Höhere Werte der Pseudomonas aeruginosa-LasB-Elastase-Expression sind mit einer frühen Expression verbunden

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 14208 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Pseudomonas aeruginosa ist ein häufiger Erreger bei Patienten mit Mukoviszidose (CF) und trägt wesentlich zur fortschreitenden Lungenschädigung bei. P. aeruginosa-Elastase (LasB), ein wichtiger Virulenzfaktor, wurde als potenzielles Ziel für eine Antivirulenztherapie identifiziert. Hier versuchten wir, die P. aeruginosa-Isolate zwischen frühen und etablierten Stadien der Infektion bei CF-Patienten zu unterscheiden und festzustellen, ob LasB mit einem der beiden Stadien assoziiert war. Das lasB-Gen wurde aus 255 klinischen P. aeruginosa-Isolaten von 70 CF-Patienten aus der Region Toulouse (Frankreich) amplifiziert. Neun LasB-Varianten wurden identifiziert und 69 % der Isolate erzeugten nachweisbare Mengen an LasB-Aktivität. Durch hierarchisches Clustering anhand experimenteller und klinischer Daten wurden zwei Klassen von Isolaten unterschieden, die als „frühe“ und „etablierte“ Infektion bezeichnet werden. Eine multivariate Analyse ergab, dass die Isolate aus der Frühinfektionsklasse eine höhere LasB-Aktivität, schnelles Wachstum, Tobramycin-Empfindlichkeit, nicht schleimige, pigmentierte Kolonien und einen Wildtyp-lasR-Genotyp aufweisen. Diese Merkmale wurden mit jüngeren Patienten mit polymikrobiellen Infektionen und hohem pFEV1 in Verbindung gebracht. Unsere Ergebnisse zeigen einen Zusammenhang zwischen erhöhter LasB-Aktivität in P. aeruginosa-Isolaten und einer Infektion im Frühstadium bei CF-Patienten. Daher ist es diese Patientengruppe, die vor dem Ausbruch einer chronischen Erkrankung am meisten von neuartigen Therapien gegen LasB profitieren könnte.

Zystische Fibrose (CF) ist eine genetische Erkrankung, die durch eine Mutation verursacht wird, die zum vollständigen oder teilweisen Funktionsverlust des CF-Transmembran-Leitfähigkeitsregulators (CFTR) führt, einem Protein, das für den Ionentransport durch apikale Membranen von Epithelzellen verantwortlich ist. CF ist eine multisystemische Erkrankung, die Lunge, Bauchspeicheldrüse und Verdauungstrakt, das männliche Fortpflanzungssystem und andere Drüsenorgane betrifft1. Die CF-Lunge ist anfällig für Infektionen und Pseudomonas aeruginosa ist einer der häufigsten Bakterien, die diese Nische besiedeln2. P. aeruginosa ist ein gramnegativer opportunistischer Krankheitserreger, der in der Natur allgegenwärtig ist und dessen vielseitiges Genom und erhebliche funktionelle Anpassungsfähigkeit es ihm ermöglichen, in verschiedenen Umgebungen zu gedeihen3. Die Anpassung von P. aeruginosa an die raue Umgebung und den selektiven Druck der CF-Lunge führt zur Entstehung chronischer Infektionen, Resistenzen gegen Antibiotika und zum Verlust von Virulenzfaktoren wie Motilität, Typ-III-Sekretion, Exotoxinen und Proteasen4,5,6. In der CF-Lunge wurde die Etablierung einer chronischen Infektion mit P. aeruginosa mit einer Dysbiose und der Entwicklung eines krankheitsfördernden Mikrobioms in Zusammenhang gebracht7. Chronische P. aeruginosa-Infektionen wurden auch bei anderen Atemwegserkrankungen beschrieben, wie z. B. Non-CF-Bronchiektasien (NCFB) und chronisch obstruktiver Lungenerkrankung (COPD)8,9.

Der Erfolg der Kolonisierung durch P. aeruginosa beruht auf seiner Fähigkeit, eine große Vielfalt an Virulenzfaktoren, einschließlich Toxinen und Proteasen10,11, unter der Kontrolle eines Quorum Sensing (QS)-Regulationssystems12,13 zu produzieren. Das QS-System besteht aus vier bekannten Signalwegen, nämlich dem LasR/LasI-, dem RhlR/RhlI-, dem PqsR-kontrollierten Chinolon-System und dem IQS-System. Die Regulierungsbehörden sind hierarchisch organisiert, wobei LasR an der Spitze14 steht. Die LasB-Elastase, das am häufigsten vorkommende Protein im Sekretom, ist ein wichtiger Virulenzfaktor, der unter der Kontrolle des positiven Regulators LasR15,16 exprimiert wird. Tatsächlich kann die Expression von LasB in ΔlasR-Mutanten17 oder durch die Zugabe von Quorum-Sensing-Inhibitoren wie trans-Zimtaldehyd zum Kulturmedium18 drastisch reduziert werden. Diese extrazelluläre Protease hat zahlreiche Bakterien- und Wirtssubstrate und löst im Wirt Gewebeschäden und Entzündungen aus19,20. Kürzlich zeigte eine Studie, dass LasB auch die Infiltration von Eosinophilen und die Muzinproduktion fördert21. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass das Vorhandensein von LasB bei der Entstehung einer chronischen Infektion bei Mäusen wichtig ist22.

LasB wurde als potenzielles Ziel für eine Antivirulenztherapie als Alternative oder Ergänzung zu Antibiotika identifiziert19. Um besser zu verstehen, wie eine solche Therapie gezielt zur Behandlung von CF-Patienten eingesetzt werden könnte, versuchten wir, P. aeruginosa-Isolate aus frühen und etablierten (chronischen) Stadien der CF-Infektion zu unterscheiden und festzustellen, ob die LasB-Expression/-Aktivität mit einem der beiden Stadien verbunden war. In dieser Studie untersuchten wir das Vorhandensein von lasB- und lasR-Genen, die Prävalenz verschiedener LasB-Varianten und die Produktion von aktivem LasB in 255 P. aeruginosa-Sputumisolaten von 70 CF-Patienten. Wir haben eine multivariate Analyse durchgeführt, die sowohl klinische als auch experimentelle Daten verwendet, um die Variablen zu identifizieren, die zwischen Isolaten aus frühen und etablierten Infektionen unterscheiden, und um zu bestimmen, ob eine der beiden Gruppen stärker mit höheren Niveaus der LasB-Expression assoziiert ist.

Die 255 in dieser Studie verwendeten P. aeruginosa-Stämme wurden aus Sputumproben von 70 CF-Patienten zwischen Januar 2015 und Juni 2020 isoliert (1–14 Isolate pro Patient) (Tabelle 1 und ergänzende Abbildung S1). Es wurden sowohl pädiatrische als auch erwachsene Patienten eingeschlossen und das Durchschnittsalter (zum Zeitpunkt der ersten Stichprobe) betrug 12 Jahre (Bereich 1–47). pFEV1 wurde zum Zeitpunkt der Probenahme erfasst, außer bei jüngeren Patienten (< 6 Jahre). CFTR-Genotypen waren für alle bis auf sieben Patienten verfügbar; 36 (51 %) trugen Mutationen, die zu abnormaler Verarbeitung und abnormalem Handel (Klasse II) in beiden Allelen des CFTR-Locus23,24 führten, von denen 32 homozygot für die F508-Deletion waren. Der Infektionsstatus der Patienten wurde gemäß den „Leeds-Kriterien“ als chronisch (P. aeruginosa aus > 50 % der Proben in den letzten 12 Monaten isoliert), intermittierend (≤ 50 % der Proben in den letzten 12 Monaten) oder neu klassifiziert (P. aeruginosa zum ersten Mal isoliert)25,26. Wenn im Verlauf der Studie mehrere P. aeruginosa-Isolate von demselben Patienten gewonnen wurden, entwickelte sich die Klassifizierung entsprechend, sodass jedes Isolat mit dem Infektionsstatus des Patienten zum Zeitpunkt der Probenahme verknüpft war. Nach diesen Kriterien wurde bei 26 % der Patienten entweder vor oder während des Studienzeitraums eine chronische P. aeruginosa-Infektion diagnostiziert.

Für 137 Isolate lagen Daten zum mukoiden Phänotyp vor, die unmittelbar nach ihrer Isolierung aus den Sputumproben aufgezeichnet wurden. Anschließend wurden Informationen zur Koloniegröße und Pigmentierung für eine separate, aber überlappende Teilmenge von 98 P. aeruginosa-Isolaten erhalten, die für die multivariate Analyse ausgewählt worden waren. Der Anteil der Isolate, die innerhalb jeder Leeds-Kategorie unterschiedliche phänotypische Merkmale aufwiesen, wurde mit dem erwarteten Anteil verglichen, wenn diese Merkmale mithilfe eines Chi2-Tests zufällig in der Population verteilt wären (Ergänzungstabelle S1 und ergänzende Abbildung S2). Unter den chronischen Isolaten hatten 47 % sehr kleine punktförmige Kolonien, 47 % waren schleimige und 31 % hatten pigmentierte Kolonien. Die ersten beiden Merkmale waren höher als der erwartete Anteil (angepasste p-Werte: 1,33 × 10–3 bzw. 1,69 × 10–5), während das letzte (Pigmentierung) niedriger als erwartet war (angepasster p-Wert: 0,02). . In der intermittierenden Gruppe hatten 16 % der Isolate sehr kleine Kolonien, 68 % hatten eine Pigmentierung (nicht signifikant) und keines von ihnen war schleimig (angepasster p-Wert: 1,89 × 10−3). Schließlich hatten in der neuen Gruppe 5 % der Isolate sehr kleine Kolonien und 7 % waren schleimig, was beides unter dem erwarteten Anteil lag (angepasste p-Werte: 1,98 × 10−2 bzw. 0,028), und 66 % waren pigmentiert (nicht signifikant).

Das lasB-Gen wurde aus allen 255 P. aeruginosa-Isolaten erfolgreich amplifiziert und sequenziert. Es wurden neun LasB-Proteinvarianten identifiziert, von denen drei zusammen 94,5 % der Isolate ausmachten (Tabelle 2), nämlich LasB-1 (identisch mit der PAO1-Wildtyp-Sequenz), LasB-2 (einzelne S241G-Aminosäureveränderung) und LasB-3 (fünf Aminosäureveränderungen: Q102R, S241G, D244N, K282N, R471S). Sechs weitere Varianten mit einer, zwei oder fünf Aminosäuremodifikationen wurden in ein bis fünf Isolaten nachgewiesen. Die Analyse der Pseudomonas.com-Genomdatenbank27 (7960 Genome, davon 99,1 % einschließlich eines lasB-Locus voller Länge zum Zeitpunkt des Schreibens) ergab die gleichen drei Hauptvarianten, nämlich LasB-1 (47,4 %), LasB-2 (17,3 %) und LasB-3 (22,6 %). Fünf der sechs in dieser Studie gefundenen Nebenvarianten waren auch in der Datenbank Pseudomonas.com vertreten, die weitere 140 Varianten enthielt. Wie bereits an anderer Stelle berichtet28, wiesen sieben der acht LasB-Varianten, einschließlich der drei Hauptvarianten, ähnliche LasB-spezifische Aktivitäten in Bezug auf die Hydrolyse des Abz-Substrats auf, die um das Zweifache voneinander entfernt waren, mit Ausnahme von LasB-9, das geringere Werte aufwies Aktivität (Tabelle 2).

Die Amplifikation und Sequenzierung des lasR-Locus wurde für alle bis auf ein Isolat erfolgreich durchgeführt. Davon waren die vorhergesagten Proteine bei 162 (63,8 %) Isolaten mit LasR aus PAO1 (WT) identisch, wohingegen 36 (14,2 %) Mutationen trugen, die zu einem verkürzten Protein führten, und 56 (22,0 %) eine oder mehrere Aminosäuremutationen enthielten oder kleine Deletionen (2 oder 5 Aminosäuren) (Ergänzungstabelle S2). Zum Vergleich: In der Genomdatenbank Pseudomonas.com fehlte der lasR-Locus in 1081 Genomen (13,6 %). Von den Genomen, die lasR enthielten, waren 57,3 % WT, 30,8 % kodierten für eine LasR-Variante und 11,9 % für einen verkürzten LasR. Obwohl der Prozentsatz an WT-LasR hoch ist, weist dieser Ort eine erheblich größere Variabilität auf als die für lasB beobachtete.

Die Aktivität von LasB wurde bestimmt, indem die Hydrolyse des fluoreszierenden Substrats Abz in den Überständen von P. aeruginosa-Kulturen verfolgt wurde. Von den 255 Isolaten zeigten 176 (69 %) LasB-Aktivität, während 79 (31 %) unterhalb der positiven Nachweisschwelle lagen. Die 79 negativen Proben wurden durch Western Blot weiter analysiert, um die LasB-Proteinproduktion zu testen (Beispiele in der ergänzenden Abbildung S3 dargestellt). Von diesen zeigten 29 eine 33-kDa-Bande, die dem LasB-Protein entsprach, während 50 kein LasB-Protein aufwiesen. Von dieser letzteren Gruppe enthielten 43 (86 %) eine Mutation in lasR, wobei 27 (54 %) davon voraussichtlich zu einem inaktiven LasR-Protein führen würden.

Um Verzerrungen aufgrund des Auftretens mehrerer gleichzeitiger Isolate desselben Patienten zu minimieren und somit eine aussagekräftigere statistische Analyse zu ermöglichen, wurde die Datenbank gemäß dem in der ergänzenden Abbildung S4 dargestellten Arbeitsablauf verfeinert. Kurz gesagt: Wenn es mehr als ein Isolat aus jedem Infektionsstadium eines Patienten gab, wurden Vertreter ausgewählt, die sich aufgrund ihrer LasB-Aktivität und lasB/lasR-Genotypen phänotypisch oder genotypisch unterschieden. Dies führte zu einem Datensatz von 102 „einzigartigen“ Isolaten, der zur Untersuchung der Korrelation zwischen der durch Abz-Hydrolyse gemessenen LasB-Aktivität und anderen Variablen verwendet wurde. Innerhalb dieser Gruppe zeigten 70 Isolate (68,6 %) einen nachweisbaren Grad an Abz-Hydrolyse, dh LasB-positiv, und 32 (31,4 %) waren negativ. Das Durchschnittsalter der LasB-positiven Gruppe betrug 12 Jahre und der mittlere pFEV1 85, während für die LasB-negative Gruppe das Durchschnittsalter 22 Jahre und der mittlere pFEV1 71 betrug (Tabelle 3). Es gab keine signifikanten Unterschiede in der LasB-Aktivität zwischen LasB-Varianten (Medianbereich: 7,76 × 108–1,48 × 1011) (Abb. 1a; statistische Tests und p-Werte sind in der Ergänzungstabelle S3 dargestellt). Im Gegensatz dazu zeigten Isolate mit WT LasR eine signifikant höhere Elastaseaktivität (Median: 1,74 × 1011) als Isolate mit einer Variantenform (Median: 1,95 × 108) (Aminosäuresubstitutionen oder kleine Deletionen) oder einer verkürzten (Median: 1,41 × 108) Form von LasR (Abb. 1b). Schließlich zeigten die Isolate von Patienten mit chronischen Infektionen eine deutlich geringere LasB-Aktivität (Median: 3,72 × 108) als die von Neuinfektionen (Median: 1,58 × 1011) (Abb. 1c).

Verteilung der LasB-Aktivität, gemessen durch die Abz-Hydrolyse, in P. aeruginosa-Isolaten in Abhängigkeit von (a) LasB-Variante, (b) LasR-Variante und (c) Leeds-Infektionsstadien. Die Hydrolyse des Abz-Substrats in der Y-Achse wird als log10(RFU) ausgedrückt. Die untere und obere Grenze der Box stellen das 25. bzw. 75. Perzentil dar. Die schwarze Linie innerhalb der Box stellt den Median dar. Die Ausreißer werden durch die Kreise dargestellt. Die rote gestrichelte Linie zeigt den positiven Schwellenwert des Tests an. Signifikante Unterschiede werden durch die Sterne über den Boxplots angezeigt. p-Wert: **< 0,01; ***< 0,001; ****< 0,0001.

Zunächst wurde eine überwachte multivariate Analyse (sPLS-DA) an den 102 Isolaten aus dem verfeinerten Datensatz durchgeführt, um (i) die Variablen zu identifizieren, die zwischen den drei Leeds-Infektionsstadien (neu, intermittierend und chronisch) unterscheiden und (ii) welche Variablen korrelieren mit dem Vorhandensein von LasB-Aktivität. Zu den für diese Analyse verwendeten Variablen gehörten klinische Daten des Patienten (Alter, pFEV1, Zeit seit der ersten Infektion, Infektion innerhalb der letzten 3 Monate vor dem Datum der Entnahme jedes Isolats, CFTR-Klasse), phänotypische Eigenschaften des Isolats (Abz-Hydrolyse, bakteriell). Wachstum, Anfälligkeit für Tobramycin und Aztreonam, Schleimhaut und Koloniemorphologie) und genotypische Daten (LasB- und LasR-Varianten) (ergänzende Datendatei). Das Modell zeigte eine gute Trennung zwischen den neuen und chronischen Isolaten, die intermittierende Gruppe war jedoch lose definiert und überlappte sowohl die chronischen als auch die neuen Gruppen (ergänzende Abbildung S5). Daher konnte dieses Modell nicht klar zwischen allen drei Gruppen unterscheiden und zeigte einen hohen Kreuzvalidierungsfehler (32,1 %).

Um ein verbessertes Modell zu erstellen, das Informationen über die LasB-Aktivität und korrelierte Variablen liefern könnte, wurden dieselben 102 Isolate aus dem verfeinerten Datensatz zunächst mithilfe einer hierarchischen Clustering-Methode klassifiziert. In dieser Analyse wurde die Variable „Leeds-Stadium der Infektion“ ausgeschlossen, alle anderen verfügbaren Variablen wurden jedoch beibehalten. Diese neue Clusterbildung ergab zwei unterschiedliche Klassen (Abb. 2). Zweiundsiebzig Isolate wurden in die erste Klasse eingeteilt, von denen 58,3 % zuvor gemäß den Leeds-Kriterien als neu, 27,8 % intermittierend und nur 13,9 % als chronisch eingestuft worden waren. Die zweite Klasse umfasste 30 Isolate, von denen 76,7 % chronisch und 23,3 % intermittierend waren. In dieser Klasse waren keine neuen Isolate vorhanden. Darüber hinaus wurde in der ersten Klasse im Vergleich zur zweiten Klasse (50 % WT LasR, Abz-Hydrolyse, Median: 1,56 ×) eine höhere Häufigkeit von WT-LasR (68 %) und ein höherer Grad an Abz-Hydrolyse (Median: 1,5 × 1011) beobachtet 108, Ergänzungstabelle S4). Wir haben die erste und zweite Klasse als „frühe Infektion“ bzw. „etablierte Infektion“ bezeichnet.

Die hierarchische Gruppierung des verfeinerten Datensatzes unterteilt in frühe Infektionsklassen (grün) und etablierte Infektionen (violett). Die Punkte auf der rechten Seite zeigen an, zu welchem Leeds-Infektionsstadium jedes Isolat gehört.

Anschließend wurde eine neue sPLS-DA unter Verwendung der Klassen Frühe und Etablierte Infektion durchgeführt. Komponente 1 zeigte die größte Trennung zwischen den beiden Gruppen (Abb. 3a) und identifizierte die Variablen, die am meisten zur Diskriminierung beitrugen. Hoher pFEV1, schnelles Bakterienwachstum, hohe Abz-Hydrolyse, Abwesenheit von in den letzten 3 Monaten isoliertem P. aeruginosa, große grüne, nicht schleimige Kolonien, Tobramycin-Empfindlichkeit und das Vorhandensein eines für LasR WT kodierenden Gens waren alles Merkmale, die korrelierten und überrepräsentiert waren in der Frühinfektionsklasse. Im Gegensatz dazu waren ältere Patienten, eine längere Zeit seit der ersten Infektion, eine P. aeruginosa-Infektion innerhalb der letzten 3 Monate, schleimige und sehr kleine glatte weiße Kolonien sowie monomikrobielle Infektionen allesamt Merkmale, die in der Klasse der etablierten Infektionen korrelierten und überrepräsentiert waren (Abb. 3b). Der mit diesem Modell erhaltene Kreuzvalidierungsfehler betrug 3,2 %, was auf eine deutlich bessere Leistung als beim ursprünglichen sPLS-DA hinweist.

sPLS-DA zur Unterscheidung zwischen der frühen und der etablierten Infektionsklasse und zur Identifizierung der diskriminierenden Variablen. (a) Einzelne Diagramme der beiden Infektionsgruppen. (b) Die Ladungen der beitragenden Variablen der Komponente 1. Die Farben zeigen die Gruppe an, für die die Variablen einen maximalen Mittelwert haben. Variablen mit positiven Ladungen (rechts auf der Y-Achse) korrelieren miteinander und negativ mit Variablen mit negativen Ladungen (links auf der Y-Achse).

Um die potenzielle Klonalität von Isolaten desselben Patienten zu bewerten, wurde Multilocus Sequencing Typing (MLST) an einer Teilmenge von Isolaten aus dem verfeinerten Datensatz durchgeführt, wobei diejenigen ausgewählt wurden, die vom selben Patienten entnommen wurden und zur selben Leeds-Gruppe gehörten ( Ergänzungstabelle S6). Die Isolate können in zwei Gruppen eingeteilt werden, die als Einzelinfektion und Koinfektion bezeichnet werden. In der Einzelinfektionsgruppe, die 48 % der analysierten Patienten umfasste, hatten alle von einem einzelnen Patienten gesammelten Isolate denselben Sequenztyp (ST), wiesen jedoch genotypische (lasB/lasR-Sequenz) oder phänotypische (LasB-Produktion) Unterschiede auf. Bei bestimmten Patienten (z. B. Patienten 2, 10, 32, 75) war dies der Fall, obwohl die Isolate aus derselben Sputumprobe stammten. Bei anderen Patienten (z. B. Patient 51) blieb derselbe ST im Laufe der Zeit über verschiedene Sputumproben hinweg erhalten, obwohl zusätzliche Mutationen auftraten. Diese Ergebnisse unterstützen das Auftreten einer Mikroevolution von P. aeruginosa zur Anpassung an die CF-Lungenumgebung. In der Koinfektionsgruppe, die 52 % der analysierten Patienten umfasste, zeigten Isolate desselben Patienten unterschiedliche STs, was entweder auf das gleichzeitige Vorhandensein mehrerer Stämme in der Lunge (z. B. Patienten 70 und 71) oder auf aufeinanderfolgende Infektionen hinweist mit verschiedenen Stämmen von P. aeruginosa (z. B. Patienten 1, 16, 30). Es ist erwähnenswert, dass Patienten mit intermittierenden oder chronischen Infektionen häufiger in der Gruppe mit Koinfektionen (91 %) auftraten als in der Gruppe mit Einzelinfektionen (70 %).

In dieser Studie wurden 255 P. aeruginosa-Isolate ausgewertet, die über einen Zeitraum von 4,5 Jahren aus einer Kohorte von 70 CF-Patienten aus der Region Toulouse in Frankreich gesammelt wurden. Die Patienten wurden von den Ärzten nach den Leeds-Kriterien25,26 klassifiziert, die häufig zur Definition des Stadiums von P. aeruginosa-Infektionen bei Patienten mit CF verwendet werden. Die aus den verschiedenen Infektionsstadien isolierten P. aeruginosa zeigten spezifische Merkmale; Beispielsweise waren P. aeruginosa aus chronischen Infektionen stärker mit Phänotypen kleiner Kolonien assoziiert und zeigten eine signifikant höhere Prävalenz von Schleimhäuten, während sie im Vergleich zu den Isolaten mit intermittierenden und neuen Infektionen eine signifikant geringere Prävalenz von Pigmentierung aufwiesen. Diese Eigenschaften wurden bereits als typisch für P. aeruginosa beschrieben, das aus chronischen Infektionen isoliert wurde5,29,30 und sind mit einer erhöhten Antibiotikaresistenz5 und einer verringerten Expression von Virulenzfaktoren (wie LasB) im Vergleich zum WT-PA01-Stamm29 verbunden. Der hier beobachtete Small-Colony-Phänotyp könnte den Small-Colony-Varianten (SCV) entsprechen, die zuvor im Zusammenhang mit chronischen Lungeninfektionen bei CF-Patienten beschrieben wurden31,32,33. Allerdings wäre eine weitere Charakterisierung erforderlich, um die SCV-Isolate von denen zu unterscheiden, die eine langsame Wachstumsrate aufweisen.

Die PCR-Amplifikation des lasB-Locus bestätigte das Vorhandensein dieses Gens in allen Isolaten, obwohl in einigen Fällen alternative Primer verwendet werden mussten, um eine gute Amplifikation zu erreichen. Einige Studien haben berichtet, dass das lasB-Gen in bestimmten klinischen Stämmen fehlt34,35,36; In einer anderen Studie, in der 162 CF-Isolate analysiert wurden, wurde jedoch auch das lasB-Gen in allen Stämmen nachgewiesen37. Darüber hinaus bestätigte eine von Hilliam et al.38 veröffentlichte Auswertung der Genomdaten aus einer Bronchiektasen-P.-aeruginosa-Sammlung, dass der lasB-Locus auch in 100 % dieser Isolate vorhanden war (Daten nicht gezeigt). Schließlich ergab die Analyse der globalen Datenbank Pseudomonas.com das Vorhandensein des lasB-Locus in 99,1 % der hinterlegten Genome, unabhängig von ihrer Herkunft. Es ist erwähnenswert, dass sich die Genome, denen das lasB-Gen fehlt, meist auf der Ebene der Contig-/Gerüstassemblierung befinden, nur zwei auf der Ebene der Chromosomen-/vollständigen Genomassemblierung, was darauf hindeutet, dass das lasB-Gen in den Lücken der unvollständigen Genome vorhanden sein könnte nur bei einer winzigen Minderheit von Stämmen fehlt es wirklich. Daher können die Unterschiede beim Nachweis von lasB zwischen verschiedenen PCR-basierten Studien auf die verwendeten Techniken oder verwendeten Primer zurückzuführen sein. Die vorgelegten Daten liefern starke Beweise dafür, dass das lasB-Gen in der überwiegenden Mehrheit der P. aeruginosa-Stämme vorhanden ist.

Die Analyse der LasB-Aminosäuresequenzen ergab neun Varianten, von denen drei 94,5 % der 255 analysierten CF-Isolate ausmachten. Dieselben drei Hauptvarianten wurden in 87,3 % der globalen Datenbank von Pseudomonas.com (n = 7890) und interessanterweise auch in 83,1 % einer Sammlung von P. aeruginosa-Isolaten von Nicht-CF-Bronchiektase-Patienten (n = 189; Daten) identifiziert nicht abgebildet)38. Die ähnliche Verteilung der LasB-Varianten zwischen den verschiedenen Datenbanken legt nahe, dass dieser Locus unter P. aeruginosa-Stämmen gut konserviert ist. Sieben der neun in dieser Sammlung identifizierten LasB-Varianten, darunter die drei Hauptvarianten, zeigten ähnliche spezifische Aktivitäten, wobei nur die LasB-9-Variante eine etwas geringere spezifische Aktivität aufwies28. Diese Daten deuten darauf hin, dass die meisten P. aeruginosa, unabhängig von ihrer Herkunft, das Potenzial haben, ein funktionelles LasB zu exprimieren.

In Übereinstimmung mit den obigen Beobachtungen wurden keine signifikanten Unterschiede in der Elastaseaktivität zwischen Isolaten mit unterschiedlichen LasB-Varianten beobachtet. Interessanterweise war ein kleiner Anteil der Isolate (11,4 %) in der Lage, LasB-Protein zu produzieren, wie durch Western Blot nachgewiesen wurde, zeigten jedoch keine Hydrolyse des Abz-Substrats, obwohl sie lasB-Sequenzen aufwiesen, die für aktive Enzyme kodierten. Cigana et al.22 haben zuvor gezeigt, dass zwei Stämme, die im Abstand von sieben Jahren aus demselben Patienten isoliert wurden, dieselbe lasB-Sequenz trugen und im Western Blot ähnliche Proteinmengen produzierten, jedoch unterschiedliche Elastaseaktivitätsniveaus aufwiesen. In dieser Studie zeigte das erste Isolat eine starke Elastase-Aktivität, wohingegen der während der chronischen Infektion isolierte Stamm keine nachweisbare Elastase-Aktivität aufwies und pathoadaptive phänotypische Merkmale aufwies. Die Autoren vermuteten, dass der Mangel an Elastase-Aktivität mit einer fehlerhaften Verarbeitung des Proteins zusammenhängen könnte. Es ist möglich, dass ein ähnlicher Mechanismus für die mangelnde Aktivität verantwortlich ist, die in dieser Studie bei bestimmten Stämmen beobachtet wurde.

Die Expression von LasB wird durch ein komplexes QS-Netzwerk gesteuert, das auf die Zelldichte der Bakterien und mehrere Umweltsignale reagiert. In P. aeruginosa wurden mehrere QS-Transkriptionsregulatoren identifiziert, der Hauptregulator, der die Expression von lasB steuert, ist jedoch der LasR-Aktivator19. Mutationen, die zur Inaktivierung von LasR führen, wurden als frühe Anpassung an die CF-Lungenumgebung beschrieben und mit dem Fortschreiten der Lungenerkrankung bei CF-Patienten in Verbindung gebracht39,40. Andererseits wurden auch einzelne Aminosäuremutationen in LasR in P. aeruginosa-Isolaten aus chronischen Infektionen beobachtet, von denen einige ihre Elastaseaktivität beibehalten41. Daher haben wir das Vorkommen von lasR-Varianten in unserer Isolatsammlung sowie die Korrelation dieser Varianten mit der Hydrolyse des Abz-Substrats bewertet. Der lasR-Locus wurde in 254 der 255 Isolate erfolgreich amplifiziert und sequenziert. In Übereinstimmung mit früheren Studien wiesen 63,8 % der Stämme ein WT-LasR auf, es wurde jedoch auch eine große Anzahl von Varianten identifiziert, darunter 14,2 %, die ein verkürztes LasR-Protein kodierten, die mit den niedrigsten Maßen an LasB-Aktivität assoziiert waren. Zupetic et al. beobachteten in ähnlicher Weise, dass mutierte lasR-Genotypen häufiger unter P. aeruginosa-Stämmen mit niedriger Elastase vorkamen, die aus Atemwegsinfektionen auf einer Intensivstation isoliert wurden42. Darüber hinaus beobachteten wir, dass die Gruppe mit chronischen Infektionen (gemäß den Leeds-Kriterien) den höchsten Anteil an Isolaten mit Mutationen im lasR-Locus und die niedrigste LasB-Aktivität aufwies, was die Bedeutung von LasR für die Expression von LasB untermauert. Leider war es aufgrund der begrenzten Verfügbarkeit mehrerer Isolate einzelner Patienten in dieser retrospektiven Studie nicht möglich, direkt zu beobachten, ob die Elastaseaktivität in aufeinanderfolgenden Isolaten im Laufe der Zeit verringert wurde (Daten nicht gezeigt). Um dieses Problem anzugehen, sind möglicherweise prospektive Studien erforderlich, die sich auf die Erhebung umfassender Längsschnittdaten konzentrieren.

Um die Korrelationen zwischen verschiedenen Variablen (sowohl bakteriell als auch patientenbezogen) und deren Zusammenhang mit der Elastaseaktivität besser zu verstehen, wurde eine überwachte multivariate Analyse an einem Datensatz durchgeführt, der verfeinert wurde, um wahrscheinlich doppelte Proben zu entfernen, die andernfalls die Analyse verzerren könnten. Dieses Modell unterschied nicht zwischen den drei Leeds-Gruppen, was höchstwahrscheinlich darauf zurückzuführen ist, dass intermittierende Infektionen schlecht definiert sind und ihre gemeinsamen Merkmale schwer zu bestimmen sind26. Dieses Ergebnis stimmt mit früheren Studien überein, die gezeigt haben, dass viele Patienten, die der Kategorie „Intermittierend“ zugeordnet werden, wahrscheinlich an chronischen Infektionen leiden43,44.

Eine MLST-Analyse der Stämme aus dem verfeinerten Datensatz, die aus demselben Patienten isoliert wurden und zur selben Leeds-Gruppe gehörten, identifizierte klonal verwandte Isolate, die relevante genotypische und/oder phänotypische Unterschiede aufwiesen, d. h. Mutationen in den lasB/lasR-Loci oder Unterschiede in der Aktivität von LasB. Diese Ergebnisse zeigen, dass sich P. aeruginosa weiterentwickelt und an die CF-Lungenumgebung anpasst und dass mehrere Mutanten, die aus demselben Sequenztyp stammen, koexistieren können. Bragonzi et al.30 haben zuvor die Mikroevolution von P. aeruginosa im CF-Kontext beschrieben. In dieser Studie zeigten sie, dass klonale Isolate genomische Umlagerungen, Mutationen und Variationen in pathogenen Inseln sowie phänotypische Variationen einschließlich Schleimhaut- und Virulenzfaktoren aufwiesen. Tatsächlich sind Langzeitinfektionen mit P. aeruginosa durch die Anhäufung von Mutationen in verschiedenen Genen gekennzeichnet, darunter Transkriptionsregulatoren, Virulenzfaktoren, Antibiotika-Empfindlichkeit und Quorum Sensing (lasR)4. Umgekehrt wies eine Gruppe von Patienten mehrere STs unter ihren Isolaten auf, Einige von ihnen stammen aus einer einzigen Sputumprobe, andere wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten isoliert. Koinfektionen und aufeinanderfolgende oder intermittierende Infektionen durch verschiedene Stämme von P. aeruginosa wurden ebenfalls in der Literatur beschrieben45,46 und scheinen ein häufiges Phänomen im CF-Kontext zu sein.

Für die Zwecke dieser Studie wollten wir ein Modell definieren, das die Eigenschaften der P. aeruginosa-Isolate und den klinischen Status des Patienten genauer widerspiegelt. Eine hierarchische Klassifizierung führte zur Identifizierung von zwei unterschiedlichen Klassen von Isolaten, die wir aufgrund ihrer Eigenschaften als frühe und etablierte Infektion bezeichneten und die dann in einer zweiten überwachten multivariaten Analyse verwendet wurden. In diesem Fall war die Unterscheidung zwischen den beiden Gruppen klar und die wichtigsten Unterscheidungsvariablen wurden identifiziert.

Unsere Analyse ergab, dass Merkmale wie eine geringere LasB-Aktivität, ein schleimiger Phänotyp, sehr kleine erhabene und glatte Kolonien und das Fehlen einer Koloniepigmentierung in der etablierten Klasse überrepräsentiert waren. Diese Merkmale korrelierten mit älteren Patienten mit niedrigerem pFEV1, die über einen längeren Zeitraum P. aeruginosa-Infektionen trugen, die in den letzten 3 Monaten P. aeruginosa-Infektionen hatten und monomikrobielle Infektionen hatten. Diese Beobachtungen stehen im Einklang mit Berichten, dass Patienten, die Lungenadaptierte, kleine Kolonievarianten von P. aeruginosa tragen, eine schlechtere Lungenfunktion und einen deutlich niedrigeren pFEV133 aufweisen.

Im Gegensatz dazu zeigten Isolate aus der Frühinfektion eine höhere LasB-Aktivität, die mit anderen phänotypischen Merkmalen wie Tobramycin- und Aztreonam-Anfälligkeit, schnellem Bakterienwachstum, Vorhandensein von Pigmentierung, mittelgroßen oder großen flachen, nicht schleimigen Kolonien sowie einem WT-LasR korrelierte. Diese Merkmale wurden mit jüngeren Patienten mit polymikrobiellen Infektionen und hohem pFEV1 in Verbindung gebracht. Im Kontext der CF-Umgebung passen sich „naive“ P. aeruginosa-Stämme durch aufeinanderfolgende genetische Veränderungen an, einschließlich der Überexpression von algU, Mutationen in rpoN, gyrA und anderen Komponenten der DNA-Polymerase, die letztendlich zu einer Verringerung der Wachstumsrate führen , was sich auf die Antibiotikatoleranz und -persistenz auswirkt47. In unserem Modell war schnelles Bakterienwachstum, das höhere Wachstumsraten widerspiegelt, in der Klasse der frühen Infektionen überrepräsentiert. Darüber hinaus korrelierte dieses Merkmal mit einer größeren Anfälligkeit für Tobramycin und Aztreonam, was mit dem naiven Phänotyp übereinstimmt.

Es wurde bereits zuvor gezeigt, dass LasB eine wichtige Rolle bei der Infektion mit P. aeruginosa spielt und eine Entzündung des Wirts auslöst48,49,50. Unsere Daten legen wiederum nahe, dass LasB in der Anfangsphase der Infektion am wichtigsten ist, da es sich um die frühe Infektionsklasse handelt, die durch eine höhere LasB-Aktivität und das Vorhandensein eines WT-LasR gekennzeichnet ist. Mutationen im lasR-Locus, die zu einem Funktionsverlust führen, wurden mit einer stärkeren ICAM-1-Reaktion und einer erhöhten neutrophilen Lungenentzündung, einer erhöhten Toleranz gegenüber Antibiotika sowie einer verringerten elastolytischen und caseinolytischen Aktivität und einer verringerten Produktion von Pyocyanin in Verbindung gebracht51,52. In unserer Studie scheint der Verlust der Elastaseaktivität während einer langfristigen (chronischen) Infektion eher mit dem Verlust der LasR-Funktion als mit einer Mutation im lasB-Locus selbst zusammenzuhängen, obwohl LasR nicht allein für diesen Phänotyp verantwortlich zu sein scheint. Tatsächlich wiesen 25,3 % der Isolate, die keine LasB-Aktivität zeigten (dh negativ für die Hydrolyse von Abz), einen WT-lasR-Genotyp auf, daher sind andere Änderungen in der Regulation oder Verarbeitung von LasB erforderlich, um diesen Phänotyp zu erklären. In Übereinstimmung damit war das Vorhandensein eines WT-LasR zwar eindeutig mit der Klasse der frühen Infektionen verbunden, Mutationen im lasR wurden jedoch vom sPLS-DA nicht als kritische Variable zur Charakterisierung der etablierten Infektion identifiziert.

Unsere Studie kombinierte klinische und experimentelle Daten im Zusammenhang mit 255 P. aeruginosa-Isolaten aus einem einzigen CF-Regionalzentrum. Die Ergebnisse liefern ein „Gesamtbild“ der Stammvielfalt und der evolutionären Entwicklung und bestätigen viele frühere Beobachtungen, die mit begrenzteren Datensätzen gemacht wurden, offenbaren aber auch die enorme Komplexität der phänotypischen und genomischen Vielfalt von P. aeruginosa innerhalb dieser Population und bei einzelnen Patienten. Eine multivariate Analyse wurde durchgeführt, um Variablen zu identifizieren, die zwischen P. aeruginosa-Isolaten mit früher und etablierter Infektion unterscheiden, und insbesondere jene phänotypischen und genotypischen Merkmale, die mit der Expression von aktivem LasB korrelieren. Zusammenfassend deuten unsere Daten darauf hin, dass P. aeruginosa-Isolate von CF-Patienten in den frühen Stadien der Infektion ein höheres Maß an LasB-Elastase-Aktivität aufweisen und dass die Elastase-Aktivität bei Auftreten einer chronischen Infektion bei vielen Stämmen erheblich verringert ist, was mit dem Auftreten von CF-Patienten zusammenfällt Mutationen im lasR, verringerte Wachstumsrate und das Auftreten von Antibiotikaresistenzen. Diese Ergebnisse legen nahe, dass bei CF-Patienten Antivirulenztherapien, die auf die LasB-Elastase abzielen, möglicherweise am wirksamsten für die Behandlung von Infektionen im Frühstadium sind, bevor sich eine Chronifizierung einstellt.

Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit der Deklaration des Weltärztebundes von Helsinki konzipiert und in Übereinstimmung mit der französischen Gesetzgebung für nicht-interventionelle retrospektive Studien (MR-004) durchgeführt. Nach dem französischen Ethik- und Regulierungsrecht mussten Studien, die auf der Nutzung von Daten und Proben aus der üblichen Pflege basierten, nicht einer bestimmten Ethikkommission vorgelegt werden, sondern mussten deklariert oder durch die Referenzmethodik der französischen Nationalen Kommission für Informatik und Freiheiten abgedeckt werden (CNIL). Die Patienten wurden darüber informiert, dass ihre kodifizierten Daten für die Studie verwendet werden, ihre Einverständniserklärung (kein Widerspruch) wurde eingeholt und in jeder Krankenakte wurde eine Aufzeichnung geführt. Antabio SAS unterzeichnete eine Verpflichtung zur Einhaltung der Referenzmethodik MR-004 der CNIL (CNIL-Nummer: 2229447 v 0). Die Studie wurde daher von Antabio SAS nach Bewertung durch den Datenschutzbeauftragten und Bestätigung, dass die ethischen Anforderungen eingehalten wurden, genehmigt. Diese Studie wurde unter der Nummer PEi-042 registriert.

255 P. aeruginosa wurden aus Sputumproben von 70 CF-Patienten aus mehreren CF-Zentren in der Region Toulouse in Frankreich isoliert. Die Proben wurden bei Routinebesuchen (alle 3 Monate) und bei Episoden einer Lungenexazerbation entnommen. Sputumproben wurden von CF-Patienten gemäß den französischen Richtlinien für Mukoviszidose53 entnommen.

Sputumproben wurden mit einem gleichen Volumen Dithiothreitol 30 Minuten lang bei 37 °C homogenisiert. Zur P. aeruginosa-Isolierung wurden 10-µl-Homogenatproben auf Cetrimid-Agarplatten (bioMérieux, Marcy l'Etoile, Frankreich) ausplattiert und 48–120 Stunden lang bei 35 (± 2) ° C inkubiert. Eine einzelne Kolonie, die jeden Morphotyp repräsentiert, wurde isoliert und mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie (MALDI BioTyper, Bruker) analysiert, um die Identität von P. aeruginosa zu bestätigen. Die antimikrobielle Empfindlichkeitsprüfung (AST) wurde unter Verwendung der Standard-Scheibendiffusionsmethode gemäß den Richtlinien des CA-SFM/European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST)54 durchgeführt. Als Kontrolle wurde der Stamm P. aeruginosa ATCC 27853 verwendet. AST wurde mit den folgenden Antibiotika durchgeführt: Aztreonam (ATM), Tobramycin (TOB), Ticarcillin (TIC), Ticarcillin-Clavulansäure (TIM), Piperacillin (PIP), Piperacillin-Tazobactam (TZP), Ceftazidim (CAZ), Cefepim ( FEP), Imipenem (IMP), Meropenem (MEM), Gentamycin (GEN), Amikacin (AMK), Levofloxacin (LVX), Ciprofloxacin (CIP), Fosfomycin (FOF) und Colistin (CST). Für die statistische Analyse wurden nur die AST-Ergebnisse für ATM und TOB berücksichtigt, da diese Antibiotika die Standardbehandlung für P. aeruginosa-Infektionen bei CF darstellen. Die visuelle Bestimmung des mukoiden Phänotyps wurde auch unmittelbar nach der Isolierung an einer Untergruppe von 137 Isolaten ausgewertet, um eine getreue Wiedergabe des Phänotyps dieser Stämme in der Lunge zu erhalten, und wurde danach nicht erneut ausgewertet, um das Auftreten von Revertanten zu vermeiden. Die Stämme wurden bei –20 °C in Brain Heart Infusion (BHI)-Brühe mit 10 % Glycerin gelagert.

Aus jedem Isolat wurde genomische DNA zur PCR-Amplifikation der lasB- und lasR-Loci extrahiert. Zunächst wurden etwa 4 × 108 Bakterienzellen aus einer exponentiell wachsenden Kultur durch Zentrifugation geerntet und das Pellet in TE-Puffer (Tris-HCl pH 8 · 100 mM, EDTA pH 8 · 10 mM) resuspendiert. Die Zellen wurden 20 Minuten lang bei –80 °C eingefroren und dann in ein Röhrchen mit Schraubverschluss und Glasperlen überführt. Die Proben wurden im FastPrep-24 5G (MP Biomedicals) homogenisiert (5 Zyklen à 30 s bei Geschwindigkeit 5,5), zentrifugiert und der Überstand mit der genomischen DNA wurde gewonnen. Zur Konzentration der DNA wurde eine Ethanolfällung durchgeführt.

Die PCR-Amplifikation von lasB wurde zunächst mit den Primern AmpF1/AmpR1 (Ergänzungstabelle S5) durchgeführt und ein zweites Paar (LasB_EF/LasB_ER) verwendet, wenn der erste Satz fehlschlug. Die lasR-Amplifikation wurde mit den lasR_EF/lasR_ER-Primern durchgeführt (Ergänzungstabelle S5). PCR-Produkte wurden mit dem PureLink™ Pro 96 PCR Purification Kit (Invitrogen) gereinigt und von Macrogen Europe unter Verwendung spezifischer Primer sequenziert.

Insgesamt 98 P. aeruginosa-Isolate aus dem verfeinerten Datensatz wurden nach Wachstum über Nacht auf LB-Agar bei 37 °C auf Koloniemorphologie (Form, Größe, Rand, Höhe) und Pigmentierung untersucht. Die Pigmentierung der Kolonien wurde als weiß (keine Pigmentierung), grün oder rot klassifiziert.

Flaschen mit LB-Brühe wurden bei einer OD600 = 0,015 mit einer P. aeruginosa-Übernachtkultur beimpft und 24 Stunden lang bei 37 °C und 180 U/min inkubiert. Die Kulturen wurden 10 Minuten lang bei 5000 U/min zentrifugiert, die Überstände filtriert (0,22 µm Pore) und bei –80 °C gelagert. Für jedes Experiment wurden der PAO1-Stamm und ein ΔlasB-Derivat als Positiv- bzw. Negativkontrolle verwendet.

Die Hydrolyse des fluorogenen Peptidsubstrats 2-Aminobenzoyl-Ala-Gly-Leu-Ala-4-nitrobenzylamid (Abz; Enzo Life Sciences) wurde zur Beurteilung der LasB-Aktivität auf Kulturüberständen verwendet. Der Assay wurde in 50 mM Tris-HCl (pH 7,4), ergänzt mit 2,5 mM CaCl2, durchgeführt und mit einem Envision-Mikroplattenlesegerät (Perkin Elmer) bei 315 nm Anregungs- und 430 nm Emissionswellenlänge verfolgt. Die Ergebnisse wurden in RFU/ml Überstand ausgedrückt. Überstände, die weniger als einen Basisschwellenwert von 1,88 × 108 RFU/ml aufwiesen (berechnet als Mittelwert der Negativkontrollen plus dem Dreifachen der Standardabweichung), wurden als negativ angesehen. Alle Isolate wurden einmal getestet und wenn die Ergebnisse unter dem Schwellenwert für Positivität lagen, wurden zwei weitere Wiederholungen durchgeführt, um das negative Ergebnis zu bestätigen.

Das Vorhandensein von LasB-Protein in den Überständen wurde durch Western-Blot-Analyse bewertet. 25 Mikroliter Kulturüberstände wurden mit einem gleichen Volumen eines Laemmli-Blau-2x-Puffers gemischt und durch 5-minütiges Erhitzen auf 95 °C denaturiert. Zehn Mikroliter Proteinprobe wurden auf 12 % Mini-Protean TGX Precast Protein Gels (Bio-Rad) laufen gelassen. Nach der Elektrophorese wurden die Proteine auf eine 0,2 µm PVDF-Membran übertragen. Nach 1 Stunde in TBST (Tris-gepufferte Kochsalzlösung-Tween 20) 5 % Magermilch zur Sättigung der unspezifischen Stellen wurden die Membranen dann 1 Stunde bei RT in TBST mit 0,5 % Magermilch in Gegenwart des LasB-Primärantikörpers (bereitgestellt) geblottet von Efrat Kesslers Labor, Universität Tel Aviv, Israel). Der Primärantikörper wurde mithilfe eines mit alkalischer Phosphatase konjugierten Sekundärantikörpers nachgewiesen und mit dem NBT/BCIP-Substrat (Sigma) nachgewiesen.

MLST wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt55. Kurz gesagt, die sieben Gene ascA, aroE, guaA, mutL, nuoD, ppsA und trpE wurden durch PCR unter Verwendung der von Curran et al.55 entwickelten Primer amplifiziert. Die Amplifikationen wurden unter Verwendung des GoTaq G2 Hot Start Green Master Mix (Promega), der Vorwärts- und Rückwärtsprimer in einer Endkonzentration von 0,4 μM, DMSO 6 % und 100 ng gDNA (4 ng/μL) in einem Endvolumen von 25 durchgeführt µL. Das Amplifikationsprogramm wurde wie folgt festgelegt: anfängliche Denaturierung bei 95 °C für 5 Minuten, gefolgt von 30 Denaturierungszyklen bei 95 °C für 45 Sekunden, Hybridisierung bei 55 °C für 1 Minute und Verlängerung bei 72 °C für 1 Minute, gefolgt von durch eine abschließende Verlängerung bei 72 °C für 7 Minuten. Nach der Amplifikation wurden 5 μl PCR-Produkte auf einem 1,3 %igen Agarosegel laufen gelassen, um die Größe der Amplifikate zu überprüfen. Die Proben wurden dann bei –20 °C gelagert, bevor sie zur Reinigung und Sequenzierung an Microsynth geschickt wurden. Rekonstruierte Gensequenzen wurden analysiert, um ihr Allelprofil zu bestimmen. Schließlich wurde für jeden Stamm der Satz erhaltener Allelprofile zur Identifizierung des ST-Profils56 verwendet.

Alle von den CF-Zentren in Toulouse bereitgestellten klinischen Daten und die experimentellen Daten wurden in einem einzigen Datensatz zusammengefasst. Beschreibende Maße für numerische Variablen (Mittelwerte, Mediane, SD und Bereiche) wurden mit Vortex (Dotmatics) berechnet.

Die folgenden Analysen wurden alle in der Software R57 durchgeführt. Vergleiche der erwarteten Verteilung eines phänotypischen Merkmals und der tatsächlichen Verteilung innerhalb der Isolatgruppen mit neuen, intermittierenden und chronischen Infektionen wurden mithilfe des Chi-Quadrat-Tests nach Pearson durchgeführt. Der Test wurde mit der Funktion „chisq.test“ aus dem Paket „stats“57 ausgeführt.

Durch die Eliminierung wahrscheinlich doppelter Isolate wurde ein verfeinerter Datensatz erstellt, um Verzerrungen während der statistischen Analyse zu minimieren. Die Eliminierungskriterien sind im Arbeitsablauf in der ergänzenden Abbildung S4 detailliert beschrieben. Isolate, die bei Patienten über 30 Jahren als „Neuinfektion“ eingestuft wurden, sowie Isolate, für die die klinischen Daten unvollständig waren, wurden ebenfalls ausgeschlossen. Alle nachfolgenden statistischen Analysen wurden mit dem verfeinerten Datensatz durchgeführt.

Boxplots wurden mit der Funktion „ggboxplot“ aus dem Paket „ggpubr“58 generiert. Um festzustellen, ob es signifikante Unterschiede zwischen den Medianen der verschiedenen Gruppen gab, wurde ein Kruskal-Wallis-Test mit der Funktion „kruskal.test“ durchgeführt. Der paarweise Vergleich der Mediane wurde mit dem Dunn-Test unter Verwendung der Funktion „dunnTest“ aus dem Paket „FSA“59 durchgeführt.

Der verfeinerte Datensatz wurde zur weiteren Analyse normalisiert. Die numerischen Variablen wurden zentriert und skaliert, und die kategorialen Variablen wurden mithilfe des Pakets „fastDummies“60 in Dummy-Variablen umgewandelt. Die Klassifizierung der Isolate erfolgte mittels einer Clustering-Analyse mit der Funktion „hclust“. Die partielle Diskriminanzanalyse der kleinsten Quadrate mit geringer Dichte (sPLS-DA) wurde mit der Funktion „splsda“ des Pakets „mixOmixs“61 durchgeführt. Die optimale Anzahl von Komponenten im Modell wurde mit der Funktion „perf“ mithilfe einer dreifachen Kreuzvalidierung, die 1000 Mal wiederholt wurde, definiert. Die Anzahl der ausgewählten Variablen im Modell wurde mit der Funktion „tune.splsda“ definiert.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel (und seinen ergänzenden Informationsdateien) enthalten.

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Die in dieser Veröffentlichung berichteten Forschungsergebnisse werden von CARB-X unterstützt. Die Finanzierung dieses Projekts durch CARB-X erfolgt teilweise aus Bundesmitteln des US-Gesundheitsministeriums; Verwaltung für strategische Vorbereitung und Reaktion; Behörde für fortgeschrittene biomedizinische Forschung und Entwicklung; unter der Vertragsnummer: 75A50122C00028 und durch eine Auszeichnung von Wellcome (WT224842). Für den Inhalt dieser Veröffentlichung sind ausschließlich die Autoren verantwortlich und geben nicht unbedingt die offiziellen Ansichten von CARB-X oder einem seiner Geldgeber wieder. Die Autoren möchten außerdem Joanne Fothergill und Craig Winstanley von der University of Liverpool für die Bereitstellung von Sequenzdaten aus ihren veröffentlichten NCFB-Studien sowie der Firma Smaltis (Besançon, Frankreich) für die Bereitstellung der MLST-Daten danken.

Antabio SAS, Biostep, 436, rue Pierre et Marie Curie, 31760, Labège, Frankreich

Agustina Llanos, Pauline Achard, Justine Bousquet, Clarisse Lozano, Magdalena Zalacain, Carole Sable, Marc Lemonnier und Martin Everett

Abteilung für Bakteriologie-Hygiene, Universitätsklinikum Toulouse, Frankreich

Hélène Revillet

IRSD, INSERM, Universität Toulouse, INRAE, ENVT, UPS, Toulouse, Frankreich

Hélène Revillet

Zentrum für Mukoviszidose bei Erwachsenen, Abteilung für Pneumologie, Larrey Hospital, Universitätskrankenhaus Toulouse, Toulouse, Frankreich

Marlene Murris

Krankenhäuser von Toulouse, Toulouse, Frankreich

Marie Mittaine

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ME hat die Studie konzipiert und gestaltet. MMu, MMi und HR stellten Isolate, klinische Daten und wissenschaftlichen Input zur Verfügung. PA, JB, CL, HR führten die phänotypische und genotypische Charakterisierung der Isolate durch. AL führte die statistischen Analysen durch. MMu, MMi, HR, PA, JB, CL, AL, CS, MZ, ML, ME trugen zur Dateninterpretation und -analyse bei. AL, PA, MZ, ML, ME haben das Manuskript verfasst. Alle Autoren haben das Manuskript überarbeitet und genehmigt.

Korrespondenz mit Agustina Llanos.

AL, PA, JB, CL, MZ, CS, ML und ME waren zum Zeitpunkt der Studie Mitarbeiter von Antabio. HR gibt an, dass kein potenzieller Interessenkonflikt besteht. MMu hat als Berater eine Vergütung von Vertex erhalten. Sie erhielt eine Vergütung als Mitglied des französischen Nationalvorstands von Zambon und des Vorstands von Viatris. MMi hat als Berater eine Vergütung von Vertex erhalten.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Llanos, A., Achard, P., Bousquet, J. et al. Höhere Werte der Pseudomonas aeruginosa LasB-Elastase-Expression sind mit einer Infektion im Frühstadium bei Mukoviszidose-Patienten verbunden. Sci Rep 13, 14208 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-41333-9

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Eingegangen: 28. Februar 2023

Angenommen: 24. August 2023

Veröffentlicht: 30. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-41333-9

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