Entdeckung und Multimerisierung von Kreuz

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 13668 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Coronaviren waren in den letzten zwei Jahrzehnten der Erreger von drei Epidemien und Pandemien, darunter auch die anhaltende COVID-19-Pandemie. Ein weitgehend neutralisierendes Coronavirus-Therapeutikum ist nicht nur zur Vorbeugung und Behandlung von COVID-19 wünschenswert, sondern auch zum Schutz von Hochrisikopopulationen vor künftig auftretenden Coronaviren. Da alle Coronaviren Spike-Proteine ​​auf der Virusoberfläche nutzen, um in die Wirtszellen einzudringen, und diese Spike-Proteine ​​eine gemeinsame Sequenz und strukturelle Homologie aufweisen, haben wir uns vorgenommen, kreuzreaktive biologische Wirkstoffe zu entdecken, die auf das Spike-Protein abzielen, um den Viruseintritt zu blockieren. Durch Lama-Immunisierungskampagnen haben wir Einzeldomänen-Antikörper (VHHs) identifiziert, die gegen mehrere neu auftretende Coronaviren (SARS-CoV, SARS-CoV-2 und MERS) kreuzreaktiv sind. Wichtig ist, dass eine Reihe dieser Antikörper eine subnanomolare Wirksamkeit gegen alle SARS-ähnlichen Viren, einschließlich neu auftretender CoV-2-Varianten, aufweisen. Wir haben neun verschiedene Epitope auf dem Spike-Protein identifiziert, auf das diese VHHs abzielen. Darüber hinaus haben wir durch die Entwicklung von VHHs, die auf bestimmte, konservierte Epitope abzielen, in multivalente Formate ihre Neutralisierungswirkung im Vergleich zu den entsprechenden VHH-Cocktails deutlich verbessert. Wir glauben, dass dieser Ansatz ideal geeignet ist, um sowohl auf neu auftretende SARS-CoV-2-Varianten während der aktuellen Pandemie als auch auf potenzielle zukünftige Pandemien, die durch SARS-ähnliche Coronaviren verursacht werden, zu reagieren.

Coronaviren (CoVs) sind eine große Familie von Viren, die zahlreiche Arten, darunter auch Menschen, infizieren und aus vier Hauptgattungen bestehen, die als Alpha, Beta, Gamma und Delta bekannt sind. Die bedeutendste CoV-Spezies, das schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), ein Beta-Coronavirus, das 2019 in China aufgetreten ist, treibt derzeit eine Pandemie voran, die zu über 500 Millionen Fällen und 15 Millionen zusätzlichen Todesfällen geführt hat die letzten 3 Jahre1. Zu den weiteren CoV-Stämmen gehören SARS-CoV und MERS, die beide zu kleineren, aber erheblichen Ausbrüchen mit hoher Morbidität und Mortalität geführt haben.

Coronaviren sind einzelsträngige RNA-Viren (ssRNA) mit einer großen Genomgröße und einer relativ hohen Mutationsrate. Es wurde gezeigt, dass Rekombinationsereignisse zwischen verschiedenen CoV-Arten auftreten, was zu weiterer genetischer Variabilität führt2. Einer der Schlüsselfaktoren für die anhaltend hohe Belastung durch die COVID-19-Erkrankung ist die beobachtete hohe Mutationsrate des SARS-CoV-2-Virus, die zur Entstehung und raschen Verbreitung neuer Virusvarianten führt, die in der Lage sind, natürlichen und impfstoffinduzierten Viren zu entgehen Immunantworten des Wirts. Basierend auf der systematischen Genomsequenzierung klinischer Isolate von SARS-COV-2 wurden 12 Abstammungsgruppen identifiziert und 5 davon, Alpha (B.1.1.7), Beta (B.1.351), Gamma (P.1.1). ), Delta (B.1.617.2) und das neu identifizierte Omicron (B.1.1.529) wurden von der Weltgesundheitsorganisation als besorgniserregende Varianten (VOCs) definiert. Die Omicron-Variante, die mehr als 30 Mutationen im viralen Spike-Protein aufweist, ist derzeit die weltweit am häufigsten zirkulierende Variante. In mehreren Studien wurde über eine Resistenz der Omicron-Variante gegen die Neutralisierung durch Antikörper und Serum gegen den Wildtyp-Stamm (Wuhan) berichtet, was die Schutzwirkung der ursprünglich zugelassenen Impfstoffe und therapeutischen Antikörper auf Wuhan-Stammbasis erheblich beeinträchtigt3,4,5,6. Bivalente mRNA-Impfstoffe, darunter der ursprüngliche Wuhan-Stamm und der derzeit zirkulierende Omicron BA.4/5-Stamm, wurden kürzlich als Auffrischungsimpfungen verfügbar gemacht, es ist jedoch möglich, dass neue VOCs entstehen und der durch diese Auffrischungsimpfungen induzierten Immunität wieder entkommen. Darüber hinaus rechtfertigt die Gefahr anhaltender zoonotischer Spillover-Effekte die Entwicklung breitwirksamer antiviraler Wirkstoffe, die künftig Coronaviren mit Pandemiepotenzial bekämpfen könnten7.

Während es sich bei der überwiegenden Mehrheit der Antikörper, die auf das Spike-Protein von SARS-CoV-2 abzielen, um herkömmliche Immunglobuline handelte, handelte es sich bei mehreren wirksamen variablen Domänen der schweren Kette (VHHs) von von Kameliden abgeleiteten Einzeldomänen-Antikörpern (sdAbs), die auf das Spike-Protein von SARS-CoV-2 abzielten, auch um solche berichtet8,9,10. In der Literatur wurden mehrere kreuzreaktive Epitope auf dem Spike identifiziert, darunter Epitope der Klassen 3 und 4 auf der Rezeptorbindungsdomäne (RBD), dargestellt durch S309 bzw. CR302211,12,13. Da VHHs im Vergleich zu herkömmlichen Antikörpern kleiner sind (~ 15 kDa vs. ~ 150 kDa), haben sie das Potenzial, an kleinere, konservierte Epitope zu binden, die von verschiedenen Coronaviren gemeinsam genutzt werden und auf die herkömmliche Antikörper möglicherweise keinen Zugriff haben. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass VHHs günstige biophysikalische Eigenschaften besitzen und ihre geringere Größe auch die Erzeugung multivalenter Konstrukte erleichtert. In dieser Arbeit berichten wir über die Entdeckung mehrerer VHHs, die unterschiedliche kreuzreaktive Epitope auf dem Spike-Protein binden. Wir zeigen weiterhin, dass die Neutralisierungswirkung multimerer VHHs im Vergleich zu den monovalenten Formen deutlich erhöht ist. Die erhöhte Wirksamkeit und das Potenzial zum Schutz vor Escape-Mutationen machen diesen Ansatz wertvoll für die Bekämpfung neu auftretender SARS-CoV-2-Varianten sowie SARS-ähnlicher Viren, die möglicherweise in der Zukunft auftreten.

Wir verwendeten einen heterologen Immunisierungsansatz, um VHHs mit breiter Kreuzreaktivität zu identifizieren (Abb. 1A). Wir stellten die Hypothese auf, dass kreuzreaktive B-Zellen nach drei Immunisierungsrunden mit verwandten, aber nicht identischen Spike-Proteinen angereichert würden. Zu diesem Zweck wurden Lamas zunächst mit dem Spike-Protein von SARS-CoV-2 immunisiert, gefolgt von Spike-Proteinen von MERS- und SARS-CoV-Viren im Abstand von drei Wochen zwischen den Immunisierungen. Periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) wurden 10 Tage nach der letzten Immunisierung geerntet. B-Zellen, die an das SARS-CoV-2-Spike-Protein binden, wurden isoliert und kultiviert, und Überstände wurden verwendet, um auf Bindung an Spike-Proteine ​​der drei Viren zu prüfen. Dreiundzwanzig Klone, die sowohl an SARS-CoV- als auch an SARS-CoV-2-Spikes banden, wurden sequenziert, rekombinant entweder in Monomer- oder bivalenten Formaten exprimiert und durch ELISA auf Bindung an lösliche rekombinante Spike-Proteine ​​validiert (Abb. 1B, Tabelle S1). Die Bindung der bivalenten Konstrukte wurde auch durch Durchflusszytometrie unter Verwendung von Zellen bewertet, die rekombinant Spike-Protein auf ihrer Oberfläche exprimierten (Tabelle S2). Alle 23 Konstrukte banden mit ähnlicher Affinität an SARS-CoV und SARS-CoV-2, wobei im bivalenten Format eine signifikante Affinitätsverbesserung beobachtet wurde, die wahrscheinlich auf eine erhöhte Avidität zurückzuführen ist. Viele bivalente VHHs zeigten eine Affinität zum SARS-CoV-2-Spike, und die Affinität blieb für die SARS-CoV-2-Varianten Alpha, Beta, Gamma und Delta größtenteils unverändert. Acht der Kandidaten verloren jedoch die Bindung an die Omicron-Varianten BA.1 und BA.2 (Tabelle S1). Darüber hinaus band ein VHH (6A1) auch an Spike-Proteine ​​von MERS und den endemischen menschlichen Beta-Coronaviren OC43 und HKU1 (Tabelle S1). Die direkte Affinitätsmessung gegen das CoV-2-Spike-Protein mithilfe von Biacore (Abb. 1C, Tabelle S3) validierte die ELISA-Ergebnisse. Die Affinitäten der Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) wurden für monovalente VHHs gemessen. Monovalente Affinitäten konnten für VHH-Fc-Konstrukte aufgrund der Avidität nicht gemessen werden, sodass die Daten nicht zum 1:1-Modell passen. Die Sensogramme weisen jedoch darauf hin, dass multivalente Konstrukte eine verstärkte Bindung aufwiesen. Die Kandidaten wurden mithilfe von ELISA weiter auf ihre Bindung an verschiedene Domänen des Spike-Proteins (RBD, NTD, S2) untersucht (zusammengefasst in Abb. 1D). Mit diesem Ansatz konnten wir doppelt kreuzreaktive SARS-CoV- und SARS-CoV-2-Klone identifizieren, die auf alle drei Domänen des Spike-Proteins abzielen. Im Gegensatz dazu waren dreifach kreuzreaktive Klone, die an alle drei Spike-Proteine ​​(SARS-CoV, SARS-CoV-2, MERS) banden, auf die S2-Domäne beschränkt.

Identifizierung kreuzreaktiver VHHs nach Lama-Immunisierung. (A) Lama-Immunisierungsschema unter Verwendung gereinigter Spike-Proteine ​​verschiedener Viren. (B) ELISA-Bindungsergebnisse von VHHs, die eine Kreuzbindung an SARS-CoV- und SARS-CoV-2-Spike-Proteine ​​zeigen (linkes Feld, monovalent; rechtes Feld, zweiwertig). (C) SPR-Sensogramme ausgewählter VHH-Binder an SARS-CoV-2-Spike-Protein. Farbige Kurven sind Rohdaten bei unterschiedlichen VHH-Konzentrationen; Schwarze Kurven entsprechen einem 1:1-Modell. (D) Tabelle der kreuzreaktiven VHHs, die auf verschiedene Domänen (RBD, NTD, S2) innerhalb des Spike-Proteins abzielen. Die Struktur des SARS-CoV-2 Spike (S)-Proteins wird angezeigt (PDBID: 6XKL) und nach Domänen gefärbt; N-terminale Domäne (NTD) in Cyan, Rezeptorbindungsdomäne (RBD) in Rosa, die S2-Domäne in Grün und die Strecke zwischen dem Ende der RBD und dem Anfang der S2-Domäne in Grau.

Wir haben zunächst die Neutralisierungsstärke der VHH-Kandidaten im bivalenten Format mithilfe von Pseudovirus-Neutralisierungstests auf Basis des Vesikulären Stomatitis-Virus (VSV) bewertet und eine Kreuzneutralisierung von SARS-CoV und SARS-CoV-2 mit mehreren Kandidaten beobachtet (Abb. 2A, Tabelle S4). . Insbesondere 8 der Kandidaten, darunter 10B8 und 1E4, zeigten eine starke Neutralisierung sowohl für SARS-CoV als auch für SARS-CoV-2. Bei allen RBD-bindenden und einigen NTD-bindenden Antikörpern wurde eine Neutralisierung beobachtet. Keiner der S2-bindenden Antikörper zeigte eine Neutralisierung in SARS-CoV-, SARS-CoV-2- oder MERS-Pseudovirus-Assays (Tabelle S4). Wichtig ist, dass für die SARS-CoV-2-Varianten Alpha, Beta und Delta weiterhin eine starke Neutralisierungsfähigkeit vorhanden ist. Während die Wirksamkeit gegenüber der Omicron-Variante bei einigen Kandidaten verringert war, blieb sie bei mehreren Kandidaten hoch – insbesondere bei 10B8 (Tabelle S4).

Pseudovirus und authentische Virusneutralisierung. (A) SARS-CoV- und SARS-CoV-2-VSV-Pseudovirus-Neutralisierung (geschätzte IC50-Werte) durch 16 Kandidaten-VHH-Fcs (bivalent). (B) Authentische SARS-CoV-Virusneutralisierung durch ausgewählte Kandidaten (monomere und bivalente Formate). (C) Authentische Neutralisierung des SARS-CoV-2-Virus durch ausgewählte Kandidaten (monomere und bivalente Formate).

Als nächstes wurde die Neutralisierungskraft ausgewählter Kandidaten in Tests auf authentische SARS-CoV- und SARS-CoV-2-Viren bewertet. Die Gesamtneutralisierungsstärke blieb ähnlich wie in Pseudovirus-Assays beobachtet, wobei zwei der wirksamen Kandidaten 10B8 und 1E4 IC50-Werte im Sub-nM-Bereich sowohl für SARS-CoV als auch für SARS-CoV-2 zeigten (Abb. 2B und C). Das bivalente Format von 10B8 zeigte IC50-Werte von 40 pM und 300 pM für SARS-CoV bzw. SARS-CoV-2. Selbst im monovalenten Format blieben die IC50-Werte von 10B8 wirksam (150 pM für SARS-CoV und 2,9 nM für SARS-CoV-2). Während das bivalente Format von 1E4 wirksam blieb (IC50-Werte von 50 pM bzw. 200 pM für SARS-CoV bzw. SARS-CoV-2), war das monovalente Format dieses Konstrukts weniger wirksam und IC50-Werte konnten mit den verwendeten Konzentrationen nicht berechnet werden im Experiment. In Übereinstimmung mit der Literatur14 zeigte REGN10987 Ab, der als Vergleichsprodukt verwendet wurde, eine starke Neutralisierung für SARS-CoV-2, nicht jedoch für SARS-CoV.

Wir verwendeten einen Octet-basierten Binning-Assay, um die Epitope der Kandidaten-VHHs zu bewerten. Kurz gesagt, das erste VHH wurde mit dem CoV-2-Spike-Protein inkubiert, das an der Biosensorspitze eingefangen wurde, gefolgt von der Bindung eines zweiten Antikörpers. Benchmark-Antikörper gegen RBD (Klasse 1: REGN1093314, Klasse 3: REGN1098714 und Klasse 4: VHH-7215) wurden einbezogen, um die von uns entdeckten RBD-zielenden VHHs zu klassifizieren11. Bemerkenswerterweise binden vierzehn von 15 mit VHH-7215 gebündelten RBD-Bindern bekanntermaßen ein kryptisches kreuzreaktives Klasse-4-Epitop auf dem RBD (Abb. S1A)11. Im Gegensatz dazu kam es bei einem RBD-Binder (7A9) zu keiner Bindung mit einem der anderen getesteten Kandidaten oder Benchmark-Antikörper, was auf ein neues Epitop hinweist. Wir haben keine kreuzreaktiven RBD-Targeting-VHHs gefunden, die entweder an die Klasse-1- oder Klasse-2-Epitope gebunden haben, was mit der Literatur übereinstimmt, dass Epitope an der Spitze der RBD variabler und stammspezifischer sind. Ebenso wurden beide NTD-bindenden VHHs (19B8 und 16H7) zusammen gruppiert (Abb. S1B). Was die S2-Binder betrifft, so bündelten drei der VHHs, die nicht an MERS banden, zusammen, während ein dreifach kreuzreaktives VHH (6A1) getrennt von den vier doppelt kreuzreaktiven VHHs bündelte, was darauf hindeutet, dass sie tatsächlich auf unterschiedliche Epitope in der S2-Domäne abzielen ( Abb. S1B). Die anderen beiden dreifach kreuzreaktiven VHHs (S3_29, S3_44) wurden in diesem Test nicht bewertet, da sie gut an den auf der Zelloberfläche exprimierten Spike, aber schlecht an rekombinante Proteine ​​banden (Tabellen S1–S3).

Im Gegensatz zu den gut dokumentierten kreuzreaktiven Antikörpern, die auf die RBD abzielen, sind Benchmark-S2-bindende Antikörper mit bekannten Epitopen selten. Daher verwendeten wir Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie (HDX-MS), um die Epitope der drei von uns identifizierten Klassen von S2-Bindern abzubilden. Dazu gehörten 6A1 (dreifach kreuzreaktiv), 11F5 (doppelt kreuzreaktiv) und S3_29, das im FACS-Bindungstest dreifach kreuzreaktiv war (Abb. 3, Abb. S2). Unsere HDX-Daten zeigten mit hoher Sicherheit drei unterschiedliche Bindungsepitope für diese auf S2 gerichteten VHHs. Das erste Epitop (in Abb. 3B blau dargestellt) befindet sich oben in der S2-Domäne und wird vom dreifach kreuzreaktiven VHH S3_29 angegriffen. Dieses Epitop ähnelt dem des kürzlich gemeldeten kreuzreaktiven MERS-Antikörpers 3A3 und umfasst die S-2P-stabilisierenden Mutationen, die unser Spike-Konstrukt stabilisieren16. Angesichts der Unfähigkeit von S3_29, Wildtypviren zu neutralisieren, und seiner schlechten Bindung an rekombinantes Protein ist es wahrscheinlich, dass diese Reste für die Stabilisierung des Konformationsepitops in dieser dynamischen Region des Proteins wichtig sind und nicht direkt für die Erkennung wichtig sind. Das zweite S2-Epitop befindet sich in der Stamm-Helix-Region an der Basis des Spike-Proteins und wird vom dreifach kreuzreaktiven VHH 6A1 angegriffen. Das endgültige Epitop befindet sich ebenfalls an der Basis des Spike-Proteins, jedoch oberhalb der Stammhelixregion (dargestellt in Orange und Rot), und wird vom doppelt kreuzreaktiven VHH 11F5 und wahrscheinlich von einigen anderen VHHs, die mit ihm binden, angegriffen (Abb . S1B).

Identifizierung von VHH-Bindungsepitopen zur Orientierung beim Design der Linkerlänge. Die Epitope ausgewählter S2-Binder wurden durch HDX-MS unter Verwendung der Spike-Protein-S2-Domäne bestimmt. (A) Diagramme der Wasserstoff-Deuterium-Austauschdifferenz werden für S3_29, 11F5 und 6A1 angezeigt. Sequenzregionen mit signifikanten Unterschieden sind AA962-1006, LVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQT für S3_29; AA899-916, MQMAYRFNGIGVTQNVL und AA1111-1145, EPQIITTDNFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPEL für 11F5; AA1176-1178, VVN und AA1183-1197, DRLNEVAKNLNESL für 6A1. (B) Die Struktur des SARS-CoV-2 Spike (S)-Proteins ist grau gefärbt (PDBID: 6XKL). Das Mapping für S3_29 wird blau dargestellt. Die Zuordnung für 11F5 ist in Orange und Rot dargestellt und markiert die durch VHH geschützten bzw. entschützten Sequenzen. Da die Region, auf die 6A1 abzielt, nicht in einer vollständigen Spike-Ektodomänen-Proteinstruktur aufgelöst wurde, ist sie in dieser Abbildung nicht dargestellt.

Wir waren neugierig, dass das RBD-bindende VHH 7A9 an ein kreuzreaktives Epitop band, das mit keinem der in dieser Studie verwendeten Benchmark-Antikörper bindet. Um das 7A9-Epitop zu charakterisieren, verwendeten wir erneut HDX-MS, was darauf hinwies, dass die Hauptbindungsstelle von 7A9 teilweise durch das NTD verdeckt ist und die Reste 353–364 des Spike-Proteins umfasst (Abb. S3). Um diese seltene Antigenstelle weiter zu analysieren, verwendeten wir Röntgenkristallographie, um die Struktur von 7A9 zu bestimmen, das an das CoV-2-RBD gebunden ist (Abb. 4, Tabelle S5). Die Struktur zeigt, dass die dritte komplementaritätsbestimmende Region (CDR3) von 7A9 eine Plattform bildet, über die das VHH an eine konkave Spalte auf dem RBD bindet und Leu107 in eine kleine Spalte einfügt, die von Tyr396 und Phe464 gebildet wird. CDR1 und CDR2 tragen nur minimal zur Wechselwirkung bei, wobei Arg31 von CDR1 ein Netzwerk von Van-der-Waals-Wechselwirkungen bildet und Tyr60 von CDR2 eine Wasserstoffbindung mit Glu465 bildet. Der energetische Treiber der Wechselwirkung sind wahrscheinlich die Salzbrücken, die zwischen Arg357 des RBD und zwei 7A9-Glutamaten in CDR3, Glu104 und Glu119, gebildet werden. Eine detaillierte Ansicht der molekularen Wechselwirkungen ist in Abb. 4B dargestellt. Die Struktur hilft zu verstehen, wie 7A9 immer noch in der Lage ist, die Omicron-Variante zu binden und zu neutralisieren (Tabellen S1, S4), da das Epitop mit keiner der 15 RBD-Mutationen in dieser VOC überlappt (Abb. 4C). Bemerkenswert ist, dass das 7A9-Epitop im geschlossenen Zustand vollständig und im offenen Zustand des Spike-Proteins teilweise verschlossen ist (Abb. 4D). Die Modellierung der Bindung von 7A9 an das vollständige CoV-2-Spike-Protein weist darauf hin, dass das VHH entweder im geschlossenen oder offenen Zustand eine Kollision mit dem NTD des benachbarten Spike-Protomers einleiten würde (Abb. S4). Dies legt nahe, dass bei der VHH-Bindung entweder eine Konformationsverschiebung im RBD relativ zum NTD oder eine Trimerdissoziation auftreten müsste. Tatsächlich haben aktuelle HDX-Studien und Fortschritte bei der Analyse der Heterogenität in Kryo-EM-Daten gezeigt, dass das Spike-Protein recht dynamisch ist und Zustände abtastet, die möglicherweise das 7A9-Epitop freilegen würden17,18.

VHH 7A9 bindet ein seltenes RBD-Epitop und löst die Spike-Trimer-Dissoziation aus. (A) Kristallstruktur von VHH 7A9, gebunden an die SARS-CoV-2-RBD. Die RBD wird in Hellgrau dargestellt, wobei das Epitop in Blaugrün hervorgehoben ist. Das VHH wird in Dunkelgrau dargestellt, wobei CDR1, CDR2 und CDR3 jeweils in Grün, Blau und Rot hervorgehoben sind. (B) Molekulare Wechselwirkungen zwischen VHH 7A9 und dem SARS-CoV-2 RBD. Die RBD ist in Hellgrau dargestellt, die Epitopreste in Blaugrün. 7A9 ist dunkelgrau dargestellt. Polare Wechselwirkungen werden durch violette gestrichelte Linien dargestellt. (C) SARS-CoV-2 RBD in Cartoon- und transparenter Oberflächennotation, wobei die Cα-Kohlenstoffe der in der Omicron-Variante mutierten Reste als rote Kugeln dargestellt sind. Das Epitop von VHH 7A9 ist blaugrün dargestellt. (D) Überlagerung der SARS-CoV-2-RBD von der Kristallstruktur auf die geschlossenen (links) oder offenen (rechts) Spike-Proteinstrukturen (PDBs: 7DF3 bzw. 6XKL). (E) Kontinuierliche Verteilungsanalysen (c(s)) analytischer Ultrazentrifugationsdaten. Von oben nach unten: 7A9 VHH allein, 1E4 VHH allein, SARS-CoV-2 Spike allein, SARS-CoV-2 Spike + 7A9 VHH und SARS-CoV-2 Spike + 1E4 VHH.

Um die strukturellen Konsequenzen der Bindung von 7A9 an das SARS-CoV-2-Spike-Trimer zu verstehen, führten wir eine Reihe von Experimenten zur analytischen Ultrazentrifugations-Sedimentationsgeschwindigkeit (AUC-SV) durch und verwendeten dabei eine kontinuierliche Verteilungsanalyse (c(s)), um die vorhandenen Spezies zu bestimmen in Lösung (Abb. 4E, Abb. S5A). Die c(s)-Verteilung des Spikes allein zeigte sich als einzelner Peak (95 % des Gesamtsignals) bei 15,9 s, was einer scheinbaren Masse von 441 kDa entspricht, was mit einem stabilen Trimer übereinstimmt (geschätzte Masse von 398 kDa). 7A9 VHH zeigte sich als einzelner Peak (93 % des Gesamtsignals) bei 2,1 s, was erwartungsgemäß einer scheinbaren Masse von 18 kDa entspricht. 7A9 wurde dann mit dem Spike-Trimer in einem Molverhältnis von 1,5:1 (Monomer:Monomer) gemischt. Im Vergleich zum Spike-Trimer allein zeigte diese Mischung eine dramatische Verschiebung im Sedimentationsprofil, die aus den Absorptionsscans leicht ersichtlich ist (Abb. S5A). Die c(s)-Verteilung zeigte zwei Hauptarten bei 2,2 s (7 %) und 8,0 s (86 %) mit scheinbaren Massen von 22 bzw. 155 kDa. Wir interpretieren diese Spezies als überschüssiges freies 7A9-VHH und 7A9, gebunden an ein Spike-Monomer (theoretische Masse von 151 kDa). Bemerkenswerterweise war nach dem Mischen mit 7A9 kein nennenswertes intaktes Spike-Trimer (15,9 s) übrig, was darauf hindeutet, dass die Bindung von 7A9 das Spike-Trimer vollständig dissoziierte. Um festzustellen, ob die Dissoziation des Spike-Trimers speziell auf die 7A9-Bindung zurückzuführen ist, führten wir identische AUC-SV-Experimente mit dem 1E4-VHH durch, von dem vorhergesagt wird, dass es an das Spike-Trimer bindet, es aber nicht stört. Ähnlich wie bei 7A9 allein zeigte die c(s)-Verteilung von 1E4 allein einen einzelnen Peak (98 % des Gesamtsignals) bei 2,1 s, was einer scheinbaren Masse von 19 kDa entspricht. Das Mischen von 1E4 mit dem Spike-Trimer im Verhältnis 1,5:1 (Monomer:Monomer) zeigte zwei Hauptspezies bei 2,0 s (8 %) und 16,7 s (88 %) mit scheinbaren Massen von 20 bzw. 467 kDa. Wir interpretieren diese Spezies als überschüssiges freies 1E4-VHH und 1E4, das an den Spike-Timer gebunden ist (theoretische Masse von 451 kDa). Darüber hinaus analysierten wir identische Proben mithilfe der Größenausschlusschromatographie gekoppelt mit Mehrwinkel-Lichtstreuung (SEC-MALS) und führten Molekulargewichtsberechnungen mithilfe einer Konjugatanalysemethode durch (Abb. S5B). In Übereinstimmung mit den AUC-SV-Experimenten beobachteten wir eine Dissoziation des Spike-Trimers bei der Bindung an 7A9, nicht jedoch an 1E4, wobei die berechneten Massen der Komplexe mit den AUC-SV-Experimenten vergleichbar waren (Abb. S5C). Zusammengenommen zeigen diese Daten deutlich, dass die Bindung von 7A9 an sein kryptisches Epitop zur vollständigen Dissoziation des SARS-CoV-2-Spike-Trimers führt, wohingegen das Spike-Trimer bei der Bindung von 1E4 intakt bleibt.

Es wurde berichtet, dass die Multimerisierung von VHHs zu einer Verbesserung der Wirksamkeit führen kann8,19,20 und unsere weiter oben in diesem Manuskript beschriebenen Daten (Abb. 1B) legen nahe, dass bivalente VHHs im Vergleich zu ihren monovalenten Gegenstücken tatsächlich eine verbesserte Antigenbindungsaffinität aufweisen. Angesichts sowohl der Größe des Spike-Proteins als auch seiner trimeren Natur verwendeten wir zwei Ansätze, um eine höhere Wirksamkeit und potenziellen Schutz vor Escape-Mutationen zu erreichen. Der erste Ansatz bestand darin, Homotrimere RBD-bindender VHHs (1E4, 7A9 und 10B8) zu entwerfen, um jedes Monomer des Spike-Proteins gleichzeitig zu binden und die Wirksamkeit zu verbessern. Alternativ haben wir auch Heterotrimere entworfen, die auf drei verschiedene Stellen auf dem Spike-Protein abzielen, die theoretisch resistenter gegen Escape-Mutanten wären, da der Affinitätsverlust an einer Stelle durch die Bindung an den anderen Stellen ausgeglichen werden könnte. Mithilfe der Ergebnisse der Domänenbindung, der Epitopkartierung und der Strukturmodellierung wurden eine Reihe homo- und heterotrimerer Konstrukte entworfen, um die optimalen Längen der Linker zwischen den einzelnen VHH zu bestimmen.

Um festzustellen, ob die Multimerisierung die Wirksamkeit steigert, verglichen wir die Neutralisierungswirksamkeit multimerer Konstrukte mit Cocktailmischungen einzelner VHHs, die im jeweiligen Multimer verwendet wurden (Abb. 5, Tabelle S6). Ein Homotrimer von 1E4 zeigte eine etwa 26-fache Verbesserung der Neutralisierung des SARS-CoV-2-Pseudovirus und eine etwa 46-fache Verbesserung der Neutralisierung des authentischen SARS-CoV-2-Virus (Abb. 5A–C). Ebenso zeigte ein heterotrimeres Konstrukt, das auf RBD, NTD und S2 abzielt, im SARS-CoV-2-Pseudovirus-Assay eine 43-fache Verbesserung der Neutralisierung gegenüber einem Cocktail derselben drei VHHs (Abb. 5D, E). Wichtig ist, dass diese Wirksamkeitsverbesserung auch bei der authentischen SARS-CoV-2-Neutralisierung beobachtet wurde (Abb. 5F). Darüber hinaus beobachteten wir bei mehreren Designs, bei denen schwach neutralisierende oder nicht neutralisierende VHHs kombiniert werden konnten, um die Wirksamkeit zu steigern, eine Multimerisierung, die zu einer verbesserten Wirksamkeit führte (Tabelle S6).

Die Multimerisierung von VHH führt zu einer erhöhten Neutralisierungskraft. (A) Design eines homotrimeren VHH-Multimers mit 20 AA-Linker (4 × GGGGS) zwischen dem monomeren VHH 1E4. Die Struktur des SARS-CoV-2 Spike (S)-Proteins (PDBID: 6XKL) ist wie in Abb. 1 nach Domänen gefärbt. (B) SARS-CoV-2-VSV-Pseudovirus-Neutralisierung durch 1E4-VHH-Monomer vs. 1E4-VHH-Trimer. (C) Neutralisierung des authentischen SARS-CoV-2-Virus durch 1E4-VHH-Monomer vs. 1E4-VHH-Trimer. (D) Design eines heterotrimeren VHH-Multimers mit 20 AA-Linker (4 × GGGGS) zwischen VHH 7A9 und VHH 19B8 und 50 AA-Linker (GAS) zwischen VHH 19B8 und VHH S3_29. Die Struktur des SARS-CoV-2 Spike (S)-Proteins (PDBID: 6XKL) ist wie in Abb. 1 nach Domänen gefärbt. Heterotrimeres Design mit 20 AA-Linker (4 × GGGGS) zwischen VHH 7A9 und VHH 19B8 und 50 AA Linker (GAS) zwischen VHH 19B8 und VHH S3_29. (E) SARS-CoV-2-VSV-Pseudovirus-Neutralisierung durch 7A9-19B8-S3_29-Multimer vs. Kombination von 7A9, 19B8 und S3_29 in äquimolaren Konzentrationen. (F) Neutralisierung des authentischen SARS-CoV-2-Virus durch 7A9-19B8-S3_29-Multimer im Vergleich zu einer Kombination aus 7A9, 19B8 und S3_29 in äquimolaren Konzentrationen.

In dieser Studie haben wir eine Vielzahl kreuzreaktiver VHHs gegen das Coronavirus-Spike-Protein entdeckt und die Bindungsaffinität, Neutralisierungsstärke und die Epitope, auf die diese VHHs abzielen, charakterisiert. Während die Affinitäten dieser VHHs in ihrem Monomerformat zwischen < 1 nM und > 100 nM lagen, wurden für das bivalente VHH-Fc-Format Affinitäten < 1 nM beobachtet. Wir fanden heraus, dass einige der VHHs eine außergewöhnliche Bindungsaffinität und Neutralisierungskraft gegen SARS-CoV-2 aufweisen, die mit den Benchmark-Antikörpern vergleichbar sind, die in der Klinik oder in der klinischen Entwicklung verwendet werden (Abb. 2C). Darüber hinaus können diese wirksamen Antikörper auch das verwandte Coronavirus SARS-CoV neutralisieren und ihre Aktivität gegen das neu aufgetretene Omicron VOC beibehalten.

Die von uns identifizierten kreuzreaktiven VHHs binden unterschiedliche Epitope auf dem Spike-Protein. Der Großteil der Antikörper reagiert kreuzreagierend auf SARS-CoV und SARS-CoV-2, nicht jedoch auf MERS, was zu erwarten war, da SARS-CoV und SARS-CoV-2 stärker verwandt sind und beide zur Unterfamilie der Sarbecoviren gehören. Die meisten der von uns identifizierten VHHs zielen auf die RBD-Domäne ab, und alle auf RBD abzielenden VHHs wirken neutralisierend. Dieser Befund steht im Einklang mit der Literatur, in der mindestens zwei unterschiedliche kreuzneutralisierende Epitope auf dem RBD (Klassen 3 und 4)11 identifiziert wurden. Interessanterweise zielen die meisten der von uns gefundenen RBD-VHH-Antikörper auf das kryptische Klasse-4-Epitop (Ziel von VHH-7215 und CR302213), was darauf hindeutet, dass die geringere Größe von VHH tatsächlich die Interaktion mit dieser weniger zugänglichen Antigenstelle erleichtern könnte.

Unter den von uns entdeckten kreuzreaktiven RBD-Ziel-VHHs ist 7A9 einzigartig, da es das einzige in dieser Studie identifizierte VHH ist, das sowohl kreuzreaktiv ist als auch nicht eindeutig mit anderen Epitopen der Klasse 1–4 assoziiert ist. Unsere kombinierten Strukturansätze zeigen deutlich, dass 7A9 an ein hochkonserviertes und kryptisches Epitop auf dem RBD bindet, das teilweise durch den CoV-2-Spike-NTD verdeckt wird, was eine strukturelle Grundlage für die beibehaltene Bindung und Neutralisierung von 7A9 an die Omicron-Variante darstellt. Wichtig ist, dass unsere Daten auch zeigen, dass die Bindung von 7A9 zur Dissoziation des CoV-2-Spike-Trimers führt. Kürzlich wurden zwei Strukturen von Antikörpern beschrieben, die an ein ähnliches kryptisches RBD-Epitop binden: das bispezifische bn03-VHH (n3130v-Segment) und 553–49 IgG21,22. Ähnlich wie 7A9 binden diese beiden Antikörper an Stellen, die teilweise durch die NTD eines benachbarten Protomers im CoV-2-Spike-Trimer verdeckt sind, und induzieren bei der Bindung die Dissoziation des Trimers. Ein Vergleich der Strukturen von 7A9, bn03 und 553–49 zeigt jedoch jeweils einzigartige Bindungsmodi (Abb. S6A). Ein Vergleich der Fußabdrücke jedes Antikörpers zeigt, dass die Epitope von 553–49 und bn03 nur sehr geringe Überlappungen miteinander aufweisen. Die Bindungsstelle von 7A9 liegt zwischen der von 553–49 und bn03 und teilt Epitopreste mit jedem dieser Antikörper (Abb. S6B und C). Die unterschiedlichen Mechanismen dieser drei Antikörper werden durch die Tatsache weiter verdeutlicht, dass sich nur die RBD-Reste R355 und R357 in der Nähe der Schnittstellen aller drei befinden (Abb. S6C und D). Daher kann jeder dieser Antikörper eine breite Spezifität erreichen und über unterschiedliche Bindungsmechanismen eine Trimer-Dissoziation induzieren. Es ist unklar, warum diese Wirkstoffe unterschiedliche Grade der Virusneutralisierung aufweisen, was auf mehrere Faktoren zurückzuführen sein könnte, darunter Größe, Bindungsgeometrie und Wertigkeit. Interessanterweise wurde in den letzten Jahren über mehrere Antikörper berichtet, die andere trimere virale Fusionsproteine, einschließlich Influenza-Hämagglutinin und Respiratory-Syncytial-Virus-Fusionsprotein, dissoziieren, was darauf hindeutet, dass dies ein häufiger Mechanismus der Antikörperneutralisierung gegen Atemwegsviren sein könnte23,24.

Einige der VHHs, die sowohl mit SARS-CoV als auch mit SARS-CoV-2 kreuzreaktiv waren, zielen auf NTD und S2 ab, und während einige der NTD-Binder neutralisierend wirken, neutralisiert keiner der S2-Binder. Wir fanden außerdem drei hoch kreuzreaktive VHHs, die ebenfalls an das Spike-Protein von MERS banden, das zu einer separaten Unterfamilie von CoV und CoV-2 gehört. Alle diese drei VHHs zielen auf die S2-Domäne ab, neutralisierten jedoch keinen der drei Viren. Diese Daten legen nahe, dass die S2-Domäne konservierter ist und mehrere unterschiedliche kreuzreaktive Epitope aufweist. Obwohl diese kreuzbindenden S2-Antikörper nicht neutralisierend sind, ist es möglich, dass sie durch andere Fc-vermittelte Mechanismen in vivo Schutz bieten können. Wir führten daher eine zusätzliche Charakterisierung durch, um die spezifischen Epitope zu verstehen, auf die sie abzielen. Anhand unserer HDX-Kartierungsdaten konnten wir mit hoher Sicherheit drei unterschiedliche Bindungsepitope für S2-Targeting-VHHs beobachten. Das erste Epitop wird durch S3_29 repräsentiert, das eine Sequenzähnlichkeit mit einem anderen VHH aufweist und auf die Spitze der S2-Domäne abzielt. Im geschlossenen Zustand des Spike-Proteins ist diese Region für VHHs weder exponiert noch zugänglich. Diese Region könnte auf eine von zwei Arten für die VHH-Bindung freigelegt werden: (a) wenn sich mehrere RBDs im offenen Zustand befinden, oder (b) nach der Abspaltung von S1, aber vor der Konformationsänderung, die der Membranfusion vorausgeht. Interessanterweise gibt es einen früheren Bericht über einen Antikörper, der auf dieselbe Region abzielt, die auf ähnliche Weise mit HDX kartiert wurde, was einen weiteren Beweis dafür liefert, dass diese Stelle zugänglich ist25. Das zweite Epitop wird durch 6A1 repräsentiert, das auf die Stammhelixregion an der Basis des Spike-Proteins abzielt. Obwohl in den meisten Spike-Proteinstrukturen keine Lösung gefunden wurde, haben frühere Studien über ähnliche Antikörper berichtet26,27,28,29. Diese Region wird unabhängig vom Konformationszustand des Präfusions-Spike-Proteins freigelegt. Unsere Bindungsdaten legen nahe, dass dieses Epitop das breiteste dieser Studie ist und nicht nur eine Reaktivität gegenüber dem Sarbecovirus und MERS aufweist, sondern auch gegenüber den endemischen menschlichen Coronaviren HKU1 und OC43, die zu einer anderen Beta-Coronavirus-Unterfamilie als CoV/CoV-2 und MERS gehören. Unsere Daten deuten darauf hin, dass dieser Bereich des Spike-Proteins wahrscheinlich am besten konserviert ist. In Zukunft wäre es interessant zu untersuchen, ob die Bindung von Antikörpern an dieses Epitop Schutz vor einer Infektion und Erkrankung mit dem Coronavirus bieten kann. Das letzte S2-Epitop wird durch 11F5 repräsentiert, das an die Basis des Spike-Proteins bindet. Interessanterweise scheint dieser Antikörper bei der Bindung an die Unterseite des Spikes in unserem HDX-Experiment sowohl Schutz- als auch Entschützungseffekte hervorzurufen, was darauf hindeutet, dass der Spike eine lokale Konformationsänderung erfährt, wenn dieser Antikörper bindet.

Die meisten unserer VHH-Multimer-Designs führten zu einer Potenzsteigerung, während zwei Designs im Vergleich zu ihren jeweiligen VHH-Cocktails einen geringfügigen Potenzverlust aufwiesen. Bei mehreren unserer Multimer-Designs wurde eine deutliche Steigerung der Wirksamkeit beobachtet. Eines der homotrimeren Designs, 1E4, zeigte eine deutliche Wirksamkeitssteigerung gegenüber seiner Monomerversion. Homotrimere von 10B8 und 7A9 zeigten jedoch keine Wirksamkeitssteigerung gegenüber ihren jeweiligen Monomeren. Ein möglicher Grund dafür könnte darin liegen, dass beim aktuellen Design keine gleichzeitige Bindung an alle drei Protomer möglich ist. Während gezeigt wurde, dass homotrimere VHH-Konstrukte, die auf RBD-Epitope abzielen, die Wirksamkeit im Vergleich zu ihren Monomer-Gegenstücken steigern8,19,20, zeigte unsere Studie auch eine signifikante Wirksamkeitsverbesserung mit heterotrimeren Konstrukten im Vergleich zu ihren jeweiligen Cocktailmischungen. Insbesondere beobachteten wir eine signifikante Steigerung der Wirksamkeit, wenn Heterotrimere entweder unter Verwendung schwach neutralisierender oder nicht neutralisierender VHHs hergestellt wurden. Im Gegensatz dazu waren die Wirksamkeitssteigerungen, die gegenüber den jeweiligen VHH-Cocktails beobachtet wurden, wenn die Multimere unter Verwendung starker Neutralisatoren entworfen wurden, bescheiden. Interessanterweise scheinen die meisten multimeren VHHs, die den höchsten Anstieg der Neutralisierungskraft zeigten, das S3_29-VHH zu umfassen. Wir spekulieren, dass dieses Epitop, das relativ näher an der S1-Domäne von Spike liegt, dazu beitragen könnte, die RBD- oder NTD-Targeting-Komponenten zu stabilisieren, um ihre Epitope zu binden. Es ist möglich, dass die gleichzeitige Bindung mehrerer Epitope die Konformation des Spike-Proteins einschränkt, was zu einer weiteren Steigerung der Wirksamkeit führt. Dieser Ansatz hat auch das Potenzial, vor Escape-Mutationen zu schützen, und könnte bei der Bewältigung des bei mehreren klinischen Kandidaten beobachteten Wirksamkeitsverlusts durch das Auftreten von SARS-CoV-2-Varianten hilfreich sein. Eine ähnliche Strategie könnte auf die Entwicklung von Therapeutika gegen andere Krankheitserreger angewendet werden, die erhebliche Unterschiede aufweisen.

Das SARS-CoV-Präfusionsstabilisierte Spike-Protein (SARS-CoV-PreS) umfasst die Ektodomänenreste 1–1190 des SARS-CoV-Spike-Proteins (Aminosäure 1 bezeichnet das Ausgangsmethionin im Signalpeptid) und zwei Prolinsubstitutionen bei K968P und V969P, a C-terminale T4-Fibritin-Trimerisierungsdomäne, eine HRV3C-Protease-Spaltstelle und ein 8 × His-Tag wie zuvor beschrieben30. Das SARS-CoV-Spike-Ektodomänenprotein, bei dem der His-Tag nicht gespalten wurde (CoV-PreS-3C), enthielt anstelle der HRV3C-Proteasestelle eine Thrombin-Spaltungsstelle. Das MERS-Präfusionsstabilisierte Spike-Protein (MERS-PreS) umfasst die Ektodomänenreste 1–1291 des MERS-Spike-Proteins, zwei Prolin-Substitutionen bei V1060P und L1061P, eine „ASVG“-Substitution an der Furin-Spaltungsstelle (Reste 748–751, RSVR), eine C-terminale T4-Fibritin-Trimerisierungsdomäne, eine Thrombin-Spaltungsstelle und ein 8 × His-Tag, ähnlich wie zuvor beschrieben31. Das SARS-CoV-2-Präfusionsstabilisierte Spike-Protein (SARS-CoV-2-PreS) umfasst die Ektodomänenreste 1–1208 des SARS-CoV-2-Spike-Proteins, zwei Prolin-Substitutionen bei K986P und V987P, eine „GSAS“-Substitution am Furin Spaltstelle (Reste 682–685, RRAR), eine C-terminale T4-Fibritin-Trimerisierungsdomäne, eine Thrombin-Spaltstelle und ein 8 × His-Tag, ähnlich wie zuvor beschrieben . Das „geschlossene“ Konformations-SARS-CoV-2-Spike-Protein-Trimer (CoV-2-PreS-Closed) enthält die SARS-CoV-2-Spike-Protein-Ektodomänenreste 1–1208 und vier Aminosäuresubstitutionen (D614N, A892P, A942P und V987P). ), eine Thrombin-Spaltstelle und ein 8 × His-Tag, ähnlich wie zuvor beschrieben33. Die Proteinkonstrukte der Rezeptorbindungsdomäne (RBD) und der N-terminalen Domäne (NTD) wurden wie folgt entworfen. Die CoV-2-S-RBD-SD1-Spike- und CoV-2-S-NTD-Spike-Konstrukte enthalten die Reste 319–591 bzw. 1–305, kloniert im Leserahmen mit der nativen CoV-2-Signalsequenz und angehängt mit einem C-terminalen T4 Fibritin-Trimerisierungsdomäne, eine Thrombin-Spaltungsstelle und ein 8 × His-Tag, ähnlich wie zuvor beschrieben32. Die CoV-S-RBD-SD1- und MERS-S-RBD-SD1-Spike-Proteinkonstrukte enthalten die Reste 306–577 bzw. 367–655, im Leserahmen kloniert mit dem Signalpeptid des nativen Proteins, einer Thrombin-Spaltungsstelle und einem 8 × His- Etikett. Das Konstrukt nur für die S2-Domäne des SARS-CoV-2-Spike-Proteins (CoV-2-PreS-S2) umfasst die Ektodomänenreste 697–1208 mit zwei Prolinsubstitutionen bei K968 und V969, kloniert im Rahmen unmittelbar stromabwärts eines IgK-Signalpeptids und angehängt mit einem T4 Fibritin-Trimerisierungsdomäne, Thrombin-Spaltungsstelle und 8 × His-Tag am C-Terminus. Biotinylierte Konstrukte umfassen eine Avi-Tag-Sequenz unmittelbar stromaufwärts der Protease-Spaltungsstelle, flankiert von GRS-GG-Linkern. Das für die Röntgenkristallographie verwendete CoV-2-S-RBD-Konstrukt enthält die Reste 319–541, wurde im Leserahmen mit der nativen CoV-2-Signalsequenz kloniert und enthielt ein C-terminales SG-6xHis. Alle Gen-kodierenden Regionen wurden für Säugetier-Codons optimiert und unter der Kontrolle des CMV-Promotors in einen eukaryotischen Expressionsvektor subkloniert.

Plasmide wurden unter Verwendung von Expifectamine (ThermoFisher) gemäß dem vom Hersteller empfohlenen Protokoll vorübergehend in Expi 293F-Zellen (ThermoFisher) transfiziert. Zellüberstände wurden 72 Stunden nach der Transfektion geerntet und durch 30-minütige Zentrifugation bei 10.700 × g und 20 ° C geklärt. Den geklärten Überständen wurde PS-20 in einer Endkonzentration von 0,01 % zugesetzt, um die Aggregation abzuschwächen. Die geklärten Überstände wurden in 250-ml-Corning-Flaschen aufgeteilt und zur Lagerung bis zur Reinigung bei –70 °C überführt.

Der geklärte Überstand wurde in einem 37 °C warmen Schüttelwasserbad aufgetaut und der Reinigung zugeführt. Das Spike-Protein wurde mittels Affinitätschromatographie mit immobilisiertem Metall (IMAC) auf einer HisTrap Ni Sepharose Hi Performance-Säule (Cytiva) auf einem schnellen Protein-Flüssigkeitschromatographiesystem gereinigt. Der Reinigungs-Tag wurde entweder mit Thrombin- (Cytiva) oder HRV3C-Protease (Accelagen) gespalten und über Nacht bei 25 °C bzw. 4 °C unter leichtem Rühren inkubiert, um das Imidazol zu entfernen. Bei Proteinen mit einem ähnlichen Molekulargewicht wie Thrombin wurde der His-Tag der rekombinanten Proteine ​​mit dem Thrombin CleanCleave™ Kit (Sigma-Aldrich) gemäß dem vom Hersteller empfohlenen Protokoll abgespalten.

Das Spike-Protein wurde durch einen zweiten, subtraktiven IMAC-Schritt auf einer HisTrap FF-Säule (Cytiva) weiter gereinigt, um gespaltene Spike-Proteine ​​von Protease, Verunreinigungen und ungespaltenem Spike zu trennen. Wenn eine Biotinylierung erforderlich ist, wurde das gereinigte Spike-Protein nach subtraktiver IMAC mit dem Biotinylation Kit (Avidity LLC) gemäß dem vom Hersteller empfohlenen Protokoll biotinyliert. Der letzte Reinigungsschritt der Probe wurde durch Größenausschlusschromatographie (SEC) unter Verwendung einer HiLoad™ 26/600 Superdex™ 200 pg-Säule (Cytiva) für SARS-CoV-2-PreS und MERS-PreS und eines HiPrep™ 26/60 Sephacryl erreicht S-300 HR-Säule (Cytiva) für SARS-CoV-PreS mit 50 mM HEPES, pH 7,5, 300 mM NaCl (150 mM NaCl für SARS-CoV-2-PreS-Closed) Laufpuffer. Fraktionen, die das interessierende Protein enthielten, wurden auf der Grundlage von SEC-Chromatogrammen gepoolt, bei Bedarf konzentriert und filtriert, bevor sie aliquotiert und in flüssigem Stickstoff schockgefrostet wurden. Die endgültige Proteinkonzentration wurde mithilfe der A280-Analyse des NanoDrop™ 2000c-Spektrophotometers (Thermo Scientific) quantifiziert, nachdem die kleine Probenmenge mit 6 M Guanidinhydrochlorid denaturiert worden war. Die Proteinreinheit wurde anhand der Intensität der Banden auf einem Coomassie-gefärbten Gel geschätzt. Der Oligomerisierungszustand und die Größe des Proteins wurden mithilfe der Größenausschlusschromatographie-Mehrwinkel-Laserlichtstreuung (SEC-MALLS) bestätigt.

Das Konstruktdesign, die Expression und die Reinigung des humanen MPV-F-Trimers nach der Fusion wurden bereits beschrieben34.

Das für die Röntgenkristallographie verwendete Konstrukt SARS-CoV-2-S-RBD (519–541) wurde 72 Stunden nach der Transfektion geerntet, der Überstand wurde durch Zentrifugation geklärt und durch Tangentialflussfiltration in 25 mM HEPES konzentriert/Puffer ausgetauscht pH 7,5, 300 mM NaCl. Die Probe wurde durch IMAC über eine HisTRAP FF-Säule (Cytiva) und anschließende Superdex 75-Säule in 25 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl gereinigt. Die Probe wurde auf 10 mg/ml konzentriert und schockgefroren. Das 7A9-VHH wurde 6 Tage nach der Transfektion geerntet und geklärt. Der Überstand wurde durch IMAC über eine HisTRAP Excel-Säule (Cytiva) in 25 mM HEPES pH 7,5, 300 mM NaCl und anschließend Superdex 75 in 25 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl gereinigt. Die Probe wurde auf 10 mg/ml konzentriert und schockgefroren. Für den RBD/7A9-VHH-Komplex wurden die Proben aufgetaut und mit überschüssigem VHH 1:1,5 (RBD:VHH) gemischt und eine Stunde lang bei 4 °C inkubiert. Der Komplex wurde dann über eine Superdex 75-Säule in 25 mM HEPES, pH 7,5, 150 mM NaCl gereinigt. Der endgültige gereinigte Komplex wurde auf 10,7 mg/ml konzentriert und schockgefroren.

Rekombinante SARS-CoV-2-Spike-Proteine ​​aus verschiedenen Varianten, die im ELISA verwendet wurden, wurden von Acro Biosystems erhalten – Variante B.1.1.7 (Kat.-Nr. SPN-C52H6), Variante B.1.351 (Kat.-Nr. SPN-C52Hk), Variante P.1 (Kat.-Nr. SPN-C52Hg), B.1.617.2-Variante (Kat.-Nr. SPN-C52He), BA.2 (Kat.-Nr. SPN-C5223), BA1.1 (Kat.-Nr. SPN-C52Hz).

VHH-Monomer, VHH-Fc und schwere (HC) und leichte (LC) Antikörperketten des menschlichen IgG1 wurden separat in unseren hauseigenen pTT5-basierten Vektor kloniert, der Lonza-Leader-Sekretions-Tags und CMV-Promotor trug. VHH-Fc- und VHH-Monomerplasmide wurden unter Verwendung serumfreier definierter Medien und an Suspension angepasster CHO-Zellen gemäß den Herstellerempfehlungen mit dem Max-Titer-Protokoll vorübergehend in das ExpiCHO-Expressionssystem transfiziert. Plasmide für konventionelle IgG1-Antikörper HC und LC wurden vorübergehend im Verhältnis 1:1 in das ExpiCHO-Expressionssystem transfiziert, wobei serumfreie definierte Medien gemäß den Herstellerempfehlungen mit dem Max-Titer-Protokoll verwendet wurden. Die Zellen wurden nach 7 Tagen mit Futtermitteln am 1. und 5. Tag und einer Temperaturverschiebung auf 32 °C am 1. Tag geerntet. Hochdurchsatz (HT) Protein A (Mabselect)-Affinitätschromatographie in Miniatursäulen (Robocolumns) wurde zum Einfangen und Anreichern rekombinanter Antikörper aus geklärter Erntezellkulturflüssigkeit (HCCF) verwendet. Zur Qualitätskontrolle der exprimierten Moleküle wurde der analytische Größenausschluss (aSEC) zur Charakterisierung des Lösungsverhaltens und die Kapillarelektrophorese (CE-SDS) zur Charakterisierung unter denaturierenden Bedingungen verwendet. Für ausgewählte Moleküle wurde ein akzeptables Kriterium für die Gesamtreinheit gewählt, und die Antikörper wiesen typischerweise eine Reinheit von > 90 % auf, wie durch aSEC bestimmt.

VHH-Multimer-Antikörperketten wurden durch Fusion von 3 VHHs mit unterschiedlichen Linkerlängen und Klonierung in unseren hauseigenen pTT5-basierten Vektor erzeugt. Die verwendeten Linker waren entweder 20 AA (4 × GGGGS), 50 AA (5 × GSAGSAAGSG)35 oder 90 AA (4,5 × ASPAAPAPASPAAPAPSAPA)36. VHH-Multimer-Plasmide wurden in Suspension unter Verwendung serumfreier definierter Medien gemäß den Empfehlungen des Herstellers vorübergehend in das Expi293-Expressionssystem transfiziert. Zellkulturüberstände wurden nach 5 Tagen mit Futter am ersten Tag geerntet. Die Ni-Affinitätschromatographie (Ni Sepharose Excel – Cytiva) unter Verwendung von Schwerkraftflusssäulen ermöglichte die einstufige Reinigung rekombinanter Antikörper aus geklärter Erntezellkulturflüssigkeit. Zur Charakterisierung der Multimere wurde aSEC verwendet.

Alle in dieser Studie beschriebenen Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee von Capralogics, Inc., einer vom USDA regulierten Forschungseinrichtung, genehmigt. Alle durchgeführten Tierarbeiten entsprachen dem vom National Research Council veröffentlichten Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren37, den Richtlinien der American Veterinary Medical Association für die Euthanasie von Tieren38 und den ARRIVE-Richtlinien39.

Bei Capralogics wurden vier Lamas mit einer heterologen rekombinanten Protein-Immunisierungs-Boost-Strategie immunisiert. Dieser Ansatz beinhaltete eine anfängliche subkutane Injektion von 0,5 mg SARS-CoV-2-Spike-Protein, gemischt mit komplettem Freund-Adjuvans, in alle vier Lamas. Für die verbleibenden zwei Injektionen erhielten zwei Lamas unvollständiges Freund-Adjuvans (IFA) und zwei Lamas erhielten kein zusätzliches Adjuvans. Die Injektionen lagen alle im Abstand von drei Wochen und umfassten eine zweite subkutane Injektion von 0,5 mg MERS-Protein und dann eine dritte subkutane Injektion von 0,5 mg SARS-CoV-Spike-Protein. Zehn Tage nach der letzten Injektion wurden den Lamas 200 ml Vollblut in Heparin-Blutentnahmeröhrchen entnommen. Anschließend wurden periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) mithilfe einer Dichtegradientenzentrifugation aus dem Blut isoliert. Die Serumtiter wurden auch gegen SARS-CoV-2, SARS-CoV und MERS-Spike-Protein mittels ELISA bewertet und zwei Lamas wurden für die weitere Verarbeitung ausgewählt (eines, das eine IFA-Injektionsstrategie verwendete, und eines, das außer dem primären kein Adjuvans für Injektionen verwendete). Injektion.)

Gereinigte Lama-PBMCs der immunisierten Tiere wurden mit biotinyliertem SARS CoV-2 oder biotinyliertem MERS-Spike-Protein, Ziegen-Anti-Lama-IgG (H + L) FITC-Konjugat (Thermo Cat# A16061) und 7-AAD Lebend-/Totzellfärbung auf der Zelloberfläche gefärbt (Biolegend, Kat.-Nr. 420404) und Streptavidin BV421 (Biolegend, Kat.-Nr. 405226). Lebende B-Zellen, die positiv auf biotinyliertes Antigen und IgG waren, wurden mit einem BD FACSAria Fusion als Einzelzellen in 96-Well-Platten oder in großen Mengen in Röhrchen sortiert.

Die einzeln sortierten Zellen wurden zwei Wochen lang mit einer gammabestrahlten rekombinanten CD40L-EL4-Zelllinie und intern hergestellten Lama-IL-2/IL-21-Zytokinen bei 37 °C kultiviert. Nach zwei Wochen wurden die Überstände der B-Zellkultur mittels ELISA und FACS auf Bindung an rekombinante oder zellexprimierte Proteine ​​untersucht. Die interessierenden Kandidaten wurden dann in 85 µL Qiagen TCL-Puffer mit 1 % B-Mercaptoethanol lysiert und die RNA wurde unter Verwendung von Qiagen Turbocapture-Röhrchen (Qiagen Kat.-Nr. 72251) isoliert.

cDNA wurde mit SuperScript IV Reverse Transkriptase (Thermo, Kat.-Nr. 18090050) in Gegenwart eines Template Switching Oligo (TSO) für 5'RACE generiert. Anschließend wurde eine erste Runde der PCR-Reaktion unter Verwendung von GoTaq-Polymerase (Promega, Kat.-Nr. M7422), einem Reverse-Primer für die konstante Region, der nur für die schwere Lama-Kette gilt, und einem TSO-kompatiblen Forward-Primer durchgeführt. Eine zweite PCR-Runde, ebenfalls unter Verwendung der GoTaq-Polymerase, verstärkte die PCR-Produkte weiter und führte Illumina MiSeq NGS-Adapter und -Indizes für die Multiplex-NGS-Sequenzierung mit hohem Durchsatz ein. Anschließend wurden einzelne, indizierte PCR-Produkte gepoolt und mit einem Qiagen-Gelreinigungskit (Qiagen-Kat.-Nr. 28704) gelgereinigt. Sequenzen, die durch ELISA oder FACS eine Kreuzreaktivität zwischen zwei oder mehr Stämmen zeigten, wurden identifiziert und für weitere Tests rekombinant exprimiert.

Die sortierten B-Zellen wurden sofort in Qiagen-Puffer RLT mit 1 % B-Mercaptoethanol lysiert und die RNA wurde mit dem Qiagen RNeasy Micro Kit (Kat.-Nr. 74004) isoliert. cDNA wurde mit Superscript IV Reverse Transkriptase (Thermo, Kat.-Nr. 18090050) erzeugt ) in Gegenwart eines Template-Switching-Oligos (TSO), das einen eindeutigen molekularen Identifikator (UMI) enthält, um 5'RACE und Fehlerkorrektur während der Analyse der NGS-Sequenzierungsdaten zu ermöglichen. Anschließend wurden zwei PCR-Runden unter Verwendung von KAPA HiFi Polymerase (KAPA, Kat.-Nr. KK2501), einem Reverse-Primer für die konstante Region, der nur für die schwere Lama-Kette gilt, und einem TSO-kompatiblen Forward-Primer durchgeführt. Die Primer enthielten auch Indizes zur Identifizierung spezifischer Proben und Illumina MiSeq-Adapter. Anschließend wurden einzelne, indizierte PCR-Produkte gepoolt und mit einem Qiagen-Gelreinigungskit (Qiagen-Kat.-Nr. 28704) gelgereinigt. Mithilfe einer bioinformatischen Analyse wurden Sequenzierungsdaten von B-Zellen verglichen, die nach SARS-CoV-2-Spike-Protein und MERS-Spike-Protein sortiert wurden für gemeinsame Sequenzen der beiden Bibliotheken, was auf eine mögliche Kreuzreaktivität einer Sequenz für mindestens zwei Stämme hinweist. Zwei mit diesem Ansatz identifizierte Kandidaten wurden rekombinant exprimiert.

Halbflächenplatten mit 96 Vertiefungen wurden entweder mit 25 μl/Vertiefung von Spike-Proteinen voller Länge oder Domänenproteinen (1 μg/ml in PBS-Puffer) beschichtet und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Platten dreimal mit PBST (PBS + 0,05 % Tween 20) gewaschen und mit 25 ul/Well Blockierungspuffer (PBS mit 5 % FBS) 30 Minuten lang bei Raumtemperatur blockiert. Der Überstand der B-Zellkultur oder der titrierte gereinigte Antikörper wurden dann mit 25 µl/Vertiefung auf die Platten mit 96 Vertiefungen übertragen und 60 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die Platten dreimal mit PBST gewaschen. Dann wurden 25 µl/Vertiefung Kaninchen-Anti-Lama-IgG (H + L) HRP (1:1000-Verdünnung in Blockierungspuffer, Thermo Scientific Kat.-Nr. A16154) oder ein sekundärer Antikörper, der für das Fc des gereinigten Antikörpers spezifisch ist, zu den Platten gegeben und inkubiert 60 Min. bei Zimmertemperatur. Abschließend wurden die Platten fünfmal mit PBST gewaschen und durch 2–3-minütige Zugabe von TMB-Reagenz (Thermo Cat# 34.029) zu den Platten entwickelt. Die Reaktionen wurden mit 0,16 M Schwefelsäure gestoppt und die Absorption bei 450 nm und 650 nm mit einem Spektrometer abgelesen. EC50-Werte für die Proteinbindung wurden mit dem nichtlinearen Regressionskurvenanpassungstool in GraphPad Prism für Log (Agonist) vs. Reaktion (drei Parameter) berechnet, wobei Daten zur optischen Dichte (OD) verwendet wurden, die bei jeder Konzentration in zweifacher Ausfertigung erfasst wurden.

Rekombinante CHO K1-Zelllinien, die Spike-Proteine ​​aus verschiedenen Virusstämmen (SARS-CoV, SARS-CoV-2, MERS, HKU1 und OC43) stabil exprimieren, wurden unter Verwendung von AA 1–1236 von SARS-CoV und AA 1–1254 von SARS-CoV generiert -2, AA 1–1337 von MERS, AA 1–1334 von HKU1 und AA 1–1336 von OC4340. Die Zellen wurden in einem Schüttelinkubator bei 37 °C, 6 % CO2, 75 % Luftfeuchtigkeit und 120 U/min kultiviert. Die Zellen wurden in CD-CHO-Medien (Gibco, Kat.-Nr. 12490) mit 4 mM L-Glutamin (Avantor, Kat.-Nr. 2078), 1 % Hypoxanthin/Thymidin-Mischung (Gibco, Kat.-Nr. 11067), 4 mg/L Blasticidin (Gibco, Kat.-Nr. A11139) und 200 mg/L Zeocin (Invitrogen, Kat.-Nr. R25005), mit Trypsin geerntet und zweimal mit PBS-Puffer gewaschen. Zellspurenfarbstoff (CellTrace-violet Thermo Scientific Kat.-Nr. C34557 und CellTrace-Far Red Thermo Scientific Kat.-Nr. 34564) wurde in optimierten Konzentrationen in PBS verdünnt (1 ml Färbevolumen/10 M Zellen) und zum Resuspendieren von aus den verschiedenen hergestellten Zellpellets verwendet rekombinante Zelllinien. Die Zellen wurden mit den Farbstoffen 30 Minuten lang bei 37 °C im Dunkeln unter gelegentlichem Schwenken inkubiert. Diese Färbereaktionen wurden durch Zugabe von warmem DMEM/F12-Komplettmedium mit 10 % FBS unter Verwendung des Fünffachen des ursprünglichen Färbevolumens gestoppt und 10 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Die gefärbten Zellen wurden abzentrifugiert und einmal mit 10 ml PBS gewaschen und in FACS-Puffer (5 % fötales Rinderserum in PBS) resuspendiert. Anschließend wurden die Zellen überprüft, um sowohl eine positive Färbung mit den Farbstoffen zu bestätigen als auch, dass jede rekombinante Zelllinie eine eigene Fluoreszenzintensität zeigte, wobei ein Intellicyt (Sartorius) verwendet wurde. Die verschiedenen rekombinanten Zelllinien wurden dann durch Resuspendieren in FACS-Puffer gemischt und in 96-Well-Platten (50 µl/Well, 80 x 10^4/Well) aliquotiert. Die Zellen wurden 30 Minuten lang entweder mit 50 µl titrierter, gereinigter Antikörper oder mit B-Zell-Kulturüberstand gefärbt und dann abzentrifugiert und 1x mit FACS-Puffer gewaschen. Abschließend wurden die Zellen 30 Minuten lang mit einem fluoreszierend markierten Sekundärantikörper (spezifisch für die Fc-Domäne des Überstands oder des rekombinanten Antikörpers) angefärbt und anschließend zentrifugiert und zweimal mit FACS-Puffer gewaschen. In 50 μl FACS-Puffer resuspendierte Zellen wurden dann mit einem Intellicyt analysiert. Die EC50-Werte für die FACS-Bindung wurden mit dem nichtlinearen Regressionskurvenanpassungstool in GraphPad Prism für Log (Agonist) vs. Reaktion (drei Parameter) berechnet, wobei die Daten der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) verwendet wurden, die bei jeder Konzentration doppelt erfasst wurden.

VHH-Affinitäten und scheinbare bivalente VHH-Fc-Affinitäten wurden auf einem Biacore 4000 (Cytiva) gemessen. Das SARS-CoV-2 PreS Spike ECD-Protein wurde über einen C-terminalen Avi-Tag biotinyliert und bei 600 RU bis 1500 RU auf einem mit Streptavidin beschichteten Series S Sensor Chip SA (Cytiva, Kat.-Nr. 29699621) immobilisiert. VHHs wurden mit 3,7 nM bis 300 nM injiziert und VHH-Fcs wurden mit 2,5 nM bis 200 nM injiziert. Die Injektionen dauerten 3 Minuten und die Dissoziation wurde 10 Minuten lang überwacht. Der Laufpuffer war HBS EP + (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0,05 % Tween20, pH 7,4) und 25 °C. Die Oberfläche wurde mit einer 30-sekündigen Injektion von Glycin pH 1,9 regeneriert. Die Daten wurden mit der Biacore Evaluation-Software Version 1.1 an ein 1:1-Bindungsmodell angepasst.

Tandem-Binning-Experimente wurden mit Octet-HTX (Sartorius) unter Verwendung der BLI-Technologie durchgeführt, um Anti-CoV-2-Spike-Protein-Antikörper zu binden. Biotinyliertes CoV-2-Spike-ECD-PreS-AVI-Protein (20 nM) wurde 20 Minuten lang auf einem mit Streptavidin (SA) beschichteten Biosensor (Sartorius) eingefangen, um eine Bindungsreaktion von 1,5–2 nm zu erhalten. Der erste Antikörper (20–40 μg/ml) wurde über das trimere SARS-CoV-2-Spike-Protein geleitet, bis alle Bindungsstellen gesättigt waren, gefolgt von der Bindung von 20–40 μg/ml des zweiten Antikörpers. Zur Klassifizierung der RBD-Domänenbinder wurden Benchmark-Binder der Klassen 1, 3 und 4 verwendet. Vier selbst erzeugte Antikörper wurden zum Screening von NTD- und S2-Domänenbindern verwendet. Als Laufpuffer wurde kinetischer Puffer (1XKB, PBS + 0,02 % Tween20, 0,1 % BSA, 0,05 % Natriumazid) verwendet. Die Biosensoren wurden regeneriert (1,7 nM Glycin), gefolgt von einer zweimaligen Pufferwäsche nach jedem Zyklus. Für das Binning-Experiment wurden schwarze geneigte Bodenplatten aus Polypropylen mit 384 Vertiefungen verwendet.

Pseudoviruspartikel, die rVSVΔG-Luc-Konstrukte enthielten, wurden wie zuvor beschrieben hergestellt40,41,42. In der aktuellen Studie wurden die Coronavirus-Spike-Proteine ​​CoV-2-SΔ18 WT oder Varianten SARS-SΔ19 oder MERS-SΔ16 verwendet.

Der Pseudovirus-Neutralisationstest und die IC50-Berechnung wurden wie zuvor in Ref. 40 beschrieben mit geringfügiger Anpassung durchgeführt: Vero E6-Zellen (ATCC) wurden mit 22.000 Zellen/Well für MERS zusätzlich zu 293 T ACE2-Zellen verwendet, die wie für SARS-CoV-2 beschrieben verwendet wurden WT und Varianten und SARS-CoV.

Alle Arbeiten mit authentischen SARS-CoV- und SARS-CoV-2-Viren wurden in BSL-3-Laboren am United States Army Medical Research Institute of Infectious Diseases (USAMRIID) in Übereinstimmung mit den zuvor beschriebenen bundesstaatlichen und institutionellen Biosicherheitsstandards und -vorschriften40 durchgeführt.

Authentische SARS-CoV/Urbani- und SARS-CoV-2-Neutralisierungstests wurden am USAMRIID wie zuvor beschrieben durchgeführt40.

Um das Bindungsepitop für S3_29, 11F5 und 6A1 abzubilden, wurden HDX-MS-Experimente unter Verwendung einer oben beschriebenen Spike-Protein-S2-Domäne (SARS-COV-2-PreS-S2-His) durchgeführt. Die Proteinlösung hatte 1,9 mg/ml (MW ~ 60 kDa, entspricht ~ 30 µM) in 50 mM HEPES, 300 mM NaCl und Puffer mit pH 7,5. Zur Bildung des S2:VHH-Komplexes wurde das gleiche Volumen von 30 µM S2 mit 30 µM VHH bei 4 °C 30 Minuten lang als Stammlösung inkubiert. HDX-MS-Experimente wurden mit einem automatisierten HDX-System (Waters Corporation, MA, USA) wie zuvor beschrieben durchgeführt43. Kurz gesagt, sechs Mikroliter S2- oder S2:VHH-Stammlösung wurden mit Markierungspuffer bei 20 °C zehnfach verdünnt, um die Deuteriumaustauschreaktion zu starten. Die Markierungszeitpunkte waren 0, 10 s, 1, 10 und 100 min. Fünfzig Mikroliter verdünnte Proteinlösung wurden mit einem gleichen Volumen des Quenchpuffers (8 M Harnstoff, 1 M TCEP in 100 mM Phosphatpuffer, pH 2,5) bei 4 °C gemischt, wovon 90 µL in das LC/MS-System injiziert wurden . Der Online-Verdau wurde unter Verwendung einer immobilisierten Protease Typ XIII/Pepsin-Säule (w/w, 1:1), 2,1 × 30 mm (NBA2014002, NovaBioAssays, LLC, MA, USA) durchgeführt.

Um das Bindungsepitop für 7A9 zu kartieren, wurden HDX-MS-Experimente unter Verwendung der oben beschriebenen SARS-CoV-2-RBD-Domäne durchgeführt. Die Proteinlösung hatte 2,6 mg/ml (MW ~ 31 kDa, entspricht ~ 83,5 µM) in 10 mM Natriumphosphat, 75 mM Natriumchlorid, 3 % Saccharose und pH 7,4-Puffer. Der CoV-2 RBD- und 7A9 VHH-Komplex wurde durch Mischen von 15 µL 2,6 mg/ml rekombinantem CoV-2 RBD mit 11,7 µL 3,89 mg/ml 7A9 VHH und 43,3 µL PBS hergestellt. Das rekombinante CoV-2-RBD allein wurde durch Mischen von 15 µL 2,6 mg/ml rekombinantem CoV-2 RBD mit 55 µL PBS hergestellt. 10 µL des rekombinanten CoV-2 RBD allein oder des RBD:VHH-Komplexes wurden mit 90 µL Kontrollpuffer (50 mM Phosphat, 100 mM Natriumchlorid bei pH 7,4) oder Deuteriumoxid-Markierungspuffer (50 mM Natriumphosphat, 100 mM Natrium) inkubiert Chlorid bei pD 7,0). Die Markierungszeit betrug 0 s, 15 s, 60 s, 600 s oder 3600 s bei 8 °C. Der Wasserstoff/Deuterium-Austausch wurde durch Zugabe von 100 µL 4 M Guanidin-HCl, 0,85 M TCEP-Puffer (endgültiger pH-Wert 2,5) gestoppt. Die Mischung wurde dann einem Säulenverdau unter Verwendung der Protease Typ XIII/Pepsin-Säule unterzogen. Die resultierenden Peptide wurden auf einer ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard-Vorsäule (130 Å, 1,7 µm, 2,1 × 5 mm, 186.003.975, Waters) für 3,5 Minuten bei 160 µL/Minute eingefangen und entsalzt. Anschließend wurden die Peptide mit einem 2–30 %-Gradienten von Acetonitril (mit 0,3 % Ameisensäure) über 12,5 Min. bei einer Flussrate von 150 µL/Min. aus der Falle eluiert und auf einer 50 × 1 mm C8-Säule (3 µm, NBA2014015, NovaBioAssays LLC, MA, USA). Ein UPLC-MS-System bestehend aus einem Waters Acquity UPLC gekoppelt mit einem Q Exactive™ HF Hybrid Quadrupol-Orbitrap-Massenspektrometer (Thermo) wurde wie zuvor beschrieben verwendet44. Lösungsmittel A war 0,3 % Ameisensäure in Wasser. Das Injektionsventil und die Enzymsäule sowie die zugehörigen Verbindungsschläuche befanden sich in einer Kühlbox, die auf 8 °C gehalten wurde. Das zweite Schaltventil, die C8-Säule und die dazugehörigen Verbindungsrohre aus rostfreiem Stahl befanden sich in einem weiteren gekühlten Umlaufkasten, der auf –6 °C gehalten wurde. Die Peptididentifizierung erfolgte durch die Suche nach MS/MS-Daten anhand der CoV-2-RBD-Sequenz mithilfe von Byonics (Protein Metrics, CA, USA). Die Massentoleranz für die Vorläufer- und Produktionen betrug 10 ppm bzw. 0,02 Da. Die Massenspektren für deuterierte Proben wurden im Nur-MS-Modus aufgezeichnet. Rohe MS-Daten wurden mit HDX WorkBench verarbeitet, einer Software zur Analyse von H/D-Austausch-MS-Daten45. Die Deuteriumwerte wurden anhand der durchschnittlichen Massendifferenz zwischen dem deuterierten Peptid und seiner nichtdeuterierten Form (t0) berechnet.

Der RBD-7A9-Komplex mit 9,5 mg/ml wurde über Nacht mit EndoH bei 4 °C behandelt und ohne weitere Reinigung in Kristallisationsversuchen verwendet. Kristalle der Raumgruppe P3221 wurden bei 20 °C durch sitzende Tropfendampfdiffusion unter Verwendung eines Tropfenverhältnisses von 2:1 Protein:Reservoirlösung gezüchtet. Die Reservoirlösung enthielt 0,2 M Natriummalonat, pH 6,0, und 18 % PEG 3350. Die Kristalle wurden in Reservoirlösung, ergänzt mit 25 % Glycerin, kryogeschützt.

Röntgenbeugungsdaten wurden an Strahllinie 17-ID an der Advanced Photon Source gesammelt. Die Daten wurden mit autoPROC46 verarbeitet und mit STARANISO47 elliptisch gekürzt. Die Struktur wurde durch molekularen Ersatz in Phenix48 unter Verwendung der SARS-CoV-2-RBD (PDB 7E7Y; Ref. 49) und eines Homologiemodells von 7A9 gelöst, wobei die CDRs als Suchmodelle entfernt wurden. Es gab eine Kopie des Komplexes in der asymmetrischen Einheit. Die Struktur wurde dann in Coot50 neu aufgebaut und iterativen Verfeinerungs- und Neuaufbaurunden mit Phenix und Coot unterzogen. Datenverarbeitungs- und Verfeinerungsstatistiken sind in der Ergänzungstabelle 5 zusammengefasst.

Für AUC-Experimente verwendeten wir die Ektodomäne des SARS-CoV-2-PreS-Closed Spike-Proteins, wie oben beschrieben. Dieses Konstrukt enthält vier stabilisierende Aminosäuresubstitutionen (D614N, A892P, A942P und V987P) und bildet ein stabiles Trimer ohne künstliche Trimerisierungssequenz. Die Proben enthielten 6 μM 7A9 oder 1E4 VHH und/oder 1,33 μM CoV-2-PreS-Closed Spike Trimer (4 μM Monomer) in AUC-Puffer (50 mM HEPES pH 7,5 + 150 mM NaCl). Die Proben wurden gemischt und dann 3 Stunden lang auf einer rotierenden Plattform bei Raumtemperatur inkubiert. 0,4 ml jeder Probe wurden in die rechte Seite und 0,4 ml AUC-Puffer in die linke Seite einer AUC-Zelle mit Saphirfenstern und einem Doppelsektor-EPON-Mittelstück aus Holzkohle geladen. Ausbalancierte Zellen wurden in einen An50Ti-Rotor geladen und in der Kammer eines Beckman Optima AUC unter Vakuum bei 25 °C 1 Stunde lang thermisch äquilibriert. Die Proben wurden bei 40.000 U/min zentrifugiert, wobei insgesamt 300 Scans in 40-s-Intervallen mit einer auf 280 nm eingestellten Absorptionsoptik durchgeführt wurden. Werte für Pufferdichte, Viskosität und partielle spezifische Volumina der Proteine ​​wurden in der Sednterp-Software51 berechnet. Jeder fünfte Scan (insgesamt 60) wurde zur kontinuierlichen Verteilungsanalyse (c(s)) in das Programm Sedfit geladen52. Die anfängliche Anpassung der Parameter wurde iterativ durchgeführt, um die RMSD-Werte zu minimieren. Nach dem Testen mehrerer Werte wurde der Reibungskoeffizient für alle Proben konstant bei 1,2 gehalten. Nach der Optimierung der Anpassungsparameter mithilfe von 60 Scans wurden alle 300 Scans analysiert und die Peaks in Sedfit integriert. Alle AUC-Zahlen wurden mit der Matplotlib-Software53 generiert.

SEC-MALS-Experimente wurden auf einem Agilent 1260 Infinity II HPLC-System unter Verwendung einer Superose 6 Erhöhung 10/300 GL-Säule (Cytiva) bei Raumtemperatur durchgeführt. Das System war mit einem Agilent HPLC UV-Detektor (280 nm) und Wyatt Technology DAWN Heleos II Lichtstreuungs- und T-rEX-Brechungsindexdetektoren ausgestattet. Die mobile Phase bestand aus PBS-Puffer, ergänzt mit 0,02 % Natriumazid, und wurde mit einer Geschwindigkeit von 0,5 ml/min durchströmt. Die Proteinextinktionskoeffizienten wurden basierend auf der Sequenz unter Verwendung von Expasy ProtParam berechnet, wobei eine 1-zu-1-Bindung für die Spike-VHH-Komplexe angenommen wurde. Die Brechungsindexwerte (dn/dc) wurden auf 0,185 bzw. 0,134 ml/g für Protein- und Glykananteile geschätzt. Die Proben wurden wie im Abschnitt „AUC-Methoden“ beschrieben gemischt und inkubiert und anschließend durch eine 0,22-μm-Membran (Millipore) filtriert. Für jeden Lauf wurden 0,1 ml Probe (zwischen 11 und 64 μg Gesamtprotein) auf die Säule injiziert. Die Molekulargewichtswerte wurden in der ASTRA-Software (Wyatt Technology) mithilfe einer Konjugatanalyse bestimmt. Die Daten wurden exportiert und die Zahlen wurden mit der GraphPad Prism-Software erstellt.

Nach Domänenbinning und HDX-Epitopkartierung wurden das ungefähre Epitop und die Bindungsstelle vieler monomerer VHHs gegen das Spike-Protein bestimmt. Um die Länge des gewünschten Linkers zwischen zwei VHHs zu berechnen, wurde in MOE 2020.09 (Chemical Computing Group) der Abstand zwischen der Mitte des bekannten Epitops sowohl im offenen als auch im geschlossenen Zustand des Spike-Proteins gemessen. Um Fälle zu berücksichtigen, in denen der kürzeste Abstand zwischen zwei Stellen zu einer Kollision führen würde, und um die unbekannte Bindungsorientierung des VHH in Bezug auf das Spike-Protein (wo sich der Terminus befinden würde) zu berücksichtigen, wurde ein zusätzlicher Pufferabstand hinzugefügt Erstmessung. Unter der Annahme, dass eine Aminosäure in einer ausgedehnten Konformation 3,5–4,0 Angström zurücklegen kann, wurde die gemessene Distanz dann in eine Mindestanzahl an Aminosäuren umgerechnet, die zur Überbrückung einer solchen Distanz erforderlich wäre. Die resultierende Anzahl an Aminosäuren wurde dann weiter in die minimale Anzahl an Linker-Untereinheiten umgewandelt, die die beiden Stellen verbinden konnten.

Atomkoordinaten und Strukturfaktoren für die beschriebene Kristallstruktur wurden bei der Proteindatenbank unter dem Zugangscode 8SK5 hinterlegt.

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Referenzen herunterladen

Die Autoren danken Scott Cosmi, ehemals Eurofins Lancaster Laboratories Professional Scientific Service, Lancaster, PA, für seine Arbeit bei der Reinigung der Antigenproteine, Eberhard Durr (Infectious Disease and Vaccine Discovery, Merck & Co) für die Charakterisierung rekombinanter Proteine ​​und Courtney Cohen (United States Army Medical Research Institute of Infectious Diseases/USAMRIID) für ihre Unterstützung bei den authentischen Virusneutralisationstests. Die Autoren möchten außerdem Capralogics, Inc. für ihre Arbeit bei der Pflege und Immunisierung der für die VHH-Erzeugung verwendeten Lamas danken. Darüber hinaus möchten die Autoren Kalpit Vora, Jill Chrencik, Mas Handa und Ilker Donmez für die interne Durchsicht des Manuskripts danken. Die Autoren widmen dieses Papier im Gedenken an David Tellers, der nicht nur als Mentor für eine Reihe von Autoren fungierte, sondern zu Beginn dieser Arbeit auch nachdenkliche Diskussionen und wichtige Anleitungen lieferte.

Scott A. Hollingsworth

Aktuelle Adresse: Molecular Structure and Design, Bristol-Myers Squibb Research and Development, 700 Bay Road, Redwood City, CA, 94063, USA

Laura J. Kingsley

Aktuelle Adresse: Boehringer Ingelheim, 900 Ridgebury Rd, Ridgefield, CT, 06877, USA

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Scott A. Hollingsworth und Cameron L. Noland.

Computational and Structural Chemistry, Merck & Co., Inc., 213 East Grand Ave., South San Francisco, CA, 94080, USA

Scott A. Hollingsworth, Cameron L. Noland, Haihong Zhou, Michael Eddins, Todd Mayhood, Jacob Gomez-Llorente, Andrea Patridge und Alan C. Cheng

Discovery Biologics, Merck & Co., Inc., 213 East Grand Ave., South San Francisco, CA, 94080, USA

Karin Vroom, Anasuya Saha, Miranda Sam, Qinshan Gao, David U. Grandy, Sujata Singh, Xiaohong Shirley Ma, Daniel Malashock, Karthik Sathiyamoorthy, Fahimeh Raoufi, Yinyan Tang, Shi-Juan Chen, Marc Bailly, Laura J. Kingsley, Bernhard H. Geierstanger, Daniel M. Gorman & Kalyan Pande

Infectious Disease and Vaccine Discovery, Merck & Co., Inc., 770 Sumneytown Pike, West Point, PA, 19486, USA

Zhiyun Wen, Christopher Warren, Jennifer Galli, Gwenny Go und Lan Zhang

Data Science and Informatics, Merck & Co., Inc., 126 E. Lincoln Ave., Rahway, NJ, 07065, USA

Arthur Friedman

NovaBioAssays, LLC, 52 Dragon Ct, Woburn, MA, 01801, USA

Chengjie Ji

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SAH, BHG, DMG, LZ und KP haben die Forschung konzipiert. CLN, KV, AS, MS, QG, HZ, DUG, SS, ZW, CW, XSM, DM, JG, GG, ME, TM, KS, FR, YG-L., AP, YT, S.-JC, MB und CJ generierten Reagenzien und führten die Experimente durch. SAH, CLN, KV, CW, AF, LJK, AC, LZ und KP führten Analysen durch. Alle Autoren haben zum Verfassen und zur Überprüfung des Artikels beigetragen.

Korrespondenz mit Lan Zhang oder Kalyan Pande.

Alle Autoren außer Chengjie Ji sind aktuelle oder ehemalige Mitarbeiter von Merck Sharp & Dohme Corp., einer Tochtergesellschaft von Merck & Co., Inc., Rahway, NJ, USA. Chengjie Ji ist Mitarbeiter von NovaBioAssays, LLC, Woburn, MA, USA. Eine Untergruppe der Autoren (SAH, KV, AS, DUG, BHG, DMG, LZ und KP) ist als Erfinder in einem Patent aufgeführt, das diese Arbeit von Merck Sharp & Dohme Corp. umgibt.

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Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Hollingsworth, SA, Noland, CL, Vroom, K. et al. Entdeckung und Multimerisierung kreuzreaktiver Einzeldomänen-Antikörper gegen SARS-ähnliche Viren zur Steigerung der Wirksamkeit und Bekämpfung neu auftretender SARS-CoV-2-Varianten. Sci Rep 13, 13668 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-40919-7

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Eingegangen: 19. April 2023

Angenommen: 18. August 2023

Veröffentlicht: 22. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-40919-7

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