieten.

In dieser Studie untersuchen wir 108 verschiedene Hefestämme aus öffentlichen Kultursammlungen auf natürliche Toleranz gegenüber hohen Konzentrationen von Adipinsäure und anderen Dicarbonsäuren. Unser Screening identifiziert mehrere Pichia-Arten als potenzielle industrielle Wirte für die Produktion verschiedener organischer Säuren. Basierend auf Antibiotika-Empfindlichkeit, Plasmidtransformation und CRISPR-Cas9-Editing-Assays wählen wir P. occidentalis für eine hohe Produktion von CCM, dem direkten Vorläufer von Adipinsäure, aus. Unter Fed-Batch-Bedingungen synthetisiert gentechnisch veränderter P. occidentalis 38,8 g L−1 CCM mit einer maximalen Ausbeute und Produktivität, die alle bisherigen mit S. cerevisiae erzielten Werte übertrifft.

Um eine Bibliothek nichtkonventioneller Hefen für das Screening potenzieller säuretoleranter Wirte aufzubauen, haben wir öffentliche Kulturbestände nach Nicht-Saccharomyces-Stämmen untersucht und Stämme mit gemeldeter Säuretoleranz ausgewählt, sofern verfügbar. Insgesamt wurden 153 Stämme von 83 verschiedenen Arten erhalten, von denen 124 erfolgreich in YM-Medium bei 30 °C kultiviert wurden und 108 in unserem Test erfolgreich gescreent wurden, während der Rest in YPD nicht zuverlässig wachsen konnte. Die letzten 108 Stämme umfassten 66 Arten aus 28 Gattungen (Ergänzungsdaten 1).

Das anschließende Screening umfasste die Kultivierung von Stämmen in YPD mit 20 g L-1 Zitronensäure (0,1 M; YPDcit; Abb. 1a) oder YPD mit 20 g L-1 Adipinsäure (0,137 M; YPDAA; Abb. 1b). Die Zugabe von Adipinsäure senkte den pH-Wert von YPD auf ~3,7 (pKa1 = 4,41, pKa2 = 5,41) und die Zugabe von Zitronensäure senkte den pH-Wert von YPD auf ~3,0 (pKa1 = 3,13, pKa2 = 4,76, pKa3 = 6,39). Das YPDAA-Medium ergab eine große Vielfalt an Wachstumsphänotypen. Trotz eines höheren pH-Werts war die Korrelation zwischen dem Wachstum von YPD und YPDAA (R2 = 0,685) geringer als die des Wachstums von YPD und YPDcit (R2 = 0,905), was darauf hindeutet, dass Adipinsäure das Wachstum von mehr Stämmen beeinflusste.

a Wachstum von Hefestämmen in YPD im Vergleich zu YPD, ergänzt mit 0,1 M Zitronensäure (YPDcit). b Wachstum von Hefestämmen in YPD im Vergleich zu YPD, ergänzt mit 0,15 M Adipinsäure (YPDAA). Das Wachstum wurde durch Messung der Fläche unter der Kurve (AUC) der Wachstumskurven beurteilt. Jeder Datenpunkt stellt ein einzelnes Replikat von n = 3 unabhängigen biologischen Replikaten für jeden Hefestamm dar. Gestrichelte Linien zeigen die durchschnittlichen AUCs für S. cerevisiae CEN.PK113-7D in jeder Wachstumsbedingung. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Wir verwendeten zwei Kriterien zur Auswahl der Stämme für nachfolgende Screening-Runden. Zunächst definierten wir die Adipinsäuretoleranz als eine Wachstumsrate bei YPDAA (geschätzt als Fläche unter der Kurve bei OD600), die im Vergleich zum Wachstum bei YPD nicht mehr als 20 % langsamer ist. Zweitens haben wir Stämme ausgewählt, deren Wachstumsraten in YPD (gemessen als Fläche unter Dehnungs-Wachstumskurven bei OD600) im Vergleich zum Kontrollstamm (S. cerevisiae CEN) nicht mehr als 20 % langsamer waren, um ein robustes Wachstum der Stämme unter Standardlaborbedingungen sicherzustellen .PK 113-7D). Trotz der Verwendung von reichhaltigem YPD-Medium konnten einige Stämme ohne Säureinhibitoren in der vorgegebenen Zeit nicht auf eine OD600 >1,0 wachsen.

Die Anwendung unserer Screening-Kriterien führte zur Identifizierung von 15 schnell wachsenden und Adipinsäure-toleranten Stämmen aus der ursprünglichen Gruppe von 108 Kandidaten (Tabelle 1). Insbesondere Stämme der Gattung Pichia waren unter den Adipinsäure-toleranten Kandidaten reicher; Von den fünfzehn Stämmen waren sieben Pichia (47 %), während Pichia nur 10 % der ursprünglichen Stammsammlung ausmachte.

Die Überrepräsentation von Pichia-Stämmen führte zu weiteren Untersuchungen der Pichia-Gruppe auf säuretolerante Wirte. Es wurden weitere acht Pichia-Stämme hinzugefügt, von denen drei von Arten stammten, die im ersten Screening nicht vertreten waren (Candida sorboxylosa, Pichia norvegensis und Pichia exigua). Trotz seines Namens wurde C. sorboxylosa durch eine phylogenetische Gesamtgenomanalyse in die Gattung Pichia eingeordnet23. Basierend auf der Adipinsäuretoleranz von P. occidentalis Y-7552 haben wir in unserem ersten Screening auch zwei neue Stämme von P. occidentalis (Y-6545 und YB-3389) hinzugefügt.

Anschließend wurde ein Säuretoleranz-Screening in definiertem Yeast Nitrogen Base (YNB)-Medium durchgeführt, um Stämme mit robustem Wachstum sowohl in definierten als auch in reichhaltigen Medien zu identifizieren. Interessanterweise zeigten bestimmte P. occidentalis-Stämme einen Wachstumsdefekt in YNB. Insbesondere konnten P. occidentalis Y-6545 und YB-3389 in der vorgegebenen Zeit (24 Stunden) in 1 × YNB keinen OD600 von 1,0 erreichen, verglichen mit einem OD600 von ~1,75 in YPD (ergänzende Abbildung 1). Eine Erhöhung der YNB-Konzentration von 1× (1,7 g L−1) auf 3× (5,1 g L−1) milderte diese Einschränkung. Da YNB aus einer Mischung von 20 Vitaminen und Salzen besteht, ist die Art dieser offensichtlichen Nährstoffbeschränkung nicht bekannt. Um ein robustes Wachstum aller Hefestämme sicherzustellen, wurden nachfolgende Screening-Experimente in 3× YNB durchgeführt.

Um säuretolerante Phänotypen weiter zu charakterisieren, führten wir eine anschließende Screening-Runde in definiertem Medium durch, um die Fähigkeit von 10 Pichia-Kandidatenstämmen zu bewerten, auf drei verschiedenen Dicarbonsäuren unterschiedlicher Kettenlängen zu wachsen, nämlich Bernsteinsäure (C4), Glutarsäure (C5) und Adipinsäure (C6) (Abb. 2a). Jedem definierten Medium wurden Säuren in einer Konzentration von 0,15 M und einem pH-Wert von 2,8 zugesetzt. Bei den getesteten Dicarbonsäuren zeigte der Kontrollstamm S. cerevisiae CEN.PK 113-7D unter der Annahme eines vergleichbaren Dissoziationsgrads zwischen den Dicarbonsäuren eine stetige Abnahme der Wachstumsrate mit zunehmender Säurekettenlänge. Adipinsäure, die am längsten untersuchte Dicarbonsäure, hemmte das Wachstum von S. cerevisiae bei einer Konzentration von 0,15 M (21,9 g L−1) vollständig (Abb. 2b). Dieser allgemeine Trend wurde auch bei den meisten Pichia-Stämmen beobachtet, mit Ausnahme der drei Stämme von P. occidentalis, bei denen die Wachstumsrate im Allgemeinen mit der Kettenlänge zunahm (P < 0,001) (Abb. 2a). Insgesamt zeigten ein oder mehrere Stämme von P. kluyveri, P. kudriavzevii, P. manshurica und P. occidentalis eine bemerkenswerte Toleranz gegenüber mehreren Dicarbonsäuren.

a Maximale Wachstumsraten der Kandidatenstämme in 3× YNB, ergänzt mit Bernstein-, Glutar- oder Adipinsäure (jeweils 0,15 M). Alle dicarbonsäurehaltigen Medien wurden nach Zugabe von 0,15 M der jeweiligen Dicarbonsäure auf einen pH-Wert von 2,8 eingestellt. Saures Medium ist 3× YNB-Medium mit einem auf 2,8 eingestellten pH-Wert und neutrales Medium ist 3× YNB-Medium ohne pH-Einstellung. Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± Standardabweichung von n = 3 unabhängigen biologischen Proben dar. b Repräsentative Wachstumskurven von S. cerevisiae CEN.PK und P. occidentalis-Stamm Y-7552 in 3× YNB, ergänzt mit 0,15 M (22 g L−1) Adipinsäure. Das Wachstum wurde durch Messung der OD600 in willkürlichen Einheiten (arb.-Einheiten) beurteilt. Für jede Wachstumsbedingung werden drei unabhängige biologische Replikate überlagert. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Wir haben außerdem 93 Hefestämme in YPD-Medium und YPD mit 0,1 M Citratpuffer, pH 3,0 (YPDcit) gescreent. Dieser Zustand wirkte jedoch nicht ausreichend hemmend, da die meisten Stämme bei YPD und YPDcit vergleichbare Werte erreichten (Abb. 1a). Es wurde berichtet, dass Zitronensäure bei pH 4,5 toxischer für Hefen ist als bei pH 3,0, da die dissoziierte Form dazu neigt, zweiwertige Kationen zu binden, was eine mögliche Erklärung für unsere Beobachtungen darstellt.

Zusätzlich zu Dicarbonsäuren haben wir 26 Pichia-Stämme auf mehrere Monocarbonsäuren unter denselben Bedingungen gescreent (definiertes 3× YNB-Medium mit 0,15 M Säure, pH 2,8). Nur ein Stamm wuchs in Essigsäure (P. manshurica Y-27978) und keiner der getesteten Stämme wuchs in Propion-, Butter- oder Valeriansäure. Unter der Annahme vergleichbarer Dissoziationsgrade zwischen Monocarbonsäuren deuten diese Ergebnisse auf ein höheres Maß an Toxizität hin, die durch Propionsäure, Buttersäure und Valeriansäure in äquimolaren Konzentrationen verursacht wird.

Basierend auf unserem Screening auf Adipinsäuretoleranz haben wir acht Pichia-Kandidatenstämme als potenzielle CCM-Produktionswirte ausgewählt. Wir haben zunächst die Kohlenstoffquellennutzung der acht ausgewählten Stämme bewertet, indem wir die Fähigkeit zur Nutzung von Xylose, einem in pflanzlicher Lignocellulose reichlich vorhandenen C5-Zucker, getestet haben. Das Screening der Xylose-Nutzung durch Aufbringen von Kolonien auf Agarplatten, die Xylose als einzige Kohlenstoffquelle enthielten, ergab, dass P. fermentans 562 NCYC der einzige adipinsäuretolerante Pichia-Stamm war, der zur Xylose-Nutzung in der Lage war (Abb. 3a), was mit den phänotypischen Charakterisierungsdaten der Hefe übereinstimmt20 (Ergänzung). Tabelle 1). Zusätzlich zur Nutzung von Kohlenstoffquellen erfordert die Eignung von Stämmen für die Gen- und Stoffwechseltechnik die Fähigkeit, gemeinsame selektierbare Marker zu verwenden und fremdes genetisches Material einzuführen. Dementsprechend wurden die acht ausgewählten Pichia-Stämme auf Anfälligkeit gegenüber hohen Konzentrationen von G418 (1000 μg mL-1), Hygromycin (600 μg mL-1), Nourseothricin (100 μg mL-1) und Zeocin (300 μg mL-1) untersucht ) (Abb. 3a). Mit Ausnahme von P. membranifaciens NCYC 55 und P. manshurica Y-27978 waren alle Stämme resistent gegen 300 μg mL−1 Zeocin. Im Gegensatz dazu waren fast alle Stämme in den getesteten Konzentrationen empfindlich gegenüber Nourseothricin und Hygromycin. G418 war gegen etwa die Hälfte der getesteten Stämme wirksam. Von den drei Stämmen von P. occidentalis war nur der Stamm Y-7552 anfällig für G418, während Nourseothricin und Hygromycin gegen alle drei Stämme wirksam waren.

a Xylose-Nutzung, Antibiotika-Empfindlichkeit und Transformationseffizienz von Adipinsäure-toleranten Pichia spp. Die Stämme werden nach Adipinsäuretoleranz (AUC in YPD mit 20 g L−1 Adipinsäure) sortiert und die Xyloseverwendung und Anfälligkeit gegenüber vier gängigen Hefeantibiotika wird angezeigt. Die Transformationseffizienz unter Verwendung eines Plasmids, das HygR verleiht, wird auf die nächste Größenordnung gerundet angegeben. Transformanten von P. kudriavzevii 2658 NCYC und P. membranifaciens NCYC55 wurden nicht nachgewiesen (ND). Wiederholte Plasmidtransformations- und Antibiotika-Empfindlichkeitstests führten routinemäßig zu ähnlichen Ergebnissen. b ADE2-Deletionsstrategie, die bei Adipinsäure-toleranten Pichia eingesetzt wird. Große Homologieregionen (~800 bp) wurden entworfen, die die ADE2-Kodierungssequenz flankieren. c Struktur von ADE2 pCas CRISPR-Cas9-Vektoren, die vorklonierte ade2Δ-Donorkassetten enthalten. Spenderkassetten wurden in die BglII-Stelle von pCas-Vektoren vorkloniert. d Lückenreparaturstrategie der pCas-Vektorassemblierung in Adipinsäure-toleranten Pichia. pCas-Vektoren, die vorklonierte ade2Δ-Donorkassetten enthielten, wurden durch Verdau mit BsaI oder NotI linearisiert und zur Transformation von Pichia-Arten zusammen mit einem überlappenden ADE2-gRNA-PCR-Produkt verwendet. e Die Deletion von ADE2 führt zu rosafarbenen Kolonien in Adipinsäure-toleranten Pichia. Die Transformanten wurden auf YPD-Agarplatten ausplattiert, die Hygromycin ohne Adeninsupplementierung enthielten. Abgebildet ist eine repräsentative YPD-Agarplatte mit P. occidentalis Y-7552. f Screening der ADE2-Deletion bei adipinsäuretoleranten Pichia. Ein pCas-Hyg-CEN6ARS4-Vektor, der über eine ADE2-gRNA und einen Reparaturdonor verfügt, wurde auf P. kluyveri und drei Stämme von P. occidentalis übertragen. Der ADE2-Locus wurde vor der Farbentwicklung in zufällig ausgewählten HygR-Transformanten auf Deletion untersucht. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Nachdem wir wirksame Konzentrationen von Antibiotika identifiziert hatten, untersuchten wir die acht Pichia-Kandidatenstämme auf Transformation mithilfe von Vektoren, die einen Hygromycin-Resistenzmarker aus dem Ashbya gossypii TEF1-Promotor (PTEF1) exprimieren. Wir haben die erfolgreiche Transformation von sechs der acht Pichia-Stämme bestätigt (Abb. 3a). Die höchste Transformationseffizienz wurde mit P. fermentans erreicht, dem am wenigsten Adipinsäure toleranten der acht Pichia-Kandidatenstämme. Für alle drei Stämme von P. occidentalis, den in dieser Studie identifizierten Stämmen mit der höchsten Adipinsäuretoleranz, wurden Transformanten erhalten. Die Transformationseffizienz von P. occidentalis Y-7552 (102 KBE µg-1 DNA) war höher als die der Stämme Y-6545 und YB-3389 (101 KBE µg-1 DNA).

Basierend auf Antibiotika-Empfindlichkeits- und Plasmidtransformationstests haben wir P. kluyveri und alle drei Stämme von P. occidentalis für Genomeditierungstests ausgewählt, was durch kürzlich veröffentlichte Entwürfe von Genomsequenzen für diese Stämme unterstützt wurde24. Wir haben das ADE2-Gen zur Deletion ausgewählt, da seine Inaktivierung zur Akkumulation eines farbigen Zwischenprodukts zur visuellen Identifizierung von Deletionsmutanten führt (Abb. 3b). Wir erwarteten ein geringes Maß an homologer Rekombination in Pichia-Stämmen , was uns dazu veranlasste, ein CRISPR-System zu verfolgen, bei dem homologiegesteuerte Reparaturvorlagen in pCas-Abgabevektoren vorkloniert wurden (Abb. 3c), wodurch die Notwendigkeit umgangen wurde, mehrere überlappende DNA-Fragmente zusammenzusetzen in Pichia.

Wir untersuchten zunächst die Fähigkeit eines hauseigenen CRISPR-Cas9-Vektors (pCas-Hyg-CEN6ARS4), der den CEN6/ARS4-Ursprung von S. cerevisiae sowie gRNA- und cas9-Expressionskassetten besitzt (Abb. 3c), in Pichia zu funktionieren. Wir haben ade2Δ-Homologiereparaturvorlagen für alle vier Pichia-Kandidatenstämme entworfen, indem wir Homologiearme mit ca. 800 bp, die die ADE2-Kodierungssequenz flankieren, und kleine Teile (ca. 100–150 bp) der Promotor- und Terminatorelemente fusionierten (Abb. 3b). Mit diesem Design führt die homologiegesteuerte Reparatur eines ADE2-Doppelstrangbruchs zu einer großen Deletion (~2 kb) der gesamten ADE2-Kodierungssequenz. Nach dem Zusammenbau der ade2Δ-pCas-Vektoren in S. cerevisiae wurden die Vektoren mit BglII linearisiert und zur Transformation des relevanten Pichia-Stamms zusammen mit einer überlappenden ADE2-gRNA für den Zusammenbau durch Lückenreparatur in Pichia verwendet (Abb. 3d). Mit diesem Ansatz erhielten wir HygR-Kolonien für alle vier Pichia-Stämme (Abb. 3e), was einen erfolgreichen Vektoraufbau durch Lückenreparatur anzeigt. Nach dem Screening des ADE2-Locus identifizierten wir ade2Δ-Kolonien in allen drei Stämmen von P. occidentalis, konnten jedoch keine ade2Δ-Mutanten aus HygR-Kolonien von P. kluyveri identifizieren (Abb. 3f). Die Bearbeitungseffizienz variierte zwischen 50 % und 69 %, basierend auf dem Screening von 10–13 zufällig ausgewählten HygR-Transformanten.

Insgesamt wurde P. occidentalis Y-7552 als Endwirt für die Produktion von CCM ausgewählt. Der Stamm Y-7552 ist gegenüber mindestens drei Antibiotika (G418, Hygromycin und Nourseothricin) empfindlich, erzielt die höchste Transformationseffizienz der drei P. occidentalis-Stämme (Abb. 3a) und weist den beobachteten Wachstumsdefekt bei 1× YNB nicht auf für die Stämme Y-6545 und YB-3389 (Ergänzende Abbildung 1). Stamm Y-7552 ist diploid und der Typstamm von P. occidentalis27. Der Stamm ist in der Lage, Glucose, Glycerin und Ethanol als einzige Kohlenstoffquellen zu nutzen, wächst jedoch nicht auf Saccharose, Galactose, Lactose, Xylose, Stärke oder Cellobiose20 (Ergänzungstabelle 1). Zusätzlich zu P. kudriavzevii wächst P. occidentalis in einem Medium ohne übliche Hefevitamine, was das Potenzial des Stamms für die industrielle Produktion hochwertiger organischer Säuren erhöht.

Nachdem wir das ADE2-Gen im P. occidentalis-Stamm Y-7552 mithilfe von CRISPR-Cas9 erfolgreich gelöscht hatten, wollten wir Zellen des pCas-Hyg-ADE2-gRNA-Vektors heilen, was ein erforderlicher Schritt für die Durchführung iterativer Runden der CRISPR-Cas9-Genombearbeitung ist. Da das CEN6/ARS4-Replikationsmodul von Saccharomyces cerevisiae abgeleitet ist, erwarteten wir eine chromosomale Integration des pCas-Hyg-CEN6ARS4-Vektors in Pichia. Dementsprechend konnte der Vektor nicht durch bis zu sechsmalige Subkultivierung in nicht-selektivem YPD-Medium geheilt werden, und andere Methoden der Plasmidhärtung waren erfolglos, einschließlich der Kultivierung bei erhöhter Temperatur (37 °C) und der Hitzeschockierung der Zellen bei 42 °C in einer Schein-Lithiumacetat-PEG-Transformation oder beim Versuch, den ursprünglichen HygR-CEN6-ARS4-Vektor durch Einführung eines G418R-CEN6-ARS4- oder NatR-CEN6-ARS4-Vektors in den ade2Δ-Wirt zu verdrängen (ergänzende Abbildung 2). Wir konstruierten auch pCas-G418-ADE2-Vektoren, die den 2μ-Ursprung von S. cerevisiae (pCas-G418-2μ-ADE2) und den panARS-Ursprung des breiten Wirts (pCas-G418-panARS-ADE2) enthielten, und während beide Vektoren die Deletion von ADE2-basierten erleichterten Beim Farbphänotyp und der Kolonie-PCR zeigten alle Transformanten eine stabile Integration der selektierbaren Marker (ergänzende Abbildung 3).

Um die Vektorintegration zu bestätigen, konstruierten wir ein pCas-Derivat ohne funktionellen Plasmidursprung (pCas-G418-NoOri-ADE2). Die Einführung von pCas-G418-NoOri-ADE2 in P. occidentalis erzeugte G418-resistente Transformanten, einschließlich roter ade2Δ-Kolonien (ergänzende Abbildung 4), was auf eine chromosomale Integration hinweist, da dem Vektor ein funktioneller Replikationsursprung fehlt. Insgesamt stimmen diese Daten mit der chromosomalen Integration von pCas-Vektoren in P. occidentalis überein.

Die chromosomale Integration von Vektoren stellt eine Herausforderung für das Stamm-Engineering dar, da chromosomale Marker schwer aus Zellen herauszuschneiden sind und somit nachfolgende Runden der Genombearbeitung behindert werden. Um das Recycling von Antibiotikaresistenzmarkern in P. occidentalis zu ermöglichen, haben wir CRISPR-Cas9 als Mittel zur Inaktivierung oder zum Austausch chromosomaler Antibiotikaresistenzmarker untersucht. Wir haben zunächst das ADE2-Gen mit pCas-G418-CEN6ARS4-ADE2 gelöscht, was eine ade2Δ G418R-Mutante ergab. In einer anschließenden Bearbeitungsveranstaltung führten wir in den Stamm ade2Δ G418R einen pCas-Hyg-CEN6ARS4-Vektor ein, der eine gRNA enthält, die auf den G418-Resistenzmarker abzielt. Das Targeting des chromosomalen G418R-Markers führte zu einem erheblichen Anstieg der Anzahl der HygR-Transformanten im Vergleich zu einer Kontrolltransformation, bei der die G418-gRNA durch eine nicht zielgerichtete gRNA ersetzt wurde (ergänzende Abbildung 5). Obwohl wir keinen exogenen Spender für die Reparatur von Doppelstrangbrüchen (DSBs) einbezogen haben, die an den chromosomalen G418-Marker geliefert wurden, vermuteten wir, dass der neu eingeführte pCas-Hyg-CEN6ARS4-Vektor einen effizienten DSB-Reparaturspender darstellte. Insbesondere beherbergt pCas-Hyg-CEN6ARS4 einen vektorkodierten PTEF1-Hyg-TTEF1-Donor zur Reparatur des DSB, das an die chromosomale PTEF1-G418-TTEF1-Kassette innerhalb des Stammes ade2Δ G418R geliefert wird. Der Verlust der G418-Resistenz wurde durch fehlendes Wachstum auf G418-haltigen YPD-Agarplatten und durch PCR unter Verwendung von für den HygR-Marker spezifischen Primern bestätigt (ergänzende Abbildung 5).

Nachdem wir eine allgemeine Strategie für das Recycling von Antibiotika-Markern entwickelt hatten, testeten wir diesen Ansatz für die Durchführung iterativer Runden der CRISPR-Bearbeitung in P. occidentalis, indem wir unseren ade2Δ-G418R-Mutanten verwendeten, um ein neues Zielgen zu löschen und gleichzeitig den bereits vorhandenen G418R-Marker zu inaktivieren. Für die Gendeletion haben wir FCY1 ausgewählt, das für Cytosin-Desaminase kodiert, da seine Inaktivierung eine Resistenz gegen 5-Fluorocytosin, ein toxisches Analogon von Cytosin, verleiht (ergänzende Abbildung 6). Die Löschung von FCY1 und die Eliminierung von G418R erfordern die Einführung von zwei gRNAs aus einem einzelnen pCas-Hyg-CEN6ARS4-Vektor. Um die Abgabe und Effizienz von zwei gRNA-Spezies zu testen, transformierten wir die ade2Δ G418R-Mutante mit dem linearisierten pCas-Hyg-CEN6ARS4-Vektor zusammen mit FCY1- und G418-gRNAs, die jeweils eine Überlappung mit pCas-Hyg-CEN6ARS4 aufwiesen. Da für die Lückenreparatur nur eine gRNA-Spezies erforderlich ist, besitzen HygR-Kolonien drei mögliche Genotypen: (1) FCY1 G418S-Einzelmutanten; (2) fcy1Δ G418R-Einzelmutanten; oder (3) fcy1Δ G418S-Doppelmutanten. Um den Anteil dieser Genotypen zu bestimmen, führten wir gleiche Mengen an FCY1- und G418-gRNAs ein und untersuchten die resultierenden HygR-Kolonien auf FCY1-Deletion und G418-Anfälligkeit. Das Screening von 18 HygR-Kolonien auf diese Weise ergab 11 G418S-Kolonien, jedoch keine fcy1Δ-Mutanten, was darauf hindeutet, dass die Lückenreparatur ausschließlich unter Verwendung der G418-gRNA erfolgte, obwohl gleiche Mengen an G418- und FCY1-gRNAs vorhanden waren (ergänzende Abbildung 7).

Da das Targeting eines chromosomalen G418R-Markers zu einem erheblichen Anstieg der Anzahl von HygR-Transformanten führt (ergänzende Abbildung 5), vermuteten wir, dass der durch die G418-gRNA gebotene Transformationsvorteil fcy1Δ-Mutantenkolonien verdeckte und ausschließlich FCY1-G418S-Einzelmutanten hervorbrachte. Um dieses Ungleichgewicht zu überwinden, haben wir die relative Menge der G418- und FCY1-gRNA-Spezies titriert. Wir transformierten die ade2Δ-G418R-Mutante mit einem 20-, 10-, 5- und 3-fachen Überschuss an FCY1-gRNA im Vergleich zu G418-gRNA, um den durch die G418-gRNA gebotenen Transformationsvorteil auszugleichen. Das Screening der resultierenden HygR-Kolonien auf FCY1-Deletion und G418-Anfälligkeit ergab mehrere Kolonien, die beide fcy1Δ-G418S-Editierungsereignisse besaßen (ergänzende Abbildung 8). Der größte Anteil an fcy1Δ G418S-Kolonien (37,5 %) wurde durch Einführung eines 10-fachen Überschusses an FCY1-gRNA erreicht, während ein fünffacher und dreifacher Überschuss jeweils 27 % bzw. 25 % doppelt bearbeitete Kolonien ergab. Ein 20-facher Überschuss an FCY1-gRNA begünstigte die FCY1-Deletion, da nur 12,5 % der Kolonien beide fcy1Δ G418S-Editierungsereignisse aufwiesen.

Um weitere Werkzeuge für die Manipulation von P. occidentalis zur Produktion heterologer Metaboliten zu entwickeln, haben wir eine Reihe nativer Promotor- und Terminatorelemente charakterisiert. Wir haben einen geeigneten Fluoreszenzreporter ausgewählt, indem wir einen Satz von vier Genvarianten des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) mithilfe des P. occidentalis-TDH3-Promotors (PTDH3), dem Ortholog des stärksten nativen Promotors in S. cerevisiae, chromosomal integriert haben28,29. Enhanced GFP (eGFP), Superfolder GFP (sfGFP), Envy GFP und mNeonGreen GFP wurden mithilfe von pCas-Hyg-CENARS4-FCY1 in den FCY1-Locus von P. occidentalis integriert. Kulturen, die mNeonGreen enthielten, erzeugten die stärkste Fluoreszenz, gefolgt von Envy, sfGFP und eGFP (Abb. 4a).

eine OD-normalisierte Fluoreszenzintensität von P. occidentalis Y-7552-Stämmen, die häufige GFP-Genvarianten exprimieren. GFP-kodierende Varianten wurden mit PTDH3 und TRPL3 aus P. occidentalis Y-7552 exprimiert. GFP-exprimierende Kolonien werden mit UV-Belichtung dargestellt. b OD-normalisierte Fluoreszenzintensität von mNeonGreen, exprimiert von 12 P. occidentalis-Genpromotoren mit dem RPL3-Terminator. c OD-normalisierte Fluoreszenzintensität von mNeonGreen, exprimiert vom GPM1-Promotor und 12 P. occidentalis-Genterminatoren. Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± Standardabweichung von n = 3 unabhängigen biologischen Proben dar. Alle GFP-Konstrukte wurden in den FCY1-Locus von P. occidentalis integriert. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Anschließend haben wir eine Gruppe von 12 P. occidentalis-Promotoren und -Terminatoren ausgewählt, basierend auf den in S. cerevisiae 28, 29, 30 (Ergänzungsdaten 2) charakterisierten. Promotorkonstrukte wurden stromaufwärts von mNeonGreen mit einem festen RPL3-Terminator kloniert, während Terminatoren stromabwärts von mNeonGreen mit einem festen GPM1-Promotor kloniert wurden. Vollständige mNeonGreen-Expressionskassetten wurden in den Vektor pCas-Hyg-CEN6ARS4 kloniert, flankiert von einer Homologie zum P. occidentalis-FCY1-Gen, und in den FCY1-Locus integriert. Die Fluoreszenzleistung der mNeonGreen-Promotor- und Terminator-Integranten wurde anhand von 12-Stunden-Exponentialphasenkulturen quantifiziert. Die Fluoreszenzausbeute variierte bei den 12 ausgewählten Promotoren und Terminatoren um den Faktor 7 bzw. 6,5 (Abb. 4b, c) und bei allen 24 Konstrukten um den Faktor fast 20, was eine wirksame Modulation der Genexpression in P. occidentalis zeigt. Im Einklang mit S. cerevisiae und anderen Organismen ergab die Expression von mNeonGreen aus PTDH3 die höchste Fluoreszenz. TRPL3 und TVMA2 erleichterten die Expression auf hohem Niveau in P. occidentalis und gehörten zu den leistungsstärksten Elementen aller 5302 in S. cerevisiae getesteten Terminatoren30.

Die Techniken zur CRISPR-Cas9-Genombearbeitung, zum Recycling von Antibiotikamarkern und zur heterologen Genexpression in P. occidentalis ermöglichten es uns, den Wirt für die heterologe Produktion toxischer Säureprodukte zu manipulieren. Obwohl P. occidentalis aufgrund seiner Toleranz gegenüber Adipinsäure ausgewählt wurde, ist die Adipinsäuresynthese der Hefe derzeit schlecht (2,59 mg L−1)14, da bakterielle Enoat-Reduktase-Enzyme in eukaryotischen Wirten nicht funktionell exprimiert werden können13,14. In Ermangelung eines solchen hefeaktiven Enoat-Reduktase-Enzyms entschieden wir uns dafür, P. occidentalis für die Synthese von CCM, der direkten Vorstufe von Adipinsäure, zu manipulieren.

Wir haben zunächst P. occidentalis Y-7552 entwickelt, um Protocatechinsäure (PCA) zu produzieren, den gebundenen heterologen Metaboliten im vorgeschlagenen CCM-Syntheseweg (Abb. 5a). Wir haben AROZ, das für DHS-Dehydratase aus Podospora anserina (PaAROZ) kodiert, in den ARO4-Locus von P. occidentalis integriert. Der resultierende Stamm (LP620) produzierte 1,0 g L-1 PCA in Batch-Mikrotiterplattenkultivierungen aus 20 g L-1 Glucose (Abb. 5b). Als nächstes integrierten wir eine rückkopplungsresistente Mutante der 3-Desoxy-d-arabino-heptulosonat-7-phosphat (DAHP)-Synthase (DAHP) aus P. occidentalis (ARO4K225L)31 in LP620 (was LP622 ergab), was den PCA-Titer auf 1,9 g L−1 erhöhte . Die anschließende Integration von aroB und aroD aus E. coli, die für 3-Dehydroquinat-Synthase bzw. 3-Dehydroquinat-Dehydratase kodieren, in den P. occidentalis ARO3-Locus des Stamms LP622 (Ergebnis von LP630) ermöglichte einen weiteren Anstieg des PCA-Titers auf 2,0 g L− 1 in Batch-Mikrotiterplattenkultivierungen (Abb. 5b).

ein heterologer Weg zur Synthese von CCM aus endogenem 3-Dehydroshikimat (DHS). Der native Hefe-Shikimat-Weg ist blau dargestellt, während der heterologe CCM-Syntheseweg schattiert und rot dargestellt ist. b Titer von CCM-Pathway-Zwischenprodukten in Kulturüberständen aufeinanderfolgender gentechnisch veränderter P. occidentalis-Produktionsstämme. Metabolitentiter werden in g L−1 für PCA, CAT und CCM dargestellt. Sternchen (*) kennzeichnen einen signifikanten Anstieg oder Abfall des Metabolitentiters im Vergleich zum jeweiligen Elternstamm (P < 0,05). Statistische Unterschiede zwischen Eltern- und Derivatstämmen wurden mit dem zweiseitigen Student-t-Test getestet. Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± Standardabweichung von n = 3 unabhängigen biologischen Proben dar. c Kultivierung eines CCM-produzierenden P. occidentalis-Stammes (LP635) in einem Fed-Batch-Fermenter unter Verwendung eines mineralischen Mediums bei pH 6,0. Während der Kultivierung wurden das Wachstum der Biomasse (OD600) und die Akkumulation von Metaboliten des CCM-Signalwegs im Kulturmedium gemessen. OD600 wird in willkürlichen Einheiten (arb. Units) angegeben. CAT Catechol, CCM cis,cis-Muconsäure, DAHP 3-Desoxy-d-arabinoheptulosonat 7-phosphat, DHQ 3-dehydroquinat, DHS 3-dehydroshikimat, E4P erythrose 4-phosphat, FMN Flavinmononukleotid, PCA-Protocatechinsäure, PEP Phosphoenolpyruvat, prFMN prenyliertes Flavinmononukleotid. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Auf dem heterologen Weg wandelt PCA-Decarboxylase (AroY) PCA in Catechol um, das anschließend durch 1,2-Catechol-Dioxygenase (HQD2) in CCM umgewandelt wird. Wir haben zwei bakterielle AroY-Varianten (AroY von Klebsiella pneumoniae und EcdC von Enterobacter cloacae) auf die Umwandlung von PCA in Catechol im Stamm LP630 untersucht. PCA-Decarboxylasen erfordern einen prenylierten FMN-Cofaktor, der durch eine Flavin-Prenyltransferase in S. cerevisiae (ScPad1)32 synthetisiert wird. Wir konnten im Genom von P. occidentalis kein mögliches PAD1-kodierendes Gen identifizieren, was uns dazu veranlasste, die Paarung von aroY und ecdC mit ScPAD1 zu untersuchen. Die Analyse der PCA-Decarboxylase-Stämme ergab die Produktion von 1,7 g L-1 (aroY + ScPAD1) und 1,3 g L-1 (ecdC ​​+ ScPAD1) Catechol und einen nahezu vollständigen Verbrauch von PCA (Abb. 5b; ergänzende Abb. 9). Im Gegensatz dazu führte das Weglassen von ScPAD1 nicht zu einer Veränderung der PCA-Spiegel im Vergleich zum Kontrollstamm (ergänzende Abbildung 9), und die Paarung von aroY oder ecdC mit HQD2 aus Candida albicans (CaHQD2) in Abwesenheit von ScPAD1 ergab weder Catechol noch CCM.

Um den heterologen CCM-Produktionsweg zu vervollständigen, führten wir CaHQD2 in unseren Catechol-Produktionsstamm ein, der aroY + ScPAD1 (LP632) exprimiert. Da die CCM-Produktionsstämme von S. cerevisiae unter Fed-Batch-Bedingungen PCA anreichern9,10, fügten wir eine zusätzliche Kopie von aroY mit CaHQD2 hinzu, was den Stamm LP635 ergab. Die Einführung von aroY + CaHQD2 führte zur Produktion von 2,5 g L−1 CCM mit einer geringen Menge PCA (0,06 g L−1) und keinem nachweisbaren Brenzkatechin (Abb. 5b).

Nachdem wir die CCM-Synthese im 96-Well-Plattenformat etabliert hatten, charakterisierten wir unseren P. occidentalis CCM-Produktionsstamm (LP635) in der Fed-Batch-Fermentation. Wir haben zunächst die CCM-Produktion unter Kultivierung bei pH 6,0 bewertet, um unseren P. occidentalis-Wirt mit früheren Studien mit analogen gentechnisch veränderten Stämmen von S. cerevisiae zu vergleichen9,10. Unter diesen Bedingungen synthetisierte der Stamm LP635 38,8 g L-1 CCM mit einer Ausbeute und Produktivität von 0,134 g g-1 Glucose bzw. 0,511 g L-1 h-1 (Abb. 5c). Es wurde eine geringe Menge an PCA und Brenzkatechin nachgewiesen (kombinierte Konzentration <0,4 g/l).

Nachdem wir eine hohe CCM-Produktion bei mittlerem pH-Wert etabliert hatten, charakterisierten wir als nächstes unseren CCM-Produktionsstamm ohne pH-Kontrolle. Unter diesen Bedingungen sank der pH-Wert während der Chargenphase schnell auf 2,0 und das Wachstum kam zum Stillstand, was durch einen Rückgang der CO2-Produktion belegt wurde (ergänzende Abbildung 10). Durch eine schrittweise Erhöhung des pH-Werts von 2,0 auf 4,5 in Schritten von 0,5 Einheiten konnte das Wachstum vorübergehend auf pH-abhängige Weise wiederhergestellt werden. Beispielsweise stellte eine Erhöhung des pH-Werts der Kultur von 3,0 auf 3,5 das Wachstum wieder her, was durch eine nahezu sofortige Wiederherstellung der CO2-Produktion belegt wurde. Das Wachstum war jedoch vorübergehend, da die CO2-Konzentration etwa 6 Stunden nach dem Anstieg des pH-Werts zu sinken begann. Durch eine Erhöhung des pH-Wertes von 3,5 auf 4,0 konnte das Wachstum wieder wiederhergestellt werden. Unter diesen Bedingungen synthetisierte der Stamm LP635 7,2 g L−1 CCM. Glycerin sammelte sich während der Kultivierung an und erreichte in Proben im Spätstadium eine Konzentration von 12,4 g L−1.

Obwohl P. occidentalis aufgrund seiner robusten Toleranz gegenüber Adipinsäure bei niedrigem pH-Wert ausgewählt wurde, vermuteten wir, dass das schlechte Wachstum unseres CCM-Produktionsstamms bei niedrigem pH-Wert eine Folge der CCM-Toxizität war. Um diese Hypothese zu testen, verglichen wir zunächst die Wachstumskurven von Wildtyp-P. occidentalis und Stämmen, die für die PCA- und CCM-Produktion in 3 × YNB entwickelt wurden (ergänzende Abbildung 11). Unser manipulierter PCA-produzierender Stamm zeigte im Vergleich zum Wildtyp P. occidentalis einen Rückgang der maximalen Wachstumsrate (µmax 0,23 h−1 bzw. 0,32 h−1), dennoch blieb die endgültige Biomassekonzentration zwischen den beiden Stämmen weitgehend unverändert (ODmax 1,8). bzw. 1,9). Der gleiche gentechnisch veränderte Stamm zeigte im Vergleich zum Wildtyp-Stamm auch eine längere Verzögerungsphase. Im Gegensatz dazu verursachte die Manipulation von P. occidentalis für die CCM-Produktion eine Verringerung der maximalen Wachstumsrate und der Biomassekonzentration um 62 % bzw. 32 % (μmax 0,12 h−1 und ODmax 1,3) im Vergleich zum Wildtyp P. occidentalis. Obwohl diese Ergebnisse auf eine CCM-Toxizität hinweisen, ist unser CCM-Produktionsstamm stärker genetisch verändert als unser PCA-produzierender Stamm, was die Möglichkeit erhöht, dass eine Wachstumshemmung auf Auswirkungen der Genombearbeitung zurückzuführen sein könnte, wie z. B. Vektorintegration oder metabolische Belastung durch erhöhte Expression von cas9.

Um die Wirkung von CCM auf die Fitness von P. occidentalis besser zu ermitteln, verglichen wir die Wachstumskurven von Wildtyp-P. occidentalis in 3× YNB, gesättigt mit CCM (<2 g L−1) oder Adipinsäure (22 g L−1). In beiden Fällen betrug der pH-Wert des Mediums <3,5. Während das Wachstum von P. occidentalis in Gegenwart von 22 g L-1 Adipinsäure (μmax 0,28 h-1 und ODmax 1,8) im Vergleich zu Medien ohne Säurezusatz (μmax 0,32 h-1 und ODmax 1,9) weitgehend unbeeinflusst blieb, war eine Ergänzung mit < 2 g L-1 CCM verursachten eine Verringerung der maximalen Wachstumsrate und der OD600 um 38 % bzw. 42 % (μmax 0,20 h-1 und ODmax 1,1) (ergänzende Abbildung 11), was eine signifikante Toxizität von CCM im Vergleich zu Adipinsäure zeigt. Die CCM-Toxizität war nicht spezifisch für P. occidentalis Y-7552, da alle untersuchten adipinsäuretoleranten Pichia-Arten und -Stämme trotz einer bemerkenswerten Toleranz gegenüber Adipinsäure (Abb. 3a) eine deutliche Toxizität gegenüber <2 g L−1 CCM aufwiesen (ergänzende Abbildung 12). , Tabelle 1). Das Wachstum von P. fermentans 562 NCYC und der S. cerevisiae-Kontrolle wurde in Gegenwart von <2 g L−1 CCM vollständig gehemmt.

In dieser Studie haben wir 108 Hefestämme aus 28 Gattungen gescreent und P. occidentalis als einen unkonventionellen Wirt mit außergewöhnlicher Toleranz gegenüber mehreren Dicarbonsäuren, insbesondere Adipinsäure, identifiziert. Wir haben ein umfassendes Stamm-Engineering-Toolkit für die Domestizierung von P. occidentalis entwickelt, einschließlich Techniken für die Bearbeitung des CRISPR-Cas9-Genoms, das Recycling von Antibiotika-Markern und die Expression heterologer Gene auf hohem Niveau. Wir nutzten unser Toolkit, um den Wirt für die Produktion von CCM, der direkten Vorstufe von Adipinsäure, auf hohem Niveau zu entwickeln, indem wir ein einfaches Mineralmedium in einer kontrollierten Fed-Batch-Kultivierung verwendeten. Unter diesen Bedingungen übertraf die Produktion von CCM durch unseren Stamm (38,8 g L−1 bei 0,511 g L−1 h−1) alle früheren CCM-Stämme von S. cerevisiae in mehr als 10 Studien und erreichte bis zu 22,5 g L−1 CCM bei 0,21 g L−1 h−1 (Lit. 10). Unser Stamm übertraf auch einen kürzlich entwickelten und manipulierten Pseudomonas putida-Wirt mit einem CCM-Ausstoß von 33,7 g L−1 CCM bei 0,18 g L−1 h−1 (Lit. 8). Die Produktion biobasierter Säuren im kommerziellen Maßstab erfordert typischerweise Titer von mindestens 50–100 g L−1 bei einer Rate von mehr als 1 g L−1 h−1 (Ref. 33,34) und dementsprechend sind unsere Bemühungen vielversprechend Grundlage für die industrielle Produktion von CCM und Adipinsäure unter Verwendung nichtkonventioneller Hefen wie P. occidentalis.

CCM wird durch Hydrierung durch bakterielle Enoat-Reduktase-Enzyme35, die derzeit in Hefen nur schlecht funktionieren13, in Adipinsäure umgewandelt. Dementsprechend wurde P. occidentalis aufgrund seiner robusten Toleranz gegenüber Adipinsäure ausgewählt, wir haben den Stamm jedoch so konstruiert, dass er CCM produziert, da eine geeignete Enoatreduktase fehlt. Unerwarteterweise war CCM für P. occidentalis wesentlich toxischer als Adipinsäure, selbst wenn Adipinsäure in einer zehnfach höheren Konzentration zugeführt wurde (22 g L−1 im Vergleich zu <2 g L−1). Die CCM-Toxizität war pH-abhängig, da das Wachstum des Stammes LP635 zwischen pH 2,0 und 3,5, deutlich unter dem pKa von CCM (3,87), nicht aufrechterhalten werden konnte, bei pH 6,0 jedoch weitgehend unbeeinflusst blieb (OD600 von 327 bei Fed-Batch-Fermentation). Ermöglicht eine hochproduktive Synthese von CCM (38,8 g L−1). Eine frühere Fed-Batch-Studie mit gentechnisch veränderten S. cerevisiae berichtete ebenfalls über Wachstumsstopp und unvollständige Zuckerverwertung bei CCM-Konzentrationen über 2,5 g L−1 (Lit. 6). Vor dem Hintergrund dieser Erkenntnisse untersuchten wir unsere Hefen mit der größten Adipinsäure-Toleranz auf CCM-Toleranz. Dabei zeigte sich, dass alle drei P. occidentalis-Isolate die tolerantesten Stämme gegenüber beiden Säuren waren, was auf ähnliche Toxizitätsmechanismen zwischen CCM und Adipinsäure schließen lässt. Aufgrund der unerwarteten Toxizität von CCM gegenüber allen getesteten Hefen dürfte die Ausweitung des heterologen Weges auf Adipinsäure die Stammfitness und die Metabolitenproduktion bei niedrigem pH-Wert verbessern. Daher sollten sich zukünftige Bemühungen auf die Identifizierung oder Entwicklung alternativer Enoat-Reduktase-Varianten mit verbesserter Funktionalität in Hefewirten konzentrieren. Mittlerweile ist die In-situ-Extraktion ein vielversprechender Weg zur Minderung der CCM-Toxizität, da eine breite Palette biokompatibler Extraktionsmittel auf eine effiziente Entfernung von CCM und verwandten Metaboliten untersucht wurde6,36.

Andere Gruppen haben gezeigt, dass bestimmte Pichia-Stämme gegenüber hohen Konzentrationen organischer Säuren tolerant sind37,38, die Anzahl der getesteten Stämme war jedoch vergleichsweise gering und bestand größtenteils aus Umweltisolaten und nicht aus gewöhnlichen Stämmen. Abgesehen von einer Studie zur Untersuchung der Milchsäureproduktion unter Verwendung eines neuartigen Isolats37 wurde P. occidentalis nicht in großem Umfang als Metabolic-Engineering-Wirt eingesetzt und Untersuchungen zu seiner Säuretoleranz konzentrierten sich hauptsächlich auf Probleme mit Lebensmittelkontaminationen39,40. Daher ist es unwahrscheinlich, dass P. occidentalis für das Screening ausgewählt worden wäre, wenn wir den Umfang unseres Tests reduziert oder Stämme auf der Grundlage einer einfachen Literaturrecherche ausgewählt hätten. Darüber hinaus identifizierte unser Screening drei Stämme von P. occidentalis als die tolerantesten gegenüber Adipinsäure aller 108 untersuchten Stämme. Mithilfe von P. occidentalis Y-7552 haben wir Methoden zur Transformation und CRISPR-vermittelten Genombearbeitung entwickelt. Aufgrund der geringen Transformationseffizienz und homologen Rekombination von Pichia spp. haben wir ein CRISPR-Cas9-Abgabesystem entwickelt, bei dem homologiegesteuerte Reparaturspender in pCas-Vektoren vorkloniert werden. In diesem Zusammenhang wurde die Effizienz der CRISPR-vermittelten Genombearbeitung in Pichia pastoris durch die Einbeziehung eines ARS in DNA-Reparaturspender um das bis zu 25-fache verbessert41. Mithilfe dieses Systems werden Reparaturspender stabil an Tochterzellen vererbt und sind resistent gegen DNA-Exonukleasen, wodurch die Wahrscheinlichkeit gezielter Bearbeitungsereignisse erhöht wird42. Während es uns gelang, die ADE2- und FCY1-Loci zu inaktivieren und Mutanten mit durchsuchbaren Phänotypen (rote Pigmentierung bzw. 5-FC-Resistenz) hervorzubringen, konnten wir trotz des Screenings mehrerer Plasmide keinen replikativen Plasmidursprung für die Verwendung in P. occidentalis identifizieren. einschließlich des breiten panARS-Ursprungs43. Um dieser Herausforderung zu begegnen, haben wir eine CRISPR-vermittelte Marker-Austauschstrategie entwickelt, die wir nutzten, um bei der Konstruktion unseres endgültigen CCM-Produktionsstamms fünf aufeinanderfolgende Runden der Genombearbeitung durchzuführen. Um unser genetisches Toolkit für P. occidentalis zu erweitern, haben wir eine Gruppe von 12 Promotoren und 12 Terminatoren charakterisiert, die es uns ermöglichten, die Enzymaktivität um den Faktor 20 zu modulieren. Eine genomweite Analyse aller 5.302 S. cerevisiae-Terminatoren ergab einen 81 -facher Unterschied in der Terminatoraktivität30, während die relative Stärke der Promotoren von P. occidentalis (PTPI1 < PPGK1 < PTEF1 < PTDH3) einem ähnlichen Gesamtmuster folgte wie die von P. pastoris (PPGK1 < PTPI1 < PTEF1 < PTDH3)44. Zusammengenommen ermöglichen unsere CRISPR-Cas9-Bearbeitungstechnik und unser Genexpressions-Toolkit ein effizientes Stamm-Engineering von P. occidentalis und tragen zur wachsenden Sammlung nichtkonventioneller Hefen wie Yarrowia lipolytica, Kluyveromyces marxianus und Komagataella phaffi (P. pastoris) bei45 , die für industrielle Anwendungen domestiziert wurden.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das Screening von Kultursammlungen auf potenziell adipinsäuretolerante Hefen P. occidentalis als einen unkonventionellen und unerschlossenen Wirt für die industrielle Produktion von CCM und Adipinsäure identifizierte. Die hier entwickelten Stamm-Engineering-Tools und -Techniken bilden eine solide Grundlage für die Entwicklung säuretoleranter Pichia und ermöglichen den Aufbau äußerst robuster Stämme zur Produktion organischer Säuren.

Alle 153 in dieser Studie bestellten Nicht-Saccharomyces-Hefestämme sind in den Zusatzdaten 1 aufgeführt. Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-7D (MATα) wurde zum Zusammenbau von Plasmiden in vivo durch Lückenreparatur verwendet. Sofern nicht anders angegeben, wurden alle Hefekulturen in YPD (10 g L-1 Bacto-Hefeextrakt, 20 g L-1 Bacto-Pepton, 20 g L-1 Glucose) gezüchtet. Rekombinante S. cerevisiae-Stämme wurden auf YPD-Agar mit 400 μg mL-1 G418 oder 200 μg mL-1 Hygromycin B selektiert. Rekombinante Pichia-Stämme wurden auf YPD-Agar mit 1200 μg mL-1 G418, 600 μg mL-1 Hygromycin B selektiert. oder 100 μg mL−1 Nourseothricin. Die in dieser Arbeit verwendeten Plasmide und gentechnisch veränderten Stämme sind in den Tabellen 2 bzw. 3 aufgeführt. Die in dieser Arbeit verwendeten Oligonukleotide sind in den Zusatzdaten 2 aufgeführt.

Stämme wurden aus Depots erhalten und zum Animpfen von flüssigem Hefe-Malz-Medium (YM) verwendet, das 5 g L-1 Pepton, 3 g L-1 Hefeextrakt, 3 g L-1 Malzextrakt und 10 g L-1 enthielt Traubenzucker. Die Stämme wurden bei 30 °C bis zur vollständigen Sättigung (bis zu sieben Tage) gezüchtet und anschließend in 15 % Glycerin bei –80 °C gelagert.

Für Hochdurchsatz-Säuretoleranztests wurden gefrorene Stämme in Chargen von 30 in YPD-Medium bei 30 °C wiederbelebt. Sobald alle Kulturen sichtbar trüb waren, wurden die Stämme in einer flachen Platte mit 96 Vertiefungen in 180 μl YPD rückverdünnt (1:20) und 8 Stunden lang oder bis die Kulturen einen OD600 von 1,8 erreichten, wachsen gelassen. Nach der zweiten Inkubation wurde die OD600 auf einem Plattenlesegerät gemessen und mithilfe eines benutzerdefinierten Skripts eine CSV-Datei mit den absoluten Volumina an Verdünnungsmittel und Zellkultur erstellt, die erforderlich sind, um jede Kultur auf eine OD600 von 1,8 zu verdünnen. Anschließend wurden Verdünnungen unter Verwendung des Span-8 eines Biomek FXP-Liquid-Handling-Systems durchgeführt, um eine Zwischenplatte mit 30 Stämmen in dreifacher Ausfertigung zu erstellen, einschließlich S. cerevisiae CEN.PK 113-7D als Kontrolle. Aus den Zwischenplatten wurden 10 μl Inokulum entnommen und in eine Versuchsplatte mit 170 μl des entsprechenden Wachstumsmediums verteilt. Das Endvolumen jeder Vertiefung betrug 180 μl und die anfängliche OD600 aller Stämme betrug 0,1. Erste Tests zur Toleranz gegenüber organischen Säuren wurden in YPD-Medium, YPDcit (YPD mit 0,1 M Zitronensäure, zugesetzt, um den pH-Wert auf 3,0 zu senken) oder YPDAA (YPD mit 20 g L−1 Adipinsäure, was zu einem pH-Wert von 3,7 führt) durchgeführt. . In Minimalmedien durchgeführte Tests mit organischen Säuren verwendeten eine gemeinsame Basis von 20 g L-1 Glucose, 5,1 g L-1 YNB ohne Aminosäuren und ohne Ammoniumsulfat, 5,0 g L-1 Ammoniumsulfat und 0,15 M relevanter organischer Substanz Säure. HCl wurde tropfenweise zugegeben, bis ein End-pH-Wert von 2,8 erreicht war. Nach der Inokulation wurden die Platten mit Parafilm versiegelt und 48 Stunden lang bei 30 °C in Tecan Sunrise-Plattenlesegeräten inkubiert. Die Platten wurden 15 Minuten lang orbital geschüttelt, vor der OD600-Messung 5 Minuten ruhen gelassen und das Schütteln erneut gestartet.

Für CCM-Toleranztests wurden Wachstumskurven dreifach in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen erstellt, die 180 µl Medium enthielten. Stämme, die für die PCA- oder CCM-Produktion entwickelt wurden, wurden in 3× YNB-Medium mit 2 % Glucose getestet. Um die Toleranz gegenüber exogenem CCM zu gewährleisten, wurde CCM zu 2 g L−1 zu 3× YNB gegeben, 4–6 Stunden lang leicht auf 50 °C erhitzt und die resultierende teilweise gelöste Aufschlämmung filtriert. Um die Toleranz gegenüber exogener Adipinsäure zu gewährleisten, wurde Adipinsäure unter leichtem Erhitzen in einer Konzentration von 22 g L−1 (0,15 M) gelöst. Die Kulturen wurden mit gesättigten Übernachtkulturen auf einen anfänglichen OD600 von etwa 0,1 beimpft und in Parafilm eingewickelt, um die Verdunstung zu minimieren. Die Absorption wurde bei 600 nm alle 20 Minuten mit einem Sunrise-Absorptions-Mikroplattenlesegerät (Tecan) über einen Zeitraum von 30 Stunden gemessen. Die maximalen spezifischen Wachstumsraten (µmax h−1) wurden aus dreifachen Kulturen bestimmt und basierten auf OD600-Messungen.

Genetische Veränderungen in der Hefe wurden über CRISPR-Cas9-vermittelte genomische Integration46,47 und In-vivo-DNA-Assemblierung48 vorgenommen. Sequenzen von Integrationsorten, gRNAs, ADE2, Promotoren und Terminatoren aus Adipinsäure-toleranten Pichia spp. wurden aus gemeldeten Entwürfen von Genomsequenzen erhalten24. Cas9 und gRNAs wurden mit pCas-G418-CEN6ARS4 (Ref. 46) oder pCas-Hyg-CEN6ARS4 (Ref. 49) an Pichia-Stämme übertragen. Für die chromosomale Integration in Pichia wurden Homologiereparaturdonoren zunächst über Lückenreparatur in S. cerevisiae in pCas-Vektoren kloniert. Homologie-Reparaturspender wurden so konzipiert, dass sie etwa 800 bp flankierende Homologie zum Pichia-Genom besitzen, zusätzlich zu 40–50 bp interner Überlappung und 40–50 bp externer Überlappung zu BglII-verdautem pCas-G418-CEN6ARS4 für den Zusammenbau in S. Cerevisien. pCas-Vektoren, die Reparatur-Donor-Templates enthalten, wurden aus S. cerevisiae gewonnen, mit BsaI oder NotI linearisiert und 200 ng wurden verwendet, um Pichia-Stämme mit einem fünf- bis zehnfachen Überschuss einer gRNA-Spezies zu transformieren, die auf den genomischen Integrationsort von Pichia abzielt (600 ng) im Vergleich zu eine gRNA, die auf chromosomale G418- oder Hyg-Resistenzmarker abzielt (120 ng) in einer standardmäßigen 50-μL-Lithiumacetat-Transformation. gRNAs wurden mithilfe einer zweistufigen SOE-PCR neu ausgerichtet. Die Zellen wurden 40 Minuten lang einem Hitzeschock bei 42 °C ausgesetzt, 16 Stunden lang ohne Schütteln erholt und auf YPD-Agarplatten mit geeigneten Antibiotika ausplattiert. Die Auswahl von gRNAs, die auf Pichia-Loci abzielen, wurde mit CCTop50 durchgeführt. In dieser Studie verwendete gRNA-Zielstellen sind in Tabelle 4 aufgeführt. Große intergene Regionen (>1,5 kb) wurden als Loci für die DNA-Integration in P. occidentalis ausgewählt. P. occidentalis-Promotoren (0,6–1,5 kb) wurden durch Auswahl der vollständigen Sequenz, flankiert von den Ziel- und Upstream-Kodierungssequenzen, identifiziert. P. occidentalis-Terminatoren (0,3–1,2 kb) wurden durch Auswahl der vollständigen Sequenz, flankiert von den Ziel- und Downstream-Kodierungssequenzen, identifiziert. Pichia-Expressionskassetten sind in Tabelle 5 angegeben. Sequenzen von P. occidentalis-Promotoren und -Terminatoren sowie Integrationsorte sind in den Zusatzdaten 3 bzw. 4 angegeben. Gene und synthetische DNAs sind in den Zusatzdaten 5 aufgeführt.

Pichia-Kolonien, die GFP-Varianten exprimierten, wurden dreifach in Standard-Mikrotiterplatten mit V-Boden und 96 Vertiefungen gepflückt, die 0,15 ml YNB-Medium und 20 g L-1-Glukose enthielten. Die Kulturen wurden über Nacht gezüchtet und in tiefen 96-Well-Platten in 0,8 ml frischem YNB-Medium auf eine anfängliche OD600 von etwa 0,1 verdünnt. Die Kulturen wurden vor der OD600- und Fluoreszenzmessung 12 Stunden lang unter Schütteln inkubiert. Die Fluoreszenz wurde mit dem Plattenlesegerät M200 (Tecan) bei einer Anregungswellenlänge von 485 nm und einer Emissionswellenlänge von 525 nm gemessen. Die Verstärkung wurde für jede Probe manuell angepasst. Als Kontrolle für die Autofluoreszenz wurde ein Stamm ohne GFP einbezogen.

Pichia-Kolonien, die heterologe Metaboliten synthetisierten, wurden dreifach in tiefe 96-Well-Platten mit 0,5 ml YPD-Medium gepflückt. Die Kulturen wurden über Nacht gezüchtet, 50-mal in frischem YPD-Medium verdünnt und 48–72 Stunden lang inkubiert. Die OD600 der Kulturen wurde mit dem Plattenlesegerät M200 (Tecan) gemessen und die Proben wurden vor der HPLC- oder LC-MS-Analyse bei –20 °C eingefroren.

Kontrollierte Fed-Batch-Fermentationen wurden in 3-l-BioBundle-Fermentern (Applikon) durchgeführt. Die Kultivierungstemperatur wurde bei 30 °C gehalten. Die Fermentationen wurden bei pH 6,0 durch automatisierte Titration mit 12,5 % NH3 oder ohne pH-Kontrolle und schrittweise Anpassung des pH-Werts während der Kultivierung mit 4 N NaOH durchgeführt, um das Wachstum von CCM-produzierenden Stämmen bei niedrigem pH-Wert (pH 2,0–3,5) zu unterstützen. Der gelöste Sauerstoff wurde bei 30 % der Luftsättigung gehalten (Belüftungsrate 1,5 l/min). Die Abgaszusammensetzung (Konzentration von O2 und CO2) wurde mit einem Tandem-Multiplex-Gasanalysator (Magellan BioTech) analysiert. Das Bioreaktor-Inokulum wurde in einem 500-ml-Schüttelkolben mit 50 ml Batch-Medium (40 g Glucose, 2,5 g KH2PO4, 6,0 g (NH4)2SO4, 1,0 g MgSO4·7H2O, 5 ml Vitamin-Stammlösung und 5 ml Spurenelement-Stammlösung) erzeugt Liter) und 36-48 Stunden lang bei 30 °C gezüchtet. Die Zusammensetzung der Vitamin- und Spurenelement-Stammlösungen ist in Pyne et al. beschrieben. 51. Die Zellen wurden gewaschen und in 0,9 % NaCl suspendiert und zum Beimpfen (OD600 = ~0,3) von 1 l Chargenmedium verwendet. Die Kultur wurde im Batch-Modus betrieben, bis die Glukose erschöpft war, gefolgt von der Fed-Batch-Phase mit automatischer Zugabe von Futter. Das Nährmedium für die Kultivierung bei pH 6,0 enthielt 600 g Glucose, 20,8 g KH2PO4, 5 g (NH4)2SO4, 8,3 g MgSO4·7H2O, 5 g K2SO4, 20 ml Vitaminstammlösung und 20 ml Spurenelementstammlösung pro Liter. Das Nährmedium für die Kultivierung ohne pH-Kontrolle enthielt 360 g Glucose, 7,5 g KH2PO4, 30 g (NH4)2SO4, 3 g MgSO4·7H2O, 7,5 ml Vitamin-Stammlösung und 7,5 ml Spurenelement-Stammlösung pro Liter. Insgesamt wurden drei Tage lang alle 12 Stunden Proben entnommen. Das Zelltrockengewicht (g L−1) wurde unter Verwendung eines Umrechnungsfaktors von 0,36 g L−1 pro OD600 (gravimetrisch bestimmt) berechnet. Bioreaktordaten wurden mit BioXpert 1.3 (Applikon) gesammelt und analysiert.

LC-MS wurde verwendet, um PCA und CCM aus Kulturen zu quantifizieren, die in tiefen Platten mit 96 Vertiefungen gezüchtet wurden. Um Metaboliten zu extrahieren, wurden 7 μl Zellbrühe mit 27 μl 100 % Acetonitril kombiniert und die Proben 5 Minuten lang kräftig geschüttelt, gefolgt von der Zugabe von 146 μl 0,123 % Ameisensäure (0,1 % Endkonzentration). Die Extrakte wurden 10 Minuten lang bei 4000 RCF zentrifugiert und die Überstände vor der LC-MS-Analyse weiter 10-fach in 15 % Acetonitril mit 0,1 % Ameisensäure verdünnt. Zehn μl verdünnter Extrakt wurden auf einem 1290 Infinity II LC-System (Agilent Technologies) mit einer Zorbax Rapid Resolution HT C18-Säule (50 × 2,1 mm, 1,8 μm; Agilent Technologies) aufgetrennt. Metaboliten wurden unter Verwendung des folgenden Gradienten getrennt: 2 % B bis 10 % B von 0 bis 4 Minuten (0,3 ml/min), 10 % B bis 85 % B von 4 bis 6 Minuten (0,3 ml/min), gehalten bei 85 % B von 6 bis 7 Minuten (0,3 ml/min), 85 % B bis 2 % B von 7 bis 7,1 Minuten (0,3 ml/min) und bei 2 % B von 7,1 bis 9 Minuten (0,45 ml/min) gehalten min−1). Lösungsmittel A war 0,1 % Ameisensäure in Wasser und Lösungsmittel B war 0,1 % Ameisensäure in 100 % ACN. Nach der Trennung wurde der Eluent in ein Agilent 6545 Quadrupol-Time-of-Flight-MS (QTOF-MS; Agilent Technologies) im Negativmodus injiziert. Der Probenboden und der Säulenraum wurden auf 4 °C bzw. 30 °C eingestellt. Die Strömungsgeschwindigkeit und Temperatur des Hüllgases wurden auf 10 l/min bzw. 350 °C eingestellt, während Trocknungs- und Zerstäubungsgase auf 12 l/min bzw. 55 psig eingestellt wurden. Die Trocknungsgastemperatur wurde auf 325 °C eingestellt. QTOF-Daten wurden mit der MassHunter Workstation-Softwareversion B.06.00 (Agilent Technologies) verarbeitet und manipuliert.

Glucose, Glycerin, PCA, Catechol und CCM aus Fed-Batch-Fermentationsbrühenproben wurden mithilfe von HPLC-UV und RID analysiert und quantifiziert. Zur Analyse von CCM wurde Kulturbrühe mit einem gleichen Volumen 10 N NaOH kombiniert und 10 Minuten unter Schütteln inkubiert. Zelltrümmer wurden 10 Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit zentrifugiert und der Überstand in 40 mM PBS, pH 7,4, verdünnt. Alternativ wurde CCM durch 50-faches Verdünnen des Kulturüberstands direkt in Wasser oder 40 mM PBS, pH 7,4, analysiert. Zur Analyse von Glucose, Glycerin, PCA und Catechol wurde die Kulturbrühe in 40 mM PBS, pH 7,4, verdünnt und 10 Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit zentrifugiert. Fünf μl der extrahierten Brühe wurden auf einem Agilent 1200 HPLC-System, das mit einer Aminex Fast Acid Analysis-Säule ausgestattet war, aufgetrennt. Die Metaboliten wurden isokratisch mit 10 mM H2SO4 bei einer Flussrate von 0,8 ml/min getrennt. PCA und Catechol wurden bei 210 nm nachgewiesen. CCM wurde bei 260 nm nachgewiesen. Spuren wurden mit ChemStation Version B.02.00 (Agilent Technologies) gesammelt und analysiert.

Alle numerischen Werte sind als Mittelwerte ± Standardabweichung dargestellt. Statistische Unterschiede zwischen Kontroll- und gentechnisch veränderten Stämmen wurden mittels zweiseitiger Student-t-Tests unter der Annahme gleicher Varianzen bewertet. In allen Fällen wurden P-Werte < 0,05 als signifikant angesehen. Die statistische Signifikanz der Dicarbonsäurekettenlänge wurde mittels linearer OLS-Regression mit stündlichen Wachstumsraten als Antwortvariable bewertet. Statistische Analysen wurden mit Excel 2306 Build 16.0.16529.20164 (Microsoft) oder Prism Version 9.5.1 (GraphPad) durchgeführt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Auf Entwurfsgenomsequenzen relevanter säuretoleranter Pichia-Stämme kann unter der BioProject-Zugangsnummer PRJNA870168 zugegriffen werden. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Referenzen herunterladen

Wir danken Nicholas Gold und der Concordia Genome Foundry für die Unterstützung beim Hochdurchsatz-Screening. Wir danken auch Marcos DiFalco für die Unterstützung bei LC-MS-Analysen. Diese Studie wurde finanziell durch ein NSERC-Industrial Biocatalysis Network (IBN)-Stipendium, ein NSERC Discovery-Stipendium und durch das bp Biosciences Center unterstützt. MEP wurde durch ein NSERC-Postdoktorandenstipendium unterstützt, KK wurde durch ein Concordia University Horizon Postdoktorandenstipendium unterstützt und LN wurde durch ein FQRNT DE-Doktorandenstipendium für ausländische Studierende unterstützt. VJJM wird von einem Forschungslehrstuhl der Concordia University unterstützt. MW wird von einem Canada Research Chair unterstützt.

Michael E. Pyne

Derzeitige Adresse: Department of Biology, University of Western Ontario, Ontario, Kanada

James A. Bagley

Aktuelle Adresse: Centre for Applied Synthetic Biology, Concordia University, Montréal, QC, H4B 1R6, Kanada

Lauren Narcross

Aktuelle Adresse: Amyris, Inc., Emeryville, CA, USA

Kaspar Kevvai

Aktuelle Adresse: Pivot Bio, Berkeley, CA, USA

Kealan Exley

Aktuelle Adresse: Novo Nordisk Foundation Centre for Biosustainability, Lyngby, Dänemark

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Michael E. Pyne, James A. Bagley.

Fachbereich Biologie, Concordia University, Montréal, QC, H4B 1R6, Kanada

Michael E. Pyne, James A. Bagley, Lauren Narcross, Kaspar Kevvai, Kealan Exley, Meghan Davies, Malcolm Whiteway und Vincent JJ ​​Martin

Zentrum für angewandte synthetische Biologie, Concordia University, Montréal, QC, H4B 1R6, Kanada

Michael E. Pyne, Lauren Narcross, Kaspar Kevvai, Kealan Exley, Meghan Davies, Malcolm Whiteway und Vincent JJ ​​Martin

BenchSci, Toronto, ON, Kanada

Meghan Davies

bp Biosciences Center, San Diego, Kalifornien, USA

Qingzhao Wang

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MEP, JAB, LN, KK, QW und VJJM haben die Forschung entworfen. MEP, JAB und LN führten die Experimente durch. KE und MD halfen bei Vorstudien und Fed-Batch-Anbau. VJJM und QW überwachten die Forschung. MEP, JAB, MW und VJJM haben das Manuskript geschrieben.

Korrespondenz mit Vincent JJ ​​Martin.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Nuno Mira, Tsutomu Tanaka und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Pyne, ME, Bagley, JA, Narcross, L. et al. Screening unkonventioneller Hefen auf Säuretoleranz und Entwicklung von Pichia occidentalis zur Produktion von Muconsäure. Nat Commun 14, 5294 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-41064-5

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Eingegangen: 24. April 2023

Angenommen: 22. August 2023

Veröffentlicht: 31. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-41064-5

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