CRISPR-Screenings entschlüsseln die Signalwege von Krebszellen, die die Erkennung von γδ-T-Zellen auslösen

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γδ-T-Zellen sind wirksame Antikrebs-Effektoren mit dem Potenzial, Tumore umfassend anzugreifen, unabhängig von patientenspezifischen Neoantigenen oder dem Hintergrund menschlicher Leukozytenantigene1,2,3,4,5. γδ-T-Zellen können konservierte Zellstresssignale erkennen, die in transformierten Zellen vorherrschen2,3, obwohl die Mechanismen, die hinter der gezielten Ansteuerung gestresster Zielzellen stehen, noch kaum charakterisiert sind. Vγ9Vδ2-T-Zellen – die am häufigsten vorkommende Untergruppe menschlicher γδ-T-Zellen4 – erkennen einen Proteinkomplex, der Butyrophilin 2A1 (BTN2A1) und BTN3A1 (Ref. 6,7,8) enthält, ein weithin exprimiertes Zelloberflächenprotein, das durch Phosphoantigene aktiviert wird, die reichlich von produziert werden Tumorzellen. Hier haben wir genomweite CRISPR-Screenings in Zielkrebszellen kombiniert, um Wege zu identifizieren, die die Abtötung von γδ-T-Zellen und die BTN3A-Zelloberflächenexpression regulieren. Die Screenings zeigten eine bisher nicht erkannte mehrschichtige Regulierung der BTN3A-Häufigkeit auf der Zelloberfläche und die Auslösung von γδ-T-Zellen durch Transkription, posttranslationale Modifikationen und Membrantransport. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass verschiedene genetische Störungen und Inhibitoren, die die Stoffwechselwege in den Krebszellen, insbesondere ATP-produzierende Prozesse, stören, die BTN3A-Spiegel verändern. Diese Induktion von BTN3A und BTN2A1 während Stoffwechselkrisen hängt von der AMP-aktivierten Proteinkinase (AMPK) ab. Schließlich führte die Aktivierung von AMPK durch kleine Moleküle in einem Zelllinienmodell und in von Patienten stammenden Tumororganoiden zu einer erhöhten Expression des BTN2A1-BTN3A-Komplexes und einer erhöhten durch den Vγ9Vδ2-T-Zellrezeptor vermittelten Abtötung. Dieser AMPK-abhängige Mechanismus der durch metabolischen Stress induzierten Hochregulierung von Liganden vertieft unser Verständnis der γδ-T-Zell-Stressüberwachung und schlägt neue Wege zur Verbesserung der Antikrebsaktivität von γδ-T-Zellen vor.

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Sequenzierungsdatensätze für die beiden Screens und CUT&RUN sind im NCBI Gene Expression Omnibus-Repository verfügbar (Cokultur-Screen, GSE192828; BTN3A-Screen, GSE192827; CUT&RUN, GSE226931). Öffentlich verfügbare Paired-End-IRF1-ChIP-seq-Fastq-Dateien wurden von ENCODE68,69 heruntergeladen: IRF1 K562 IP Rep 1 (ENCFF031RWN, ENCFF031WIT), IRF1 K562 IP Rep 2 (ENCFF602NSL, ENCFF071PWE) und IRF1 K562 Input (ENCFF285JYI, ENCFF420KFM). Außerdem wurden für diese Studie öffentlich verfügbare TCGA-Daten verwendet (https://www.cancer.gov/tcga). Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Der zur Analyse des TCGA-Datensatzes verwendete Computercode wurde bei Zenodo hinterlegt (https://doi.org/10.5281/zenodo.8011891).

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Wir danken den Mitgliedern des Marson-Labors, I. Jain, S. Dodgson, S. Pyle, T. Tolpa und dem Gladstone Flow Cytometry Core für die Bereitstellung wertvoller Beiträge und technischer Fachkenntnisse. Wir danken auch B. Gewurz (Harvard Medical School) für die Bereitstellung von Daudi-Cas9-Zellen. MRM war ein Stipendiat des Cancer Research Institute (CRI) Irvington Fellow, der vom CRI unterstützt wurde, und wurde durch das Human Vaccines Project Michelson Prizes for Human Immunology and Vaccine Research unterstützt, das von der Michelson Medical Research Foundation finanziert wurde. JWF wurde durch ein NIH-Stipendium (Nr. R01HG008140) finanziert. AR wurde durch ein NIH-Ausbildungsstipendium (Nr. T32GM007281) unterstützt. MMA wird durch ein NSF GRFP-Stipendium (Nr. 2038436) unterstützt. MO wurde von der Astellas Foundation for Research on Metabolic Disorder, der Chugai Foundation for Innovative Drug Discovery Science und der Mochida Memorial Foundation for Medicine and Pharmaceutical Research unterstützt. KAT wurde durch das Gladstone PUMAS-Programm unterstützt, finanziert durch ein NIH-Stipendium (Nr. 5R25HL121037). JK und ZS wurden von Oncode-PACT und den Stipendiennummern der Dutch Cancer Society unterstützt. KWF 11393, 12586 und 13043. EJA wird durch ein NIH-Stipendium finanziert (Nr. R01AI155984). Das Marson-Labor hat Mittel vom CRI Lloyd J. Old STAR Grant, der Cancer League, dem Innovative Genomics Institute, der Simons Foundation und dem Parker Institute for Cancer Immunotherapy erhalten. Wir danken der Hubrecht Organoid Technology für die Bereitstellung patienteneigener Brustkrebs-Organoide und JML Roodhart (Abteilung für Medizinische Onkologie, Universitätsklinikum Utrecht, Universität Utrecht, Utrecht, Niederlande) für die Bereitstellung des patienteneigenen Darmkrebs-Organoids. Der Gladstone Flow Cytometry Core wird vom James B. Pendleton Charitable Trust unterstützt. Das Schema in Abb. 3a wurde aus der BioRender-Vorlage „Elektronentransportkette“ übernommen. Einige der hier gezeigten Ergebnisse basieren auf Daten des TCGA Research Network: https://www.cancer.gov/tcga.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Shane Vedova, Jacob W. Freimer

Gladstone-UCSF Institute of Genomic Immunology, San Francisco, CA, USA

Murad R. Mamedov, Shane Vedova, Jacob W. Freimer, Maya M. Arce, Mineto Ota, Peixin Amy Chen, Vinh Q. Nguyen, Kirsten A. Takeshima und Alexander Marson

Medizinische Fakultät, University of California, San Francisco, San Francisco, CA, USA

Murad R. Mamedov, Shane Vedova, Jacob W. Freimer, Maya M. Arce, Mineto Ota, Peixin Amy Chen und Alexander Marson

Abteilung für Genetik, Stanford University, Stanford, CA, USA

Jacob W. Freimer, Mineto Ota und Jonathan K. Pritchard

Abteilung für Datenwissenschaft, Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA

Avinash Das Sahu

Abteilung für Biostatistik, Harvard TH Chan School of Public Health, Boston, MA, USA

Avinash Das Sahu

UNM Comprehensive Cancer Center, University of New Mexico, Albuquerque, NM, USA

Avinash Das Sahu

Abteilung für Biochemie und Molekularbiologie, University of Chicago, Chicago, IL, USA

Amrita Ramesh und Erin J. Adams

Zentrum für translationale Immunologie, Universitätsklinikum Utrecht, Utrecht, Niederlande

Angelo D. Meringa, Jürgen Kuball & Zsolt Sebestyen

Institut für Datenwissenschaft und Biotechnologie, Gladstone Institutes, San Francisco, CA, USA

Kristina Hanspers

Abteilung für Chirurgie, University of California, San Francisco, San Francisco, CA, USA

Vinh Q. Nguyen

Diabetes Center, University of California, San Francisco, San Francisco, CA, USA

Vinh Q. Nguyen & Alexander Marson

UCSF CoLabs, University of California, San Francisco, San Francisco, CA, USA

Vinh Q. Nguyen

Princess-Máxima-Zentrum für pädiatrische Onkologie, Utrecht, Niederlande

Anne C. Rios

Oncode Institute, Utrecht, Niederlande

Anne C. Rios

Fachbereich Biologie, Stanford University, Stanford, CA, USA

Jonathan K. Pritchard

Abteilung für Hämatologie, Universitätsklinikum Utrecht, Utrecht, Niederlande

Jürgen Kuball

Ausschuss für Immunologie, University of Chicago, Chicago, IL, USA

Erin J. Adams

Abteilung für Mikrobiologie und Immunologie, University of California, San Francisco, San Francisco, CA, USA

Alexander Marson

Innovative Genomics Institute, University of California-Berkeley, Berkeley, CA, USA

Alexander Marson

UCSF Helen Diller Family Comprehensive Cancer Center, University of California, San Francisco, San Francisco, CA, USA

Alexander Marson

Parker Institute for Cancer Immunotherapy, University of California, San Francisco, San Francisco, CA, USA

Alexander Marson

Institut für Humangenetik, University of California, San Francisco, San Francisco, CA, USA

Alexander Marson

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MRM und AM haben die Studie entworfen. MRM, SV, AR, MMA, ADM, PAC, VQN und KAT führten Experimente durch und erzeugten wesentliche Reagenzien. JWF führte eine Computeranalyse und Datenvisualisierung durch. ADS und MO führten eine TCGA-Datenanalyse und -visualisierung durch. KH generierte eine Visualisierung der Signalweganreicherung. ACR half bei der Gewinnung patienteneigener Tumororganoide. EJA, JK, ZS und JKP halfen bei der Entwicklung von Assays und der Interpretation der Ergebnisse. MRM und AM haben das Manuskript unter Mitwirkung aller Autoren verfasst.

Korrespondenz mit Murad R. Mamedov oder Alexander Marson.

AM ist Mitbegründer von Arsenal Biosciences, Spotlight Therapeutics und Survey Genomics; ist Vorstandsmitglied bei Spotlight Therapeutics und Survey Genomics; ist Vorstandsbeobachter (und ehemaliges Vorstandsmitglied) bei Arsenal Biosciences; ist Mitglied der wissenschaftlichen Beiräte von Arsenal Biosciences, Spotlight Therapeutics, Survey Genomics, NewLimit, Amgen, Lightcast und Tenaya; besitzt Aktien von Arsenal Biosciences, Spotlight Therapeutics, NewLimit, Survey Genomics, PACT Pharma, Lightcast und Tenaya; und hat Honorare von Arsenal Biosciences, Spotlight Therapeutics, NewLimit, Survey Genomics, Tenaya, Lightcast, 23andMe, PACT Pharma, Juno Therapeutics, Trizell, Vertex, Merck, Amgen, Genentech, AlphaSights, Rupert Case Management, Bernstein und ALDA erhalten. AM ist Investor und informeller Berater von Offline Ventures und Kunde von EPIQ. JWF war Berater für NewLimit, ist Mitarbeiter von Genentech und hält Anteile an Roche. Das Marson-Labor erhielt Forschungsunterstützung von Juno Therapeutics, Epinomics, Sanofi, GlaxoSmithKline, Gilead und Anthem. JK ist Anteilseigner von Gadeta BVJK und ZS sind Erfinder von Patenten mit γδTCR-bezogenen Themen. AM und MRM sind Erfinder von Patentanmeldungen, die auf der Grundlage der hier beschriebenen Erkenntnisse eingereicht wurden.

Nature dankt Dmitry Gabrilovich, Thomas Herrmann und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

(a) Schematische Darstellung des Mevalonat-Weges, übernommen von WikiPathways. Phosphoantigene blau hervorgehoben. (b) Überleben von eGFP+ Daudi-Zellen, die zusammen mit primären Vγ9Vδ2-T-Zellen bei verschiedenen Effektor-zu-Ziel-Verhältnissen (E:T) mit oder ohne Zoledronat (ZOL) kultiviert wurden. Die Zellen wurden mithilfe der quantitativen Live-Cell-Bildgebung in Echtzeit (Incucyte) quantifiziert. Das Überleben wurde auf Daudi-Zellen normalisiert, die ohne T-Zellen kultiviert wurden. Mittelwert ± SD. n = 3 pro Bedingung. (c–e) Paarweise Vergleiche von log2 (Fold Change [FC]) der Screening-Ergebnisse zwischen den drei gesunden menschlichen PBMC-Spendern. (f) Anzahl der Gene, die in jedem negativ angereicherten KEGG-Gensatz enthalten sind, nach dem Herausfiltern von Genen, die nicht im Screen-Datensatz enthalten waren, FDR-Q-Werte und (g) Anzahl der Gene, die in zwei KEGG-Gensätzen gefunden wurden.

Quelldaten

(a) Heatmap der Hazard-Verhältnisse (natürlich logarithmisch transformiert), die mit der Co-Kultur-Screening-Gensignatur bei TCGA-Patienten für 33 Krebsarten verbunden sind (ein positives Log-Verhältnis weist auf eine schlechtere Prognose hin und ein negatives weist auf eine schützende Wirkung hin). Gensignatur). Die Gensignatur des Co-Kultur-Screenings wurde auf Mittelwert = 0, SD = 1 skaliert. Die Werte werden nur für Krebsarten mit signifikanter Überlebens- und Signaturassoziation bei Patiententumoren angezeigt, wie durch einen Wald-Test mit Benjamini-Hochberg-Mehrfachvergleichskorrektur (zwei- einseitig padj < 0,05). (b, d) Korrelation der Tumorgenexpression und des Überlebens in der Patientenkohorte mit niedriggradigem Gliom (LGG), (b) mit der gesamten Kohorte und (d) mit der Kohortenaufteilung gemäß TRGV9/TRDV2-Tumortranskripthäufigkeit. Patienten mit hoher und niedriger Expression jedes einzelnen Gens wurden über die 1040 Gene in der Co-Kultur-Screening-Signatur hinweg verglichen. Ein positiver Wald-Test-Z-Score zeigt eine positive Korrelation mit dem Überleben an, und ein negativer Z-Score zeigt eine negative Korrelation mit dem Überleben an. (c, e) Korrelation der vom KEGG-Signalweg abgeleiteten und vom Typ-I-Interferon-Antwortpfad abgeleiteten Signaturwerte und Überleben in der Patientenkohorte mit niedriggradigem Gliom (LGG), (c) mit der gesamten Kohorte und (e) mit der Kohortenaufteilung gemäß TRGV9/TRDV2-Tumortranskripthäufigkeit. Es wurden Patienten mit hohen und niedrigen Pathway-Signatur-Scores verglichen. (f, g) Überleben von (f) allen LGG-Patienten und (g) TRGV9/TRDV2-hohen oder TRGV9/TRDV2-niedrigen LGG-Patienten, aufgeteilt nach hoher und niedriger Expression der TCA-Zyklus-Signalwegsignatur. (h, i) Überleben von TRAC/TRBC-hoch/niedrig (h) LGG- und (i) BLCA-Patienten, aufgeteilt nach hoher und niedriger Expression der Co-Kultur-Screening-Gensignatur. (be) Die Signifikanz wurde durch einen Wald-Test (Cox-Regression) mit Bonferroni-Mehrfachvergleichskorrektur (zweiseitiges padj < 0,05) bestimmt. (fi) Log-Rank-Test (Kaplan-Meier-Überlebensanalyse), angepasst (padj) mit Benjamini-Hochberg-Mehrfachvergleichskorrektur. (c, z. B.) Die Signalwegsignaturniveaus wurden geschätzt, indem der Vergleich auf Gene beschränkt wurde, die sich zwischen der Co-Kultur-Screen-Treffersignatur und dem Signalweg überlappten.

(a) BTN3A1-Expressionskorrelation mit Genontologiepfaden (GO) in Tausenden von gesunden Proben (alle Gewebe zusammen), zusammengestellt von Correlation AnalyzeR. Um Pfade zu bestimmen, die mit BTN3A1 korrelieren, werden genomweite Pearson-Korrelationen für BTN3A1 als Ranking-Metrik im GSEA-Algorithmus verwendet, der den Padj-Wert bestimmt. (b) Paarweise Korrelationen zwischen der Expression von BTN3A1 und den gezeigten Genen in Tausenden von gesunden Proben (alle Gewebe zusammen) (Correlation AnalyzeR). (c) Jede vertikale Linie zeigt die Korrelation zwischen der Expression von BTN3A1 und einem der Gene im KEGG-Gensatz für oxidative Phosphorylierung (OXPHOS), überlagert mit einem Dichtediagramm der paarweisen Korrelationen von BTN3A1 mit Genen im gesamten menschlichen Genom. Daten aus gesundem Immungewebe (Correlation AnalyzeR).

(a–c) Paarweise Vergleiche signifikanter (FDR < 0,01) und nicht signifikanter Ergebnisse zwischen den drei Replikaten (Rep) der Daudi-Cas9-Zellpopulationen, die für das BTN3A-Expressionsscreening verwendet wurden. (d) Korrelation der Bildschirmeffektgrößen (LFC) zwischen konkordanten Treffern, getrennt in positive und negative Regulatoren der BTN3A-Oberflächenexpression. Dargestellt ist eine lineare Regressionslinie mit einem 95 %-Konfidenzintervall. (e) Oberflächen-BTN3A-Färbung auf lebenden Daudi-Cas9-Zellen, die 72 Stunden lang mit Zoledronat (ZOL), einem Inhibitor von FDPS, behandelt wurden. n = 3 pro ZOL-Dosis, repräsentative Daten aus einem von drei unabhängigen Experimenten. Vergleich zwischen einfaktorieller ANOVA und keiner Behandlung mit dem Mehrfachvergleichstest von Dunnett. (f) Oberflächen-BTN3A-Färbung auf lebenden Daudi-Cas9-FDPS-KO- oder Kontroll-AAVS1-KO-Zellen an den angegebenen Tagen nach der lentiviralen sgRNA-Transduktion. n = 4 für jedes KO. Einweg-ANOVA-Vergleich mit Daudi-Cas9 AAVS1 (#5) KO-Zellen mit dem Mehrfachvergleichstest von Dunnett. Daten aus einem Experiment. (e, f) Mittelwert ± SD. p < 0,0001 (****), p < 0,001 (***), p < 0,01 (**). (g) GSEA von KEGG-Gensätzen, die die Oberflächen-BTN3A-Expression positiv oder negativ regulieren. Anzahl der Gene, die in jedem KEGG-Gensatz enthalten sind, nachdem Gene herausgefiltert wurden, die nicht im Bildschirmdatensatz enthalten waren, und FDR-Q-Werte werden angezeigt.

Quelldaten

(a–d) Schematische Darstellung der Abreicherung und Anreicherung von KOs innerhalb der (a) oxidativen Phosphorylierung, (b) Eisen-Schwefel (Fe-S)-Cluster-Biogenese, (c) N-Glykan-Biosynthese, (d) und Sialylierungswege darüber beide Bildschirme. Die Schattierung zeigt an, dass log2FC nur für signifikante Treffer angezeigt wird (FDR < 0,05). Alle Pfade wurden von WikiPathways übernommen. (a) OXPHOS-Untereinheiten werden mit abgekürzten Namen ohne begleitende Präfixe angezeigt (CI: NDUF; C II: SDH; C III: UQCR, C IV: COX; CV: ATP5) (z. B. B4 in CI ist NDUFB4). Von mitochondrialen Genen kodierte Untereinheiten sind in der Visualisierung nicht enthalten.

(a) Heatmap der Hazard-Verhältnisse (natürlich logarithmisch transformiert), die mit der BTN3A-Screening-Gensignatur bei TCGA-Patienten für 33 Krebsarten verbunden sind (ein positives Log-Verhältnis weist auf eine schlechtere Prognose hin und ein negatives weist auf eine schützende Wirkung der Gensignatur hin). ). Die BTN3A-Screening-Gensignatur wurde auf Mittelwert = 0, SD = 1 skaliert. Die Werte werden nur für Krebstypen mit signifikanter Überlebens- und Signaturassoziation bei Patiententumoren angezeigt, bestimmt durch einen Wald-Test mit Benjamini-Hochberg-Mehrfachvergleichskorrektur (zweiseitiges Padj < 0,05). (bd) Überleben von (b) Gesamtüberleben, (c) TRGV9/TRDV2-hoch/niedrig oder (d) TRAC/TRBC-hoch/niedrig LGG-Patienten, aufgeteilt nach hoher und niedriger Expression der BTN3A-Expressionsscreen-Gensignatur. Log-Rank-Test (Kaplan-Meier-Überlebensanalyse) und Wald-Test (Cox-Regression), angepasst (padj) mit Benjamini-Hochberg-Mehrfachvergleichskorrektur.

(a) Repräsentative Histogramme der Oberflächen-BTN3A-Fluoreszenz für eine Untergruppe einzelner Daudi-Cas9-KOs und die AAVS1-Kontrolle. (b) G115-Klon Vγ9Vδ2 TCR-Tetramer-Färbungsfluoreszenz (MFI) 14 Tage nach der lentiviralen sgRNA-Transduktion. Daten aus einem Experiment. AAVS1 KO n = 12, BTN3A1 KO n = 3, alle anderen Deletionen n = 6. (c, d) qPCR-Daten für (c) BTN3A2- und (d) BTN2A1-Transkripte, normalisiert auf ACTB-Transkripte. n = 5–6 (außer RER (#1) KO n = 4 für BTN2A1), AAVS1 KO n = 12, Daten kombiniert aus zwei unabhängigen Experimenten. (bd) Einfaktorielle ANOVA mit dem Mehrfachvergleichstest von Dunnett. Mittelwert ± SD. p < 0,0001 (****), p < 0,001 (***), p < 0,01 (**), p < 0,05 (*).

Quelldaten

(a) Öffentlich verfügbare IRF1-ChIP-Seq für den Butyrophilin-Locus in K562-Zellen, die stabil C-terminales eGFP-markiertes IRF1 (ENCODE) exprimieren. (b–d) CUT&RUN-Daten für die IRF1- und ZNF217-Bindung an Promotoren in (b) BTN3A1-, (c) BTN3A2- und (d) BTN3A3-Loci in WT-Daudi-Cas9-Zellen. n = 3 pro Bedingung. Der Algorithmus SEACR ruft Spitzen ab und verifiziert sie oberhalb eines strengen Hintergrundsignalschwellenwerts. (e) Daudi-Cas9-KO-Überleben nach 24-stündiger Co-Kultur mit expandierten Vγ9Vδ2-T-Zellen in Gegenwart von ZOL bei einem E:T-Verhältnis von 2:1. Für jeden γδ-T-Zellspender wird das Daudi-Überleben im Verhältnis zu Daudi-Zellen berechnet, die ohne T-Zellen kultiviert wurden, und auf das Überleben der Daudi-Cas9 AAVS1 KO-Kontrollzellen normalisiert. Kombinierte Daten von drei Spendern und zwei unabhängigen Experimenten. AAVS1 KO n = 6, IRF1 KO n = 3. Einweg-ANOVA-Vergleich mit AAVS1 KO-Zellen mit dem Mehrfachvergleichstest von Dunnett. Mittelwert ± SD. p < 0,01 (**).

Quelldaten

(a) Oberflächen-BTN3A-MFI in Daudi-Cas9-KOs, kultiviert in verschiedenen Pyruvatkonzentrationen für 3 Tage in RPMI (keine Glucose, kein Pyruvat). Normalisiert auf Zellen, die ohne Pyruvat (0 mM) gewachsen sind. (bd, f) Oberflächen-BTN3A-MFI in Daudi-Cas9-Zellen, behandelt für 72 Stunden mit (b) einem mTOR-Inhibitor (Rapamycin), einem ISR-Inhibitor (ISRIB), ISR-Agonisten (Guanabenz, Sal003, Salubrinal, Raphin1, Sephin1) und DMSO (Vehikel) (KO-Zellen); (c) Metformin (WT-Zellen); (d) A-769662 im Vergleich zu äquivalenten Mengen DMSO (Vehikel) (WT-Zellen); oder (f) die gezeigten Verbindungen (KO-Zellen). (e) Oberflächen-BTN3A-MFI in WT-Daudi-Cas9-Zellen, die gleichzeitig mit AICAR und steigenden Mengen an Verbindung C (AMPK-Inhibitor) oder DMSO (Vehikel) behandelt wurden. (a) n = 4 pro Bedingung (n = 3, TIMMDC1 (#2) bei 0 mM), Daten kombiniert aus zwei unabhängigen Experimenten, jedes einzeln normalisiert. (b) n = 6 pro Bedingung (außer n = 5 für AAVS1 (#5) mit Guanabenz und für PPAT (#1) mit Salubrinal), Daten kombiniert aus zwei unabhängigen Experimenten, jeweils einzeln normalisiert auf DMSO (Vehikel)-behandelte Zellen . (c) n = 8 pro Bedingung, Daten kombiniert aus zwei unabhängigen Experimenten. Einseitiger ANOVA-Vergleich mit Zellen, die keine Behandlung mit dem Mehrfachvergleichstest von Dunnett erhalten haben. (d) n = 3 pro Bedingung, repräsentative Daten aus einem von zwei unabhängigen Experimenten. (e) n = 3 pro Bedingungen, repräsentative Daten aus einem von zwei unabhängigen Experimenten. Zweiseitiger ungepaarter Student-t-Test mit Bonferroni-Korrektur. (f) n = 3 pro Bedingung (n = 2 für AMPKα1 (#1), behandelt mit DMSO), repräsentative Daten aus einem von zwei unabhängigen Experimenten. Einweg-ANOVA-Vergleich mit AAVS1 (#5) KO-Zellen mit dem Mehrfachvergleichstest von Dunnett. (af) Mittelwert ± SD. p < 0,0001 (****), p < 0,001 (***), p < 0,01 (**), p < 0,05 (*), p > 0,05 (NS).

Quelldaten

(a) G115-Klon Vγ9Vδ2 TCR-Tetramer-Färbung des MFI von WT-Daudi-Cas9-Zellen, behandelt mit 80 µM C991 (DMSO), DMSO (Vehikel), 0,5 mM AICAR (wässrig) oder ohne Behandlung für 72 Stunden. Zweiseitiger, ungepaarter Student-T-Test. (b) Vγ4Vδ1 TCR (Klon DP10.7) Tetramer-Färbungsfluoreszenz (MFI) von Daudi-Cas9 KO-Zellen, behandelt mit 80 µM C991 (DMSO), DMSO (Vehikel), 0,5 mM AICAR (wässrig) oder Wasser für 72 Stunden. Diese Färbung mit einem Tetramer eines irrelevanten γδTCR-Klons definiert den Hintergrund für die Vγ9Vδ2-TCR-Tetramer-Färbung in Abb. 4a. (c) qPCR-Daten für BTN2A1-, BTN3A1- und BTN3A2-Transkripte in mit C991 behandelten Daudi-Cas9-Zellen, intern auf ACTB-Transkripte normalisiert und auf mit DMSO (Vehikel) behandelte Zellen normalisiert. Zweiseitiger, ungepaarter Student-T-Test. (d) IgG1κ-Isotyp-Kontrollfärbung in Daudi-Cas9-KO-Zellen, die 72 Stunden lang mit 80 µM Verbindung 991 (DMSO), DMSO (Vehikel), 0,5 mM AICAR (wässrig) oder Wasser (Vehikel) behandelt wurden. (e) Überleben von eGFP+ Daudi-Zellen, die vor der Co-Kultur (E:T 2:1) mit primären Vγ9Vδ2-T-Zellen 3 Tage lang mit AICAR oder Wasser behandelt wurden, in Gegenwart eines Anti-BTN3A-Antikörpers (Klon 103.2). Die Zellen wurden mithilfe der quantitativen Live-Cell-Bildgebung in Echtzeit (Incucyte) quantifiziert. Das Überleben wurde auf Daudi-Zellen normalisiert, die ohne T-Zellen kultiviert wurden. (a) n = 4 pro Bedingung, repräsentative Daten aus einem von zwei unabhängigen Experimenten. (b) n = 3 pro Bedingung, repräsentative Daten aus einem von zwei unabhängigen Experimenten. (c) n = 4 pro Bedingung, repräsentative Daten aus einem von drei unabhängigen Experimenten. (d) n = 3, repräsentative Daten aus einem von zwei unabhängigen Experimenten. (e) n = 4 pro Bedingung. (ae) Mittelwert ± SD. p < 0,0001 (****).

Quelldaten

Inhaltsverzeichnis und ergänzende Abbildung 1.

Ergebnisse des Kokultur-Screenings nach einzelnen Genen. Die statistische Signifikanz wurde mit dem MAGeCK RRA-Test bewertet, gefolgt von einer Anpassung für mehrere Vergleiche. Zur Bestimmung der Signifikanz wurden FDR-Werte verwendet.

Ergebnisse des Kokultur-Screenings nach einzelnen sgRNAs. Die statistische Signifikanz wurde mit dem MAGeCK RRA-Test bewertet, gefolgt von einer Anpassung für mehrere Vergleiche. Zur Bestimmung der Signifikanz wurden FDR-Werte verwendet.

Negativ angereicherte Kokultur-Screening-Gensätze für den KEGG-Signalweg.

LGG-TCGA-Analyse mit einzelnen Genen aus der Cokultur-Screen-Signatur. Wald-Test-Z-Scores und unbereinigte zweiseitige P-Werte.

LGG-TCGA-Analyse mit Pfaden aus der Kokultur-Screensignatur. Wald-Test-Z-Scores und unbereinigte zweiseitige P-Werte.

Ergebnisse des BTN3A-Expressionsscreenings nach einzelnen Genen. Die statistische Signifikanz wurde mit dem MAGeCK RRA-Test bewertet, gefolgt von einer Anpassung für mehrere Vergleiche. Zur Bestimmung der Signifikanz wurden FDR-Werte verwendet.

Ergebnisse des BTN3A-Expressionsscreenings nach einzelnen sgRNAs. Die statistische Signifikanz wurde mit dem MAGeCK RRA-Test bewertet, gefolgt von einer Anpassung für mehrere Vergleiche. Zur Bestimmung der Signifikanz wurden FDR-Werte verwendet.

Für die Methoden relevante Primer.

Validierung von sgRNAs.

Details zum qPCR-Sonden-Assay.

DP10.7 gdTCR-Tetramersequenzen.

Zusätzliche Gensignaturen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Mamedov, MR, Vedova, S., Freimer, JW et al. CRISPR-Screenings entschlüsseln die Signalwege von Krebszellen, die die Erkennung von γδ-T-Zellen auslösen. Natur (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-06482-x

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Eingegangen: 24. Januar 2022

Angenommen: 26. Juli 2023

Veröffentlicht: 30. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-06482-x

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