Eine verminderte Adhäsion am Endothel führt bei Patienten mit hereditärem Angioödem zu einer erhöhten Anzahl neutrophiler Granulozyten

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 13366 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Da viele Aspekte des hereditären Angioödems (HAE) aufgrund eines C1-Inhibitor (C1-INH)-Mangels (C1-INH-HAE) nicht allein mit einem erhöhten Bradykininspiegel erklärt werden können, wurde kürzlich klar, dass auch andere Faktoren eine wichtige Rolle spielen die Pathogenese. Einer dieser Faktoren könnte eine erhöhte Anzahl neutrophiler Granulozyten (NG) sein, die mit einer erhöhten NG-Aktivierung bei C1-INH-HAE-Patienten verbunden sind; Ihre Herkunft ist jedoch bislang nicht geklärt. Hier wollten wir untersuchen, ob der Überschuss an NGs auf eine gestörte Reifung, ein voreingenommenes zirkulierendes/marginiertes Poolgleichgewicht oder eine verminderte Elimination zurückzuführen ist. Wir haben 20 anfallfreie C1-INH-HAE-Patienten zusammen mit 21 gesunden Kontrollpersonen aufgenommen und Blutproben entnommen. Wir verglichen Zelloberflächenreifungsmarker, Adhäsionsmoleküle, Zytokinrezeptoren und die Ca2+-Mobilisierung von NG mittels Durchflusszytometrie, Aktivierungsmarker mittels ELISA und NG/Endothelzelladhäsion mittels automatisiertem Pipettiersystem. Zelloberflächenmarker zeigten eine normale Reifung der NGs bei C1-INH-HAE-Patienten. Die Adhäsion von NGs an mit Lipopolysaccharid oder Phorbol-12-Myristat-13-Acetat vorbehandelten Endothelzellen war in Proben von C1-INH-HAE-Patienten deutlich schwächer und Bradykinin hatte keinen Einfluss auf die Adhäsion. NGs von C1-INH-HAE-Patienten befanden sich bei der Beurteilung durch lösliche Aktivierungsmarker ohne Stimulation in einem aktivierten Zustand. Unsere Daten belegen, dass die Reifung von NGs bei C1-INH-HAE-Patienten normal ist, wohingegen die Adhäsionseigenschaften von vom Patienten stammenden NGs am Endothel im Vergleich zu denen von gesunden Kontrollpersonen verringert sind, was auf eine Verzerrung zwischen den zirkulierenden und marginierten NGs-Pools in hindeutet Patienten. Bradykinin ist möglicherweise nicht für die verminderten Adhäsionseigenschaften von NGs verantwortlich.

Das hereditäre Angioödem (HAE), das auf einen C1-Inhibitor (C1-INH)-Mangel (C1-INH-HAE) zurückzuführen ist, eine Art von Bradykinin (BK)-vermitteltem Angioödem, ist eine seltene autosomal-dominant vererbte Erkrankung, die durch intermittierende, unvorhersehbare Schwellungen der Unterhaut gekennzeichnet ist und/oder submuköses Gewebe. Verschiedene Mutationen im SERPING1-Gen führen zu einer verminderten C1-INH-Produktion oder einem dysfunktionalen Protein1.

C1-INH spielt eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Gefäßpermeabilität und Entzündung. Das Gefäßendothel spielt eine wichtige Rolle bei der Pathogenese von C1-INH-HAE. C1-INH hemmt mehrere Plasma-Serinproteasen im klassischen und Lektin-Komplement-Weg, in der intrinsischen Gerinnung (Kontaktsystem), im fibrinolytischen Weg und im Kinin-Kallikrein-Weg2. Diese Plasmaenzymsysteme werden bei C1-INH-Mangel aktiviert und eine Reihe von Substanzen freigesetzt, die zusammen die Gefäßpermeabilität durch Extravasation von Plasma in Gewebe erhöhen. BK, das im Kinin-Kallikrein-System (KKS) erzeugt wird, ist der wichtigste vasoaktive Mediator3. Biochemische Prozesse, die im Plasma ablaufen, sind gut untersucht. Über die Rolle von Endothelzellen (ECs) und zellulären Elementen im Blut während der Pathogenese von C1-INH-HAE liegen nur begrenzte Daten vor, teilweise weil zur Untersuchung dieser Zelltypen spezifische In-vitro-Versuchssysteme erforderlich wären.

Zuvor stellte unsere Forschungsgruppe fest, dass die Anzahl der weißen Blutkörperchen (WBC) (1,58-fach) und insbesondere die Anzahl der neutrophilen Granulozyten (NG) (1,95-fach) deutlich höher war als aufgrund der alleinigen Hämokonzentration, berechnet aus der Differenz der roten Blutkörperchen, zu erwarten war4. Wir untersuchten dieses Phänomen ebenfalls detaillierter und stellten fest, dass C1-INH-HAE-Patienten auch im symptomfreien Zustand höhere NG-Werte aufwiesen als gesunde Kontrollpersonen. Darüber hinaus zeigten Messungen von Myeloperoxidase (MPO) und neutrophiler Elastase (ELA2), dass NGs bei C1-INH-HAE-Patienten im symptomfreien Zustand stärker aktiviert waren als bei gesunden Kontrollpersonen. Die Aktivierung von NGs war in Prodromal- und Angriffszuständen sogar noch signifikanter5,6.

NGs sind die wichtigste Leukozytenpopulation im Blut. Ihre Hauptfunktion ist die schnelle und effektive Phagozytose extrazellulärer Krankheitserreger, hauptsächlich Bakterien und Pilze, und die anschließende Zerstörung von Mikroben. Erhöhte NG-Werte können bei mehreren Krankheiten beobachtet werden; Allerdings sind nur wenige pathophysiologische Prozesse direkt für die Neutrophilie verantwortlich. Erstens verlassen mehr NGs das Knochenmark bei übermäßiger Granulopoese; In diesem Fall können jedoch auch neutrophile Vorläufer im Kreislauf gefunden werden, die durch Kernmorphologie (dh Promyelozyten-, Myelozyten-, Metamyelozyten- und Bandformen) und Zelloberflächenreifungsmarker (CD11b, CD13, CD16 und CD66b) gekennzeichnet sind. Die NG-Zahl kann auch erhöht sein, wenn die eher kurze normale Halbwertszeit von Neutrophilen irgendwie verlängert wird (Defekt in der programmierten Zelltodmaschinerie oder ein Defekt im Zelltötungsmechanismus, der häufig mit dem Tod von Neutrophilen verbunden ist). Schließlich kann Neutrophilie durch eine verminderte Adhäsion an ECs verursacht werden, was zu weniger NGs im Gewebe und einer Adhäsion an Gefäßwänden führt.

Als Ausgangshypothese der aktuellen Studie (visualisiert in Abb. 1) haben wir alle oben genannten Möglichkeiten getestet. Unser Ziel war es, das Vorhandensein von NG-Vorläufern, die Expression von Adhäsionsmolekülen und Zytokinrezeptoren, die Produktion von NG-Effektormolekülen/-systemen wie MPO, extrazellulärer Neutrophilenfalle (NET), ELA2, Proteinase 3 (PRTN3) und reaktiven oxidativen Spezies zu untersuchen (ROS), intrazelluläre Ca2+-Mobilisierung als Reaktion auf N-Formylmethionyl-Leucyl-Phenylalanin (fMLP) und BK und der Vergleich der adhäsiven Eigenschaften mit ECs bei C1-INH-HAE-Patienten und gesunden Kontrollpersonen.

Zusammenfassung der Studie. (A) Hypothese der Studie. (B) Studiendesign mit Methoden. (erstellt mit BioRender.com).

Wir beobachteten einen Trend zu einem höheren Median der NG-Anzahl in C1-INH-HAE-Proben als in Kontrollproben (Median und Interquartilbereiche betrugen 2431 NGs/μl (1764,47; 2909,18) gegenüber 2002 NGs/μl (1756,12; 2522,92). mittels Durchflusszytometrie; der Unterschied war jedoch statistisch nicht signifikant (Mann-Whitney-Test p = 0,1035).

Um zu testen, ob Neutrophilie durch eine erhöhte Effluxrate aus dem Knochenmark verursacht wird, haben wir die NG-Reifungsmarker CD11b, CD13, CD16, CD33, CD66b, CD182 und CD184 mittels Durchflusszytometrie gemessen. Wir fanden keine signifikanten Unterschiede in der Expression dieser Marker zwischen gesunden Kontrollpersonen und C1-INH-HAE-Patienten (Ergänzungsabbildung 1 und Ergänzungstabelle 1).

NGs binden (nach Aufbereitung aus Blut) Annexin V, was auf ihre Anfälligkeit für Endozytose durch Makrophagen hinweist. Obwohl NGs von C1-INH-HAE-Patienten etwas weniger Annexin V banden als NGs von Kontrollpersonen (Mediane der Fluoreszenzintensität (MFI) und Interquartilbereiche: 18,5 [6,2–39,5] vs. 38,8 [9,3–60,7]), gab es keinen Unterschied statistisch signifikant (p = 0,1826, Mann-Whitney-Test) (Ergänzende Abbildung 1).

Wir haben auch das Muster der wichtigsten Adhäsionsmoleküle und Zytokinrezeptoren untersucht, die die Adhäsion von Neutrophilen/Endothelzellen oder Neutrophilen/Stromazellen regulieren. Wir fanden einen statistisch signifikanten, aber geringfügigen Unterschied in der Expression von CD61 (Ergänzungsabbildung 1 und Ergänzungstabelle 1, p = 0,0071).

NGs sind ein sehr empfindlicher Zelltyp, und die NG-Präparation kann die Funktionen von Neutrophilen leicht verändern. Eine schnelle Erythrozytendepletion von EDTA-antikoaguliertem Blut ohne mehrere Zentrifugationsschritte kann die Neutrophilenfunktionen besser erhalten als andere Methoden, die mehrere Zentrifugationsschritte umfassen. Um zu verifizieren, dass NGs ihre Funktion nach der Vorbereitung beibehielten, führten wir daher Ca2+-Mobilisierungsmessungen sowohl an RBC-abgereichertem Blut als auch an gereinigten NGs mittels Durchflusszytometrie bzw. Fluoreszenzplattenlesegerät durch. Da der mittels Durchflusszytometrie gemessene intrazelluläre Ca2+-Mobilisierungseffekt von fMLP dem in gereinigten NGs beobachteten Effekt, der mit einem Fluoreszenzplattenlesegerät gemessen wurde, sehr ähnlich war (Abb. 2A, B, C, D), schienen die gereinigten NG-Präparate funktionsfähig zu sein.

Messung der intrazellulären Ca2+-Mobilisierung aus Blut mit RBC-Mangel und aus isolierten NGs. Ca-Ionophor wurde als Positivkontrolle verwendet und das durch andere Wirkstoffe induzierte Fluoreszenzsignal wurde als Prozentsatz des durch Ca-Ionophor induzierten Fluoreszenzsignals ausgedrückt. Ein Aliquot von ACK-lysiertem Blut wurde mit 1 μM Fluo-4-AM markiert. Als nächstes wurden 300 μl Fluo-4-AM-markierte Zellsuspension mit einem CytoFlex-Zytofluorimeter gemessen, 30 μl 1 μM Ca-Ionophor oder 30 μl 1 μM fMLP wurden 20 s nach Beginn der Messung hinzugefügt und Daten gesammelt für 5 Min. (A) Die intrazelluläre Ca2+-Mobilisierung wurde mittels Durchflusszytometrie (Vollblut, Granulozytentor) gemessen und das Integral der Fläche unter der Kurve berechnet. (B) Maximale Signalintensitäten wurden aus intrazellulärer Ca2+-Mobilisierungsmessung mit Durchflusszytometrie (Vollblut, Granulozytentor) berechnet. Mit Fluo-4-AM gefärbte NGs in einer Konzentration von 2 × 105 Zellen/Well wurden in eine schwarze V-förmige Bodenplatte mit 96 Wells ausgesät. Wir verwendeten 0,1 μM fMLP, 1 μM Ca-Ionophor (Calcimycin), 20 μM und 2 μM BK in HBSS als Behandlungen für 3-minütige kinetische Messungen in drei Parallelen. (C) Die intrazelluläre Ca2+-Mobilisierung wurde mit einem Mikroplatten-Lesegerät (isolierte neutrophile Granulozyten) gemessen und das Integral der Fläche unter der Kurve berechnet (3 Parallelen/Proband). (D) Maximale Signalintensitäten wurden aus intrazellulärer Ca2+-Mobilisierungsmessung mit einem Mikroplatten-Lesegerät (isolierte neutrophile Granulozyten, 3 Parallelen/Subjekt) berechnet. NGs von Patienten werden durch rote Punkte angezeigt; NGs gesunder Kontrollen werden durch blaue Punkte angezeigt. BK= Bradykinin; fMLP= N-Formylmethionylleucylphenylalanin. Für die statistische Analyse verwendeten wir den Mann-Whitney-Test (A, B) und die Zwei-Wege-ANOVA (C, D).

Nachdem wir die Funktion gereinigter NGs validiert hatten, verwendeten wir einen Fluoreszenzplattenleser, um die Ca2+-Mobilisierung in isolierten NGs nachzuweisen. fMLP induzierte eine ähnlich hohe Ca2+-Mobilisierung (normalisiert auf die Reaktion von Ca-Ionophor (Calcimycin), 1 μM) in NGs von Patienten und Kontrollpersonen. BK in einer Konzentration von 20 μM induzierte in beiden Studiengruppen eine signifikante (Behandlungen p < 0,0001), aber moderatere Ca2+-Mobilisierung als in fMLP (Abb. 2C, D), es gab jedoch keinen Unterschied in der Ca2+-Mobilisierung zwischen NGs von Patienten und Kontrollen .

Wir untersuchten den grundlegenden Aktivierungszustand und die Aktivierbarkeit von NGs von Patienten und Kontrollpersonen. Wir haben Aktivierungsmarker von NGs in Zellüberständen gemessen und festgestellt, dass NGs von Patienten im Vergleich zu NGs von Kontrollen signifikant höhere MPO-, ELA2- und NET-Werte produzierten (Abb. 3A, B, C, D, Kontrollen vs. Patienten p = 0,0004, p = 0,0125). , p = 0,0027). Unabhängig von ihrer Herkunft produzierten die Zellen während der 24-stündigen Behandlung signifikant höhere Mengen an MPO, ELA2 und NET als während der 4-stündigen Behandlung (4 Stunden vs. 24 Stunden, jeweils p < 0,0001, p < 0,0001, p < 0,0001). Wir haben auch die ROS-Produktion von NGs gemessen. Obwohl die unterschiedlichen Reize zu einer recht unterschiedlichen ROS-Produktion führten (d. h. erhöht durch Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA), während sie durch BK verringert wurde), stellten wir fest, dass NGs von Patienten mehr ROS produzierten als NGs von Kontrollen, entweder in Gegenwart oder Abwesenheit einer Behandlung (Abb. 3E, Kontrollen vs. Patienten p = 0,0265).

Aktivierungszustand und Aktivierbarkeit neutrophiler Granulozyten, die aus Patienten und gesunden Kontrollpersonen isoliert wurden. Spiegel von (A) Myeloperoxidase (MPO), (B) extrazellulärer Neutrophilenfalle (NET), (C) Proteinase 3 (PRTN3) und (D) Neutrophilen-Elastase (ELA2), produziert durch isolierte Neutrophile, (E) ROS-Produktion durch Neutrophile Granulozyten wurden gemessen. Für die Panels A, B, C und D wurden 5 × 105 NGs/Well in U-förmige Bodenplatten mit 96 Wells ausgesät. Die Zellen wurden mit 100 ng/ml LPS, 50 μM HIS, 2 μM und 20 μM BK oder 100 nM PMA in 200 μl RPMI-Medium behandelt. Die Zellen wurden 4 oder 24 Stunden lang bei 37 °C in einem CO2-Inkubator inkubiert. Nach der Inkubation wurde der Überstand gesammelt und 10 Minuten lang bei 10.000 g zentrifugiert, um Zelltrümmer abzusetzen. Der gesammelte Überstand wurde aliquotiert und bis zur Verwendung bei –80 °C gelagert. Für Panel E wurden 0,5 × 105 NGs/Well in eine schwarze V-förmige Bodenplatte mit 96 Wells gesät. Zur Behandlung verwendeten wir 100 nM PMA, 20 μM und 2 μM BK sowie 100 nM PMA + 20 μM BK, zusammen gelöst in HBSS. Als Substrat verwendeten wir 50 μM Amplex Ultra Red (AUR) + 0,2 U/ml Meerrettichperoxidase/Vertiefung in einer 25-minütigen kinetischen Messung in zwei Parallelen. Die Steigung der kinetischen Kurve (berechnet mit GraphPad Prism v9.1.2 durch lineare Regression) war proportional zum von NGs produzierten H2O2. NGs von Patienten werden durch rote Punkte angezeigt; NGs gesunder Kontrollen werden durch blaue Punkte angezeigt. C = Kontrolle, LPS = Lipopolysaccharid, HIS = Histamin, BK = Bradykinin, PMA = Phorbol-12-myristat-13-acetat. Für die statistische Analyse verwendeten wir eine Drei-Wege-ANOVA (A, B, C, D, E).

Wir untersuchten auch, ob wir einen Unterschied zwischen der Adhäsionseigenschaft von NGs von Patienten und Kontrollen feststellen konnten. Die Adhäsion wurde anhand von vier Variablen bewertet: (a) Herkunft der NGs: Kontrollen vs. Patienten, (b) Vorhandensein vs. Fehlen von C1-INH, (c) Behandlung von ECs vs. gleichzeitige Behandlung von ECs und NGs und (d ) verschiedene Aktivierungsstimuli, wir betrachten diese Ergebnisse als mittlere +/− SD-Werte in Abb. 4A. Der Einfachheit halber sind alle p-Werte in Abb. 4A, C dargestellt. Wir fanden heraus, dass sowohl Lipopolysaccharid (LPS) als auch PMA die NG-Adhäsion an ECs signifikant erhöhten, unabhängig von der Herkunft der Neutrophilen, dem Vorhandensein von C1-INH und dem behandelten Zelltyp. Interessanterweise erhöhten 20 μM BK die Adhäsion nur mäßig, wenn ECs und NGs 1 Stunde lang gleichzeitig behandelt wurden (Abb. 4A). Um die Adhäsionseigenschaften weiter zu analysieren, gruppierten wir die Adhäsionsdaten nach Reiz (Variable d) und führten eine Drei-Wege-ANOVA unter Verwendung der anderen drei Variablen (Variablen a, b und c) durch (Abb. 4B). Wir fanden heraus, dass NGs von Patienten bei allen Reizen weniger an ECs anhafteten als NGs von Kontrollen (Variable a). Es wurden mehr anhaftende NGs gefunden, wenn nur ECs 24 Stunden lang mit LPS behandelt wurden, als wenn ECs und NGs 1 Stunde lang gleichzeitig behandelt wurden (Variable c). Interessanterweise führte die Behandlung mit 20 μM BK zu mehr anhaftenden NGs, wenn ECs und NGs 1 Stunde lang gleichzeitig behandelt wurden, als wenn nur ECs 24 Stunden lang behandelt wurden (Variable c). Wir fanden eine signifikante Wechselwirkung zwischen dem Ursprung der NGs und dem Zielzelltyp der Behandlung nur für die LPS-Behandlung (Variable a ↔ c) (Abb. 4C). Überraschenderweise hatte die Anwesenheit oder Abwesenheit von C1-INH keinen Einfluss auf die Adhäsion zwischen ECs und NGs (Variable b).

Adhäsion neutrophiler Granulozyten an Endothelzellen. Wir haben menschliche Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVECs) in 96-Well-Platten bei 100 % Konfluenz gezüchtet. Wir verwendeten 100 ng/ml LPS, 50 μM Histamin, 20 μM oder 2 μM BK oder 100 nM PMA als Behandlung in Gegenwart oder Abwesenheit von C1-INH (200 μg/ml). Wir behandelten HUVECs 24 Stunden lang oder behandelten HUVECs und NGs 1 Stunde lang gleichzeitig. Wir haben 17 × 106 NGs mit Oregon-Grün-Farbstoff (2 μg/ml) markiert. Wir fügten der HUVEC-beschichteten Platte 0,5 × 106 mit Oregon Green gefärbte NGs/Well hinzu. Nach einstündiger gemeinsamer Inkubation der beiden Zelltypen wurden nicht anhaftende NGs mit einem automatischen Pipettiersystem (EpMotion 5070, automatisiertes Pipettiergerät von Eppendorf SE) entfernt und das verbleibende Fluoreszenzsignal der mit Oregon Green markierten NGs gemessen. (A) Vier Adhäsionsbewertungsbedingungen wurden entsprechend der Vorstimulation und dem Vorhandensein von C1-INH festgelegt. In jeder Gruppe wurde die Adhäsion als Reaktion auf verschiedene Reize auf die eigene unstimulierte Kontrolle normalisiert. Es werden relative mittlere (+/– SD) Adhäsionswerte von Patienten und Kontrollen dargestellt und es wurden statistische Einweg-ANOVA-Tests durchgeführt. (B) Um die Auswirkungen jedes Reizes entsprechend der Quelle der NGs (Patienten oder Kontrollen), der Anwesenheit oder Abwesenheit von C1-INH und den behandelten Zellen (d. h. ECs für 24 Stunden oder NGs und ECs, die 1 Stunde lang gemeinsam behandelt wurden) zu zeigen ) wurde ein Streudiagrammformat verwendet und eine Drei-Wege-ANOVA-Analyse durchgeführt. Patienten werden durch rote Punkte angezeigt; Gesunde Kontrollpersonen sind durch blaue Punkte gekennzeichnet. (C) Die Tabelle fasst die signifikanten p-Werte der Drei-Wege-ANOVA zusammen. C = Kontrolle, LPS = Lipopolysaccharid, HIS = Histamin, BK = Bradykinin, PMA = Phorbol-12-myristat-13-acetat.

Als vor einigen Jahrzehnten mit der Erforschung der Pathogenese von Angioödemen (insbesondere C1-INH-HAE) begonnen wurde, rückten C1-INH und BK in den Fokus der Forschung. Später stellte sich heraus, dass ECs die größte Bedeutung in der Pathogenese hatten7,8,9. Obwohl umfangreiche Untersuchungen viele Details zu dieser Krankheit enthüllten, blieben einige wichtige Fragen noch unbeantwortet, wie zum Beispiel die erhöhte NG-Anzahl und der aktivierte NG-Status bei C1-INH-HAE-Patienten.

In der aktuellen Studie beobachteten wir einen Trend zu erhöhten Neutrophilenzahlen bei C1-INH-HAE-Patienten, ähnlich unseren vorherigen Ergebnissen4,5,6; Der Unterschied war jedoch statistisch nicht signifikant. Ein möglicher Grund für diese Diskrepanz ist, dass wir die NG-Zählung nach einem mehrstufigen Neutrophilen-Isolierungsprotokoll durchgeführt haben. Dieser Prozess verursachte eine erhebliche Abweichung in der gemessenen NG-Anzahl. Der zweite Grund ist die geringe Stichprobengröße. In unserer aktuellen Studie haben wir umfangreiche In-vitro-Tests durchgeführt, die es uns ermöglichten, nur eine begrenzte Anzahl von Patienten und Kontrollen einzubeziehen, was die Aussagekraft der Statistiken verringerte.

Tak et al.10 und Summers et al.11 fassten mehrere unterschiedliche pathophysiologische Prozesse zusammen, die erhöhten NG-Zahlen zugrunde liegen können. Erstens könnten hohe NG-Zahlen die Folge einer erhöhten Rate der Neutrophilenbildung im Knochenmark und/oder der erhöhten Mobilisierung von Neutrophilen aus dem Knochenmark sein. Unsere auf Durchflusszytometrie basierenden Ergebnisse zeigten, dass die Reifung der Neutrophilen bei C1-INH-HAE-Patienten normal war.

Die Kreislaufhalbwertszeit und die Clearance von NGs aus zirkulierenden und marginierten Pools können sich ebenfalls auf die NG-Zahl auswirken. Seneszierende NGs werden leicht von Makrophagen in der Milz und der Leber aufgenommen, wobei CXCR4 und P-Selectin das regulierte Homing und die durch Phosphatidylserin induzierte Phagozytose über Annexin V Schlüsselkomponenten sind11. Die CXCR4- und P-Selectin-Expression sowie die Annexin V-Bindungskapazität waren in NGs, die aus C1-INH-HAE-Patienten und gesunden Kontrollpersonen isoliert wurden, ähnlich; Darüber hinaus gab es keinen Unterschied im spontanen Zelltod, wie durch den Einbau von 7AAD ermittelt wurde, was darauf hindeutet, dass die Clearance von NGs bei C1-INH-HAE-Patienten intakt zu sein scheint.

Obwohl der marginierte Pool an NGs fast 50 % der intravaskulären NGs11 ausmachen kann, ist es nicht einfach, diesen Anteil zu untersuchen. Wir fanden keine Unterschiede zwischen der Expression von Adhäsionsmolekülen und Chemokinrezeptoren auf den NGs von C1-INH-HAE-Patienten im Vergleich zu ihrer Expression auf den NGs gesunder Kontrollpersonen; Die Expression von Partnerrezeptoren/Liganden durch ECs wurde jedoch sicherlich nicht bewertet.

Als wir den Aktivierungsstatus von NGs in Abwesenheit jeglicher Reize untersuchten, stellten wir fest, dass NGs von Patienten stärker aktiviert waren als die von Kontrollpersonen, was vollständig mit unseren früheren Studien übereinstimmte5,6. Ehrenfeld et al.12 untersuchten die Wirkung von Kininen auf NGs während einer Entzündung und fanden heraus, dass die Stimulation des BK-Rezeptors B1 eine schnelle Aktivierung der Mitogen-aktivierten Proteinkinasen ERK1/2 und p38 (MAPKs) verursacht, was zur Exozytose der NG-Aktivierung führt Marker (z. B. MPO). Interessanterweise hatte die Stimulation mit BK im Gegensatz zu den obigen Zitaten in unserer Studie keine Wirkung oder hemmte sogar die NG-Aktivierung, obwohl 20 µM BK eine erwartete intrazelluläre Ca2+-Mobilisierung induzierten. In einer aktuellen Studie haben wir erhöhte Kallikrein/C1-INH-Komplexe bei C1-INH-HAE-Patienten (während beschwerdefreier Zeiträume) im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen und auch zu Beginn von HAE-Anfällen (kinetische Nachbeobachtungszeit) beschrieben13. Es ist auch gut belegt, dass die Aktivierung von KKS auf der Oberfläche von NGs und NET5,14,15 erfolgen kann. Unter Berücksichtigung der Wirkung von BK- und KKS-Enzymen auf NGs und der Wirkung der NG-Aktivität auf KKS können wir nicht entscheiden, ob NGs oder ihre NET-Produkte die KKS-Aktivierung bei HAE-Angriffen induzieren oder umgekehrt die Aktivierung von KKS NGs anzieht und aktiviert, sondern diese Die Ergebnisse deuten auf eine Verstärkungsschleife zwischen der Aktivierung von NGs und KKS hin. Die Hintergründe dieser herausfordernden Wechselwirkung erfordern umfangreiche weitere Untersuchungen.

Wir fanden sehr ähnliche Ergebnisse, als wir die Adhäsionseigenschaften von NGs an ECs mit unserem neu entwickelten Adhäsionstest testeten: Interessanterweise hatte BK keinen oder nur einen vernachlässigbaren Einfluss auf die NG-Adhäsion an ECs.

Im Gegensatz zu dieser geringen Wirkung von BK auf die Zelladhäsion hafteten unstimulierte NGs von Patienten weniger an der Oberfläche von ECs als solche von Kontrollpersonen. Als wir LPS- oder PMA-Stimuli auf ECs verwendeten, war der Adhäsionsunterschied zwischen den oberflächengebundenen NGs von C1-INH-HAE-Patienten und den Kontrollen viel auffälliger. Darüber hinaus wurde der Unterschied in den Adhäsionseigenschaften nicht durch eine von NGs freigesetzte C1-INH-hemmbare Serinprotease oder das C1-INH selbst verursacht, da C1-INH keinen Einfluss auf die Adhäsion hatte. Unsere Ergebnisse stehen im Gegensatz zu den Ergebnissen von Cai et al.16, die in einem In-vitro-System herausfanden, dass C1-INH E- und P-Selectine auf der HUVEC-Oberfläche binden und durch diese Wechselwirkung die Leukozytenadhäsion verhindern kann. Der unterschiedliche Studienaufbau könnte diesen Widerspruch erklären, z. B. Cai et al. verwendeten HBSS-Puffer während der Inkubation, während wir MCDB-Medien mit FBS-Gehalt verwendeten.

Angesichts der Tatsache, dass wir in unseren Experimenten zur funktionellen Adhäsion keinen Unterschied in der Adhäsionsstärke festgestellt haben, wenn wir ECs allein oder wenn wir ECs und NGs gleichzeitig behandelt haben, und dass das Muster der Oberflächenadhäsionsmoleküle von NGs bei C1-INH-HAE-Patienten sehr ähnlich war und bei Kontrollen können wir davon ausgehen, dass die Behandlungen hauptsächlich die Adhäsionseigenschaften von ECs und nicht die von NGs beeinflussten. Dies legt nahe, dass entweder ECs oder das Plasma von C1-INH-HAE-Patienten einen Faktor tragen, der die EC/NG-Adhäsion verändert. Ein Faktor könnte das lösliche E-Selectin (sE-Selectin) sein, ein abgespaltenes Adhäsionsmolekül von ECs. Die mögliche Rolle von sE-Selectin wird möglicherweise auch durch unsere früheren Erkenntnisse gestützt: Wir beschrieben erhöhte sE-Selectin-Konzentrationen im Plasma von C1-INH-HAE-Patienten17, die während Angriffen weiter erhöht waren18 und als Täuschungsmolekül für E-Selectin fungieren können. Selectin-Liganden. Die unterschiedliche Abdeckung von Adhäsionsmolekülen, die an der Anheftung von NGs an die Gefäßwand beteiligt sind, kann bei C1-INH-HAE-Patienten zu einem verzerrten NG-Verhältnis zwischen marginierten und frei zirkulierenden Pools führen. Diese Hypothese einer veränderten Adhäsion zwischen ECs und Neutrophilen wurde durch unsere früheren In-vitro-Adhäsionsexperimente weiter gestützt, bei denen die Adhäsion von dPLB-985-Zellen (differenzierte Neutrophilen-ähnliche Zellen) an ECs durch sE-Selectin vollständig gehemmt wurde. Darüber hinaus fanden Ruchaud-Sparagano et al.20 heraus, dass sE-Selectin die ROS-Produktion von NGs erhöhen kann, und wir fanden auch heraus, dass die ROS-Produktion bei NGs von Patienten im Vergleich zu denen von gesunden Kontrollpersonen erhöht war.

Unsere Studie weist mehrere Einschränkungen auf. Erstens ist die Stichprobengröße sehr klein (C1-INH-HAE ist eine seltene Erkrankung und die meisten Patienten nutzen mehrere prophylaktische Therapien), obwohl unsere Studienpopulation recht groß ist und hinsichtlich Alter und Geschlecht besser übereinstimmt als andere Studien im Feld C1-INH-HAE. Eine weitere Einschränkung besteht darin, dass unsere Studie im Zelladhäsionsteil der Studie nur NGs, nicht jedoch ECs untersuchte. Dies liegt daran, dass es keine Methode gibt, Endothelzellen von C1-INH-HAE-Patienten zu gewinnen. Darüber hinaus können wir aufgrund des retrospektiven Charakters unserer Studie einige zusätzliche Kontrollen und tiefergehende Analysen (wie die ACE-Expression von Neutrophilen oder die Verwendung von Icatibant, einem starken BK-Rezeptor-2-Antagonisten) nicht einbeziehen.

Unsere Ergebnisse legen zusammen mit dem Fehlen von Hinweisen auf eine chronische Entzündung bei den C1-INH-HAE-Patienten21 nahe, dass die hohen NG-Zahlen bei diesen Patienten möglicherweise durch eine gestörte Adhäsion an ECs verursacht werden, die das Verhältnis zwischen marginierten und zirkulierenden Pools verzerrt, während nur a Eine leichte Aktivierung zirkulierender NGs erfolgt als Folge aktiverer Plasma-Serinproteasen und/oder aufgrund der erhöhten löslichen E-Selectin-Spiegel. Es ist weitgehend unbekannt, ob diese milde Aktivierung von NGs positive oder negative Folgen für die C1-INH-HAE-Patienten hat, aber es lohnt sich, weitere Untersuchungen durchzuführen.

Zwanzig C1-INH-HAE-Patienten, die im ungarischen Angioödem-Zentrum Reference and Excellence (Budapest, Ungarn) behandelt und nachuntersucht wurden, sowie 21 alters- und geschlechtsangepasste gesunde Kontrollpersonen wurden in die Studie aufgenommen. Die Diagnose von C1-INH-HAE-Patienten basierte auf der Familienanamnese, der Krankengeschichte des Patienten, einer körperlichen Untersuchung und zwei vollständigen Komplementlabortests [gesamte klassische Komplementkaskade, C3-, C4-, C1-INH-Konzentrationsniveau und funktionelle C1-INH-Aktivität]. Anti-C1-INH-Antikörper (IgA, M, G)] wurden im Abstand von 1–2 Monaten durchgeführt. In allen Fällen wurde eine genetische Analyse des SERPING1-Gens durchgeführt. Vollblutproben von Kontrollpersonen und anfallfreien C1-INH-HAE-Patienten wurden in EDTA-haltigen Röhrchen (3 ml) und dazwischen 5 ml PBS + 100 μl Heparin-Natrium (25.000 IE) enthaltenden Zentrifugenröhrchen (35–45 ml) gesammelt 01.09.2020 und 30.06.2021. C1-INH-HAE-Patienten hatten innerhalb von 5 Tagen vor der Probenentnahme weder C1-INH-Konzentrat noch Icatibant eingenommen. Gesunde Kontrollpersonen nahmen keine Medikamente ein und befanden sich nicht in ärztlicher Behandlung. Alle Probanden gaben eine Einverständniserklärung gemäß der Deklaration von Helsinki. Das Studienprotokoll wurde von der ungarischen Regulierungsbehörde genehmigt (BPR/021/03928–8/2014). Detaillierte demografische Daten von Patienten und Kontrollen sind in Tabelle 1 zusammengefasst.

Wir haben 35–45 ml Blut in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen mit 5 ml PBS + 100 μl Heparin-Natrium (25.000 IE) mit einer 18G-Nadel ohne Verwendung von Vakuum gesammelt. Wir fügten 5 ml 6 % Dextran (Dextran von Leuconostoc spp. Mr 450.000–650.000, Sigma-Merck) hinzu und vermischten es mit Blut. Nach 15–30-minütiger Sedimentation wurde die Plasmafraktion in ein neues Zentrifugenröhrchen pipettiert und 5 Minuten bei 1500 U/min bei RT zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt und 5 ml HBSS-Prep (HBSS ohne Ca2+ und Mg2+ ergänzt mit 20 mM HEPES) wurden zugegeben und die Zellen wurden vorsichtig gemischt. Die Zellen wurden auf 5 ml Ficoll (GE 17-1440-02, Merck KGaA, Deutschland) geschichtet und dann 30 Minuten lang bei 2500 U/min bei RT zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt, 10 ml HBSS-Prep wurden zugegeben, dann wurden die Zellen zentrifugiert (5 min, RT, 1500 U/min). Nach dem Absaugen des Überstands wurden 5 ml 0,2 % NaCl für die Lyse der roten Blutkörperchen (RBC) für 60 s zugegeben, dann wurden 5 ml 1,6 % NaCl zugegeben, um die Lyse zu stoppen. Die Zellen wurden zentrifugiert (5 min, RT, 1500 U/min). Der Überstand wurde abgesaugt und die Zellen wurden zweimal mit 10 ml HBSS-Prep gewaschen. Nach der zweiten Zentrifugation wurde 1 ml HBSS-Prep zugegeben und die Zellen gezählt. Wir haben den HBSS-Prep-Puffer unmittelbar vor der Verwendung der Zellen in verschiedenen Experimenten gewechselt.

Wir verwendeten 0,5 × 105 NGs/Well in einer schwarzen V-förmigen Bodenplatte mit 96 Wells. Als Behandlung verwendeten wir 100 nM PMA, 20 μM und 2 μM BK sowie 100 nM PMA + 20 μM BK, zusammen gelöst in HBSS. Als Substrat verwendeten wir 50 μM Amplex Ultra Red (AUR) + 0,2 U/ml Meerrettichperoxidase/Well in einer 25-minütigen kinetischen Messung in zwei Parallelen. Wir haben die Steigung für jede Vertiefung in GraphPad Prism v9.1.2 (GraphPad Software Inc.) durch lineare Regression berechnet, die an die kinetischen Messdaten angepasst wurde, und die berechnete Steigung als Wert der ROS-Produktion verwendet.

Wir verwendeten 2 × 105 NGs/Well, gefärbt mit Fluo-4-AM (F14217 Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, 1:500), in einer schwarzen V-förmigen Bodenplatte mit 96 Wells. Wir verwendeten 0,1 μM fMLP, 1 μM Ca-Ionophor (Calcimycin, Calciumionophor A23187 Hemimagnesiumsalz, C9400, Sigma-Aldrich), 20 μM und 2 μM BK in HBSS als Behandlungen in der 3-minütigen kinetischen Messung in drei Parallelen. Ca-Ionophor wurde als Positivkontrolle verwendet und durch andere Wirkstoffe verursachte Fluoreszenzsignale wurden als Prozentsatz des durch Ca-Ionophor verursachten Fluoreszenzsignals dargestellt.

Wir haben menschliche Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVECs) in 96-Well-Platten bei 100 % Konfluenz (als Modell der Gefäßwand) gezüchtet. Wir verwendeten 100 ng/ml LPS, 50 μM Histamin (HIS), 20 μM oder 2 μM BK oder 100 nM PMA als Behandlung in Gegenwart oder Abwesenheit von C1-INH (200 μM/ml). Wir behandelten HUVECs 24 Stunden lang oder behandelten HUVECs und NGs 1 Stunde lang gleichzeitig. Wir haben 17 × 106 NGs-Zellen mit grünem Oregon-Farbstoff (CellTrace™ Oregon Green™ 488 Carboxy-DFFDA, SE, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, 1 mg/ml) in einer Verdünnung von 1:500 (HBSS-Prep) markiert und sie bei 4 °C inkubiert °C für 20 Min. Anschließend haben wir die Zellen 5 Minuten lang bei 1500 U/min zentrifugiert. Wir inkubierten die Zellen in 5 ml HBSS-Prep bei 4 °C für 20 Minuten, resuspendierten sie nach der Zentrifugation in 1 ml MCDB-Zellkulturmedium und zählten sie. Wir fügten der HUVEC-beschichteten Platte 0,5 × 106 mit Oregon Green gefärbte NGs/Well hinzu. Nach einstündiger gemeinsamer Inkubation der beiden Zelltypen wurden nicht anhaftende NGs mithilfe eines automatischen Pipettiersystems (EpMotion® 5070, automatisches Pipettiergerät von Eppendorf SE, das gleichmäßige Vakuumkräfte für jede Vertiefung bereitstellt) entfernt und das verbleibende Fluoreszenzsignal gemessen für mit Oregon Green gekennzeichnete NGs.

Wir haben 5 × 105 NGs/Well in U-förmige Bodenplatten mit 96 Wells ausgesät. Die Zellen wurden mit 100 ng/ml LPS, 50 μM HIS, 2 oder 20 μM BK oder 100 nM PMA in 200 μl RPMI-Medium behandelt. Die Zellen wurden 4 oder 24 Stunden lang bei 37 °C in einem CO2-Thermostat inkubiert. Nach der Inkubation wurde der Überstand gesammelt und 10 Minuten lang bei 10.000 g zentrifugiert, um Zelltrümmer abzusetzen. Der gesammelte Überstand wurde aliquotiert und bis zur Verwendung bei –80 °C gelagert.

Zur Bestimmung der Spiegel der Enzyme Myeloperoxidase (MPO), Neutrophilelastase (ELA2) und Proteinase 3 (PRTN3) verwendeten wir kommerziell erhältliche ELISA-KITs von R&D Systems (DY3174, DY9167-05 und DY6134-05) gemäß den Anweisungen des Herstellers . Um die extrazellulären Neutrophilenfallen (NETs) zu messen, verwendeten wir eine zuvor veröffentlichte hauseigene ELISA-Methode5.

Fluoreszenz- (ROS-, intrazelluläre Ca2+-Mobilisierungs- und Adhäsionsmessung) und OD-Messungen (ELISA) wurden mit einem Infinite® M1000 PRO-Mikroplattenlesegerät durchgeführt.

Mit EDTA antikoaguliertes Blut wurde mit Ammonium-Chlorid-Kalium (ACK)-Lysepuffer für rote Blutkörperchen im Dunkeln bei Raumtemperatur 10 Minuten lang lysiert. Nach der Zentrifugation wurden die Pellets mit PBS auf das ursprüngliche Blutvolumen gebracht und 50 μl Aliquots 20 Minuten lang mit Antikörpern markiert (Einzelheiten siehe Ergänzungstabelle 2), dann gewaschen und 100.000 Zellen mit einem CytoFlex®-Zytofluorimeter von Beckman Coulter gemessen . Ein zweites Aliquot von ACK-lysiertem Blut wurde 30 Minuten lang mit 1 μM Fluo-4-AM (ThermoFisher) markiert und 30 Minuten lang in HBSS äquilibriert. Als nächstes wurden 300 μl Fluo-4-AM-markierte Zellsuspension in einem CytoFlex®-Zytofluorimeter gemessen, 30 μl 1 μM Ca-Ionophor oder 30 μl 1 μM fMLP wurden 20 s nach Beginn der Messung hinzugefügt und die Daten wurden gesammelt für 5 Min. Ca-Ionophor wurde als Positivkontrolle verwendet und das durch andere Wirkstoffe induzierte Fluoreszenzsignal wurde als Prozentsatz des durch Ca-Ionophor induzierten Fluoreszenzsignals ausgedrückt.

Die Daten wurden mit der Software CytExpert 2.4 und Kaluza® C ausgewertet. Der Prozentsatz positiver und negativer Populationen und/oder mittlere Werte der Fluoreszenzintensität wurden zwischen gesunden Kontrollpersonen und der C1-INH-HAE-Population verglichen.

Die Ergebnisse der ELISA-Messungen wurden mit GraphPad Prism v9.1.2 (GraphPad Software Inc.) analysiert und interpretiert. Die statistische Analyse wurde unter Verwendung des D'Agostino & Pearson-Normalitätstests, der einfaktoriellen ANOVA, der zweifaktoriellen ANOVA, der dreifaktoriellen ANOVA und des Mann-Whitney-Tests zur ROS-Messung, der intrazellulären Ca2+-Mobilisierungsmessung mit einem Mikroplattenlesegerät und Aktivierungsmarkermessungen durchgeführt aus Zellüberstand und NG-Adhäsion zur EC-Messung.

Da die meisten Verteilungen nicht normal waren, verwendeten wir Medianwerte der Fluoreszenzintensität. Wir haben das Verhältnis der mittleren Fluoreszenzintensitätswerte für den gegebenen Marker und seine Isotypkontrolle berechnet. Wir haben diese Verhältnisse verwendet und sie (zwischen Kontrollen und HAE-Patienten) mit dem Student-t-Test bei Durchflusszytometriemessungen verglichen.

P < 0,05 wurde jeweils als statistisch signifikant angesehen.

Die während der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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