Die Darmmikrobiota der Seidenraupe (Bombyx mori) ist an der metabolischen Entgiftung durch Glukosylierung von Pflanzentoxinen beteiligt

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 790 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Pflanzenfresser haben die Fähigkeit entwickelt, Futterbestandteile durch verschiedene Mechanismen zu entgiften. Die oligophage Seidenraupe ernährt sich von Cudrania tricuspidata-Blättern (CTLs) anstelle von Maulbeerblättern, um spezielle, hochwertige Seide herzustellen. Es wurde jedoch festgestellt, dass mit CTL gefütterte Seidenraupen kleinere Körper, ein langsameres Wachstum und eine geringere Seidenproduktion haben als solche, die mit Maulbeerblättern gefüttert wurden. Hier zeigen wir, dass der hohe Gehalt an prenylierten Isoflavonen (PIFs), der in CTLs vorkommt, im Seidenraupenkot durch die Mikrobiota des Seidenraupendarms in glykosylierte Derivate (GPIFs) umgewandelt wird. Diese Biotransformation ist der Schlüsselprozess bei der Entgiftung von PIFs, da GPIFs dies belegen viel weniger toxisch sein, wie sowohl in vitro als auch in vivo gezeigt wurde. Darüber hinaus könnte die Zugabe von Bacillus subtilis als Probiotikum zur Umgestaltung der Darmmikrobiota das Wachstum und die Entwicklung von Seidenraupen positiv fördern. Folglich liefert diese Studie aussagekräftige Leitlinien für die Seidenproduktion, indem sie die Anpassungsfähigkeit von CTL-gefütterten Seidenraupen verbessert.

In der Natur verteidigen sich Pflanzen gegen Pflanzenfresser, indem sie toxische Metaboliten produzieren, während Pflanzenfresser Mechanismen entwickelt haben, um der pflanzlichen Abwehr zu widerstehen, um toxische Nahrung1 durch metabolische Entgiftung zu überwinden, einschließlich der Zerstörung2, Hydrolyse3, Phosphorylierung und Glykosylierung4 der toxischen Komponenten. Die oben genannten Entgiftungsereignisse wurden durch Insekten-ATP-bindende Kassettentransporter5, Darmmikroben6,7 oder sogar horizontalen Gentransfer8,9 ausgelöst. Unter diesen Faktoren spielt die Darmmikrobiota eine wichtige Rolle bei der Abwehr und dem Schutz von Insekten7,10. Beispielsweise sind Kiefernnematoden oder Kiefernrüssler pflanzenfressende Insekten, die in Nadelwäldern gezüchtet werden, die reich an giftigen Terpenoiden wie α-Pinen und Diterpensäure sind und deren Darmmikrobiota eine starke Fähigkeit zum Abbau von Terpenoiden aufweist, um zur Fitness der Insekten beizutragen11,12. Es zeigte sich, dass die vorteilhaften Wechselwirkungen zwischen Insekten und ihrer Darmmikrobiota eine Entgiftung für die Wirte bewirken.

Die Seidenraupe Bombyx mori gehört zu den Lepidoptera, Bombycidae und ist eines der ältesten Wirtschaftsinsekten für die Seidenproduktion. In der langen Geschichte der Seidenraupenzucht in China wurde sie in großem Umfang kultiviert13. Als oligophages Insekt ernähren sich Seidenraupen hauptsächlich von Maulbeerblättern, die zur Familie der Moraceae-Pflanzen gehören, können sich aber auch von Cudrania tricuspidata-Blättern (CTLs)14 derselben Familie ernähren. Es wird berichtet, dass CTL-gefütterte Seidenraupen eine lange Geschichte haben und auf das alte chinesische Lexikon „Erh-ya“ zurückgeführt werden können. Bemerkenswert ist, dass die Kulturseide, die von Seidenraupen produziert wurde, die sich mit CTLs ernährten, im Vergleich zu Maulbeer- oder Tussahseide viel robuster war, eine stabile Struktur hatte, eine stärkere Zugfestigkeit hatte und eine bessere Leistung erbrachte; besonders geeignet für die Herstellung von Sehnen oder Bogensehnen15,16; und manchmal als besonderes Material für die Herstellung von Drachenroben in der alten Dynastie verwendet, die in „Chinesische Technologie im 17. Jahrhundert: T'ien-kung k'ai-wu“ erwähnt wird. Daher sind CTLs in verschiedenen Produktionspraktiken nach und nach zu einer Alternative zur Fütterung von Seidenraupen geworden.

Allerdings hatten Seidenraupen, die sich von CTLs mit geringerer Anpassungsfähigkeit ernährten, leicht kleinere Körper, ein langsameres Wachstum17,18 und eine geringere Seidenproduktion als diejenigen, die andere Blätter ernährten. Die zugrunde liegenden Ursachen dieses Phänomens sind unbekannt, obwohl berichtet wurde, dass die mangelnde Anpassung möglicherweise mit den sekundären Metaboliten in CTLs zusammenhängt, da die Hochregulierung von Carboxylesterase beobachtet wurde, einem entgiftenden Stoffwechselenzym, dessen Aktivität durch verwandte sekundäre Metaboliten reguliert wird19. Die Carboxylesterase-Aktivität war bei Seidenraupen, die mit CTLs gefüttert wurden, höher als bei Seidenraupen, die mit Maulbeerblättern gefüttert wurden, was darauf hindeutet, dass toxische Sekundärmetaboliten in CTLs vorhanden waren18.

Hier haben wir durch vergleichende chemische Untersuchung von CTLs und Seidenraupenkot (SWFs) herausgefunden, dass prenylierte Isoflavone (PIFs), die Hauptbestandteile von CTLs, in SWFs in glykosylierte Derivate (GPIFs) umgewandelt wurden und die Toxizität von GPIFs stark abgeschwächt wurde. Diese Umwandlung wurde durch den Kokulturtest von 6,8-Diprenylorobol (DPL), dem Hauptbestandteil von CTLs, mit Seidenraupen-Darmmikroben in vitro bestätigt. Die Zugabe von B. subtilis als Darmprobiotikum von Seidenraupen während der Fütterung kann die Darmmikrobiota umgestalten, wie mit 16S-rDNA-Amplikonsequenzierung gemessen, und das Wachstum und die Entwicklung von CTL-gefütterten Seidenraupen wurden deutlich verbessert. Unsere Forschung enthüllte den zugrunde liegenden Mechanismus der Wachstumsunterschiede von Seidenraupen bei unterschiedlichen Futtermitteln. Wir bieten auch eine nützliche Möglichkeit, die Entwicklung von Seidenraupen zu verbessern, indem wir die Darmmikrobiota durch die Zugabe von Probiotika während der Fütterung umgestalten.

Um diese PIFs in CTLs mit einem unbelichteten Einfluss auf Seidenraupen zu untersuchen, wurden die chemischen Komponenten in SWFs, die von mit CTLs gefütterten Seidenraupen produziert werden, systematisch isoliert und gereinigt. Zunächst erhielten wir insgesamt 33 Verbindungen aus SWFs (Abb. 1), hauptsächlich PIFs und GPIFs, die die Hauptkomponenten in SWFs darstellten. Zusätzlich zu 10 bekannten PIFs, 6,8-Diprenylorobol(24)20, Lupalbigenin (25)21, Isolupalbigenin (26)22, Auriculasin (27)23, 4′-O-Methylerythrinin C (28)24, Lupiwighteon (29). )25, Erysenegalensein E (30)26, Millewanine H (31)27, Isoerysenegalensein E (32)28 und Millewanine G (33)27, die als die wichtigsten Sekundärmetaboliten in CTLs gelten, wurden auch 23 GPIFs erhalten (1-23) , darunter 21 GPIFs, die nach unserem besten Wissen noch nicht beschrieben wurden, Silexcrins AU (1-21), und zwei bekannte, Lupiwighteone 7-β-d-glucosid (22)29 und Genisteone (23)30, die O- glykosylierte Derivate, die hauptsächlich eine oder zwei Glucose in 7,3′,4′-Hydroxylgruppen am prenylierten Isoflavongerüst einführen. Darüber hinaus wurden auch zwei triviale Paare von Epimeren 13–16 erhalten und durch berechnete ECD mit 2″R-, 2″S-, 3″′S- und 3'″′R-Kohlenstoffstereozentren identifiziert (Abb. 2). Die Strukturaufklärung der Verbindungen 1–21 ist in den Ergänzenden Anmerkungen 1 und 2, den Ergänzenden Tabellen 1–8 und den Ergänzenden Abbildungen zu sehen. 1–214 für Einzelheiten.

Strukturen der Verbindungen 1-33 werden angezeigt. Die neuen Verbindungen 1-21 sind rot dargestellt.

a Basispeaks von Silexcrins MP (13-16) unter LC-MS-Analysebedingungen. Die Retentionszeiten der Verbindungen 13–16 wurden durch LC-MS zu 15,09, 15,12, 15,34 bzw. 15,35 Minuten bestimmt. b Strukturen der Verbindungen 13–16. c Entsprechender experimenteller ECD und berechneter ECD der Verbindungen 13–16. d Entsprechende deprotonierte Molekülionenpeaks ([MH]− m/z) der Verbindungen 13-16: 13 ([MH]− m/z ∼599,21094), 14 ([MH]− m/z ∼599,21082), 15 ([ MH]− m/z ∼599,21082) und 16 ([MH]− m/z ∼599,21075).

Da die charakteristischen Bestandteile von SWFs und CTLs stark variieren, beschränkten sich die Hauptunterschiede in den Komponenten zwischen SWFs und CTLs auf die Peaks mit Retentionszeiten von 19–28 Minuten in der qualitativen HPLC-Analyse (Abb. 3a). GPIFs waren die wichtigsten Differenzbestandteile. GPIFs 1-5, 6, 9 und DPL (24) waren die Hauptkomponenten in SWFs; Allerdings war nur DPL (24) der Hauptbestandteil in CTLs. Darüber hinaus war es aufgrund der Analyse chemischer Strukturen kaum überraschend, eine strukturelle Korrelation zwischen 1-5 und 24 zu finden. Die Verbindungen 1-5 wurden durch Glucosylierung des Aglycons DPL (24) gebildet (Abb. 3b).

eine qualitative HPLC-Analyse der Rohextrakte von SWFs und CTLs. Die Differenzpeaks in den SWFs entsprachen den Verbindungen 1–6 und 9, die die wichtigsten unterschiedlichen Bestandteile der CTLs waren, hervorgehoben durch die rote Umrandung. b Die Strukturbeziehung der Glykosylierung zwischen den Verbindungen 1–5 und 24. c Die Retentionszeiten der Silexcrine AE (1–5) und DPL (24) wurden durch LC zu 11,65, 12,82, 13,46, 16,17, 16,44 und 17,14 Minuten bestimmt ‒MS bzw. die deprotonierten Molekülionenpeaks waren 1 ([MH]− m/z ∼745,27228), 2 ([MH]− m/z ∼745,27197), 3 ([MH]− m/z ∼583,21851). , 4 ([MH]− m/z ∼583,21765), 5 ([MH]− m/z ∼583,21832) und 24 ([MH]− m/z ∼421,16562). d, e Quantitative Analyseergebnisse von 1-5 und 24 in SWFs und CTLs mittels LC-MS. Fehlerbalken von d,e repräsentieren den Mittelwert ± SD.

Da GPIFs in SWFs größtenteils vorkommen, haben wir vorläufig die Hypothese aufgestellt, dass diese GPIFs durch den Darmstoffwechsel bei Seidenraupen erzeugt werden könnten. In Kombination mit der quantitativen Analyse der sechs Hauptkomponenten 1–5 und 24 in SWFs und CTLs durch LC-MS (Abb. 3c – e) betrugen die Gehalte der GPIFs 1, 2, 3, 4 und 5 in SWFs 0,88, 2,67, 0,95, 1,17 bzw. 1,61 mg/g, während sie in CTLs nicht nachgewiesen wurden. Der Gehalt an DPL (24) in CTLs (12,41 mg/g) war jedoch etwa sechsmal höher als der in SWFs (2,14 mg/g), was darauf hindeutet, dass die reduzierten Anteile von DPL (24) in SWFs einer metabolischen Transformation unterzogen wurden. teilweise an der Glykosylierungsumwandlung in die GPIFs 1–5 beteiligt.

Es wurde gezeigt, dass diese GPIFs in SWFs vorhanden waren, nicht jedoch in CTLs. Als nächstes untersuchten wir weiter die Rolle der Darmmikrobiota von Seidenraupen im Darmstoffwechsel für die Bildung dieser GPIFs.

Um die Einflussfaktoren der Glykosylierung im Seidenraupendarm weiter zu bestimmen, isolierten wir die Darmbakterien der Seidenraupe und erhielten drei Isolate. Wir haben die 16S-rDNA-Sequenzen dieser Stämme zum BLAST-Vergleich an NCBI übermittelt und festgestellt, dass die Homologie mit B. subtilis SKG9 (Zugangsnummer: OQ299533.1), Staphylococcus sciuri CTSP9 (Zugangsnummer: EU855191.1) und Enterobacter hormaechei ECC33 (Zugangsnummer: CP098486.1) betrugen bis zu 99,87 %, 99,87 % und 99,93 %, was darauf hindeutet, dass es sich bei diesen endogenen Isolaten um die Stämme B. subtilis, S. sciuri bzw. E. hormaechei handelte.

Es wurde auch festgestellt, dass es Bacillus-Arten gab, eine probiotische Gruppe in der Darmflora mit Glykosyltransferasen, die eine wichtige Rolle bei der Glykosylierung spielten31,32,33,34,35. Diese Art von Bakterien könnte als einer der wichtigen Mikroben im Darm der Seidenraupe das Wachstum und die Entwicklung der Seidenraupe, die Ernährung und den Stoffwechsel beeinflussen16,36. Um die Glykosylierungsfunktion von Bacillus-Arten auf PIFs zu überprüfen, wurden drei Bacillus-Arten, Bacillus licheniformis K1-30-2, Bacillus licheniformis K7-30-7 und das endogene Isolat B. subtilis aus Seidenraupendarm, ausgewählt, um ihre Umwandlungskapazität in zu demonstrieren vitro (Abb. 4a). Den Ergebnissen der LC‒MS (Abb. 4b) zufolge konnten die entsprechenden GPIFs 1–5 in Versuchsgruppen, die mit den drei Bacillus-Stämmen mit DPL (24) als Substrat fermentiert wurden, erfolgreich nachgewiesen werden. Daher waren alle drei Bacillus-Arten in der Lage, 24 in seine glykosylierten Produkte biotransformieren.

ein Schema der mikrobiellen Biotransformation von (ii) 5 und (i) 24 durch Bacillus-Arten in vitro. Silexcrin E (5) und DPL (24) wurden als Substrate für die Fütterung mit drei Bacillus-Arten, B. licheniformis K1-30-2, B. licheniformis K7-30-7 und dem Stamm B. subtilis, verwendet. Die umgewandelten Produkte wurden mittels LC‒MS nachgewiesen. b Umgewandelte Produkte von drei Bacillus-Arten mit DPL (24) als Substrat durch mikrobielle Biotransformation in vitro, nachgewiesen durch LC-MS: (i) Die von B. licheniformis K1-30-2 produzierten Verbindungen 1–5 wurden bei 11,62, 12,83, 13,45 nachgewiesen , 16.18 bzw. 16.40 Min. (ii) Die von B. licheniformis K7-30-7 produzierten Verbindungen 1–5 wurden bei 11,63, 12,80, 13,46, 16,19 bzw. 16,41 Minuten nachgewiesen. (iii) Die vom B. subtilis-Stamm produzierten Verbindungen 2–5 wurden bei 11,72, 12,89, 13,45, 16,22 bzw. 16,45 Minuten nachgewiesen. c Umgewandelte Produkte von drei Bacillus-Arten mit Silexcrin E (5) als Substrat durch mikrobielle Transformation in vitro, nachgewiesen durch LC-MS: (i) Die von B. licheniformis K1-30-2 produzierten Verbindungen 2 und 13–16 wurden bei 12,79 und nachgewiesen jeweils 15,09–15,35 Min.; (ii) die oben genannten von B. licheniformis K7-30-7 umgewandelten Produkte wurden bei 12,78 bzw. 15,09–15,35 Minuten nachgewiesen; und (iii) vom Stamm B. subtilis produziert, wurde bei 12,81 bzw. 15,09–15,35 Minuten nachgewiesen. d Vorgeschlagene mikrobielle Biotransformation von GPIFs aus SWFs durch Bacillus-Arten im Seidenraupendarm.

Darüber hinaus wurden in SWFs zwei Epimerpaare 13–16 identifiziert, in CTLs wurden jedoch keine entsprechenden Aglykone von 13–16 gefunden, was darauf hindeutet, dass die Verbindungen 13–16 durch Mikrobiota-Transformation gebildet wurden. Diese Schlussfolgerung wurde durch die Bildung von 2 und 13–16 (Abb. 4c) weiter bestätigt, die von den drei mit 5 gefütterten Bacillus-Arten in vitro umgewandelt und durch LC-MS mit den entsprechenden Retentionszeiten und deprotonierten Molekülionenpeaks nachgewiesen wurden (Ergänzung). Abb. 215). Hier schlagen wir logischerweise die mikrobielle Biotransformation des Hauptbestandteils DPL (24) in SWFs durch Bacillus-Arten im Seidenraupendarm vor. Zuerst wurde DPL (24) durch Bacillus-Arten im Seidenraupendarm zu 3, 4 und 5 glykosyliert, und dann wurden nacheinander Zucker hinzugefügt, um 1 und 2 zu bilden. Darüber hinaus war ein Teil von 5 nacheinander an der Bildung von 13–16 beteiligt Epoxidierung und nukleophile SN2-Addition unter dem Einfluss von Darmbakterien (Abb. 4d).

Darüber hinaus führten wir auch eine mikrobielle In-vitro-Transformation von DPL (24) durch die anderen endogenen Seidenraupen-Darmstämme S. sciuri und E. hormaechei durch. Und S. sciuri konnte DPL (24) glykosylieren, um 1, 2 und 5 zu bilden, und E. hormaechei wandelte nur Substrat 24 in 2 um, was darauf schließen lässt, dass diese beiden Isolate DPL (24) nur teilweise umwandeln konnten, um entsprechende GPIFs zu produzieren (ergänzende Abb . 216). Daher wurde vermutet, dass diese Seidenraupendarm-Isolate an der Umwandlung von PIFs beteiligt waren und Bacillus-Arten eine bessere Transformationsfähigkeit von DPL (24) zeigten als die beiden anderen Isolate aus Seidenraupendarm. Zu unserem Bedauern wurden außer B. subtilis keine anderen endogenen Bacillus aus dem Seidenraupendarm untersucht, und wir können in der aktuellen Studie auch den Beitrag anderer mikrobieller Taxa im Seidenraupendarm nicht ausschließen.

Bezüglich der mit Entgiftungseffekten verbundenen Glykosylierung gingen wir davon aus, dass PIFs für Seidenraupen toxisch sein könnten, die biotransformierten GPIFs hätten die Toxizität jedoch abgeschwächt. Zunächst untersuchten wir die Zytotoxizität der aus SWFs isolierten Verbindungen 1–33 auf den normalen menschlichen Nabelschnurvenen-Epithelzellen (HUVECs) (Tabelle 1). Diese PIFs aus CTLs zeigten im Allgemeinen eine signifikante oder mäßige zytotoxische Aktivität auf HUVECs. Bemerkenswert ist, dass DPL (24) mit 1,97 ± 0,31 μM die signifikanteste Zytotoxizität gegenüber HUVECs zeigte, was stärker war als die des Kontrollarzneimittels Azithromycin, während die Toxizität der entsprechenden fünf GPIFs 1–5 eher schwach war oder sogar verschwand.

Wir beobachteten auch das Wachstum und Überleben von HUVECs in zwei mit Silexcrin B (2) und DPL (24) behandelten Gruppen (Abb. 5a). Der Wachstumszustand der mit Silexcrin B (2) behandelten HUVECs wies bis zu 80 μM noch eine normale Zellmorphologie auf, während die Zellen in der mit DPL (24) behandelten Gruppe bei weniger als 5 μM offensichtlich und dosisabhängig geschädigt waren. Weitere Untersuchungen ergaben, dass DPL (24) die Zellapoptose und den Zyklusstillstand beeinflusste, wenn HUVECs mit 24 behandelt wurden, wie durch Durchflusszytometrie bestimmt (Abb. 5b – e). Dieses Ergebnis impliziert, dass DPL (24) die HUVEC-Apoptose dosisabhängig förderte und HUVECs in der G1-Phase festhielt, was durch die toxische Wirkung auf DPL (24) interpretiert werden kann.

a Wachstumszustand von HUVECs, induziert durch unterschiedliche Konzentrationen von Silexcrin B (2) oder DPL (24) in vitro. b Die HUVEC-Linie wurde mit 0, 2,5, 5 oder 10 μM DPL (24) behandelt und die Zellapoptose wurde durch Durchflusszytometrieanalyse in Verbindung mit Annexin V-FITC/PI-Färbung nachgewiesen. c Quantifizierungsfeld zeigt die statistische Analyse der Zellapoptose in dosisabhängiger Weise. (Einfaktorielle ANOVA, n = 3, P = 0,0687 > 0,05, **P = 0,003 < 0,01, ***P < 0,001 im Vergleich zur Kontrollgruppe. Die Fehlerbalken werden als Mittelwert ± SD angegeben.) d Zellen waren behandelt mit 0, 1,25, 2,5 oder 5 μM DPL (24), und ein Stillstand des Zellzyklus wurde auch durch Durchflusszytometrieanalyse in Verbindung mit PI-Färbung festgestellt. Das Quantifizierungsfeld zeigt die statistische Analyse des Zellzyklusstopps. (einfaktorielle ANOVA, n = 3, *P = 0,0496 < 0,05, **P = 0,0053 < 0,01, ***P < 0,001 im Vergleich zur Kontrollgruppe. Die Fehlerbalken werden als Mittelwert ± SD angegeben). f Toxizitätstest von Silexcrin (2) und DPL (24) auf G. mellonella in der Überlebenskurve.

Anschließend testeten wir die Toxizität von Silexcrin B (2) und DPL (24) auf G. mellonella (Abb. 5f). Seidenraupe und G. mellonella sind beide Insekten der Lepidoptera; Daher wurde G. mellonella als Modellinsekt37,38 mit 40 oder 80 μg/Tag Verbindungen behandelt und 7 Tage lang kontinuierlich injiziert. G. mellonella in der mit 80 μg/Tag mit DPL (24) behandelten Gruppe begann am zweiten Tag abzusterben, und am siebten Tag wurde eine Überlebensrate von 50 % beobachtet; In der mit Silexcrin B (2) behandelten Gruppe und derselben Arzneimitteldosis begannen die Insekten am fünften Tag zu sterben, mit einer Überlebensrate von 75 % am siebten Tag. Ein ähnliches Ergebnis trat auf, wenn die Dosis 40 μg/Tag betrug. Bei gleicher Dosis und Behandlungsdauer hatte die mit DPL (24) behandelte Gruppe eine geringere Überlebensrate als die mit Silexcrin B (2) behandelte Gruppe, und die Überlebensrate nahm mit zunehmender Dosis ab. Der Toxizitätstest an G. mellonella ergab, dass die PIFs in CTLs eine relativ hohe Toxizität für Seidenraupen hatten und dass diese Verbindungen durch die Darmmikrobiota von Seidenraupen in glykosylierte Derivate mit stark abgeschwächter Toxizität umgewandelt wurden. Daher spielte die Glukosylierung als wichtiger Entgiftungsweg eine wichtige Rolle im Darmstoffwechsel von Seidenraupen, wenn Seidenraupen mit CTLs gefüttert wurden.

Da die Zusammensetzung der Darmmikrobiota durch eine Ernährungsumstellung beeinflusst wurde14,39, gingen wir davon aus, dass eine B. subtilis-Supplementierung in Seidenraupenfutter einige positive Auswirkungen auf Seidenraupen- und Darmmikroben haben würde. Da B. subtilis mit einem klaren genetischen Hintergrund als häufiges gentechnisch verändertes Bakterium und probiotisches Nahrungsergänzungsmittel verwendet wurde40,41,42, wurde ein probiotischer Versuch mit probiotischem B. subtilis-Pulver an zwei verschiedenen Seidenraupenrassen durchgeführt, einschließlich Kontrollgruppen, denen CTLs ohne jegliche Anwendung verabreicht wurden von probiotischem Pulver und Versuchsgruppen, denen CTLs mit probiotischem Pulver gefüttert wurden.

Der von lebenden Seidenraupen präparierte Darminhalt wurde mit der 16S-rDNA-Amplikonsequenzmethode43 sequenziert, um die Veränderungen in der Zusammensetzung der Darmmikroben, der relativen Häufigkeit und der Diversität zwischen verschiedenen Gruppen mit oder ohne B. subtilis zu vergleichen. Erstens wurde die Zusammensetzung der Darmflora der Seidenraupe auf der Ebene der Gattung und sogar auf der Ebene des Stammes verändert, was durch die Zugabe von fremdem B. subtilis beeinflusst wurde (Abb. 6a, b). Darüber hinaus erhöhte sich auch die relative Häufigkeit der Gattung Bacillus im Seidenraupendarm bei Zugabe von B. subtilis, die bei der YSY-Seidenraupe von 1,19 % auf 2,12 % und bei der HK2-Seidenraupe von 0,72 % auf 1,26 % anstieg (Abb. 6c). ). Laut der Alpha-Diversitätsanalyse zeigten die drei Indikatoren Shannon_2, Reichtum und Chao1, dass der Artenreichtum im Seidenraupendarm der Versuchsgruppen mit B. subtilis höher war als der in den Kontrollgruppen ohne B. subtilis (Abb. 6d). ). Beispielsweise stieg der Wert von Shannon_2 bei der YSY-Seidenraupe von 3,12 auf 3,98 und bei der HK2-Seidenraupe von 1,42 auf 2,44. Darüber hinaus zeigten die Simpson-, Dominanz- und Gleichberechtigungsindikatoren auch, dass die Artengleichmäßigkeit im Seidenraupendarm nach der Zugabe von B. subtilis gleichmäßiger war (Abb. 6e). Beispielsweise verringerte sich der Simpson-Wert bei der YSY-Seidenraupe von 0,40 auf 0,21 und bei der HK2-Seidenraupe von 0,72 auf 0,53. Daher deutete es darauf hin, dass B. subtilis sich im Darm der Seidenraupe ansiedeln, die Zusammensetzung der Darmflora verändern und die mikrobielle Vielfalt und Gesamtgleichmäßigkeit des Darms erhöhen könnte. Wir haben jedoch weder eine Kontrollgruppe anderer Inhaltsstoffe in probiotischem Pulver ohne B. subtilis untersucht, noch konnten wir in der aktuellen Studie den Einfluss anderer Inhaltsstoffe ausschließen.

Relative Häufigkeit von Seidenraupen-Darmbakterien auf der Ebene des Stammes (a) und der Gattung (b) in den vier verschiedenen Gruppen. In jeder Gruppe gab es 5 Seidenraupen in vier verschiedenen Gruppen. (YSY bezieht sich auf die Gruppe der YSY-Seidenraupen; HK2 bezieht sich auf die Gruppe der HK2-Seidenraupen; BS bedeutet das Hinzufügen von zusätzlichem B. subtilis zu CTLs, um Seidenraupen zu füttern.) b Relative Häufigkeit von Bacillus-Arten in den vier Gruppen der Seidenraupen-Mitteldärme. c Boxplots von Shannon_2, Richness und Chao1 waren die Indikatoren für den Artenreichtum. Je höher der Wert, desto höher der Artenreichtum und der Wert der Mittellinie in Boxplots, die den Artenreichtum von Versuchsgruppen mit B. subtilis höher als veranschaulichen Kontrollgruppen ohne B. subtilis; d Simpson, Dominanz und Gleichberechtigung waren die Indikatoren für die Gleichmäßigkeit der Arten. Simpson ist repräsentativ dafür, dass die Artengleichmäßigkeit umso höher ist, je kleiner der Wert ist, und dass der Wert der Mittellinie, die die Artengleichmäßigkeit der Versuchsgruppen mit B. subtilis darstellt, gleichmäßiger war als der der Gruppen ohne B. subtilis. Für Dominanz und Gleichberechtigung gilt: Je höher der Wert, desto gleichmäßiger ist die Gleichmäßigkeit der Arten. Die Daten von c–e werden als Mittelwert ± SD angegeben.

Darüber hinaus wurden im Probiotika-Versuch Wachstum und Entwicklung der Seidenraupen in verschiedenen Gruppen beobachtet und die Gewichtsdaten der Seidenraupen in verschiedenen Zeiträumen aufgezeichnet. Als Ergebnis fanden wir einen besseren Wachstumszustand der Seidenraupen in den Versuchsgruppen, und das Durchschnittsgewicht der Seidenraupen, die in verschiedenen Zeiträumen mit B. subtilis gefüttert wurden, war schwerer als das der nicht mit B. subtilis gefütterten Seidenraupen (Abb. 7a), und die Seidenraupen, die mit B. subtilis gefüttert wurden, waren schwerer . subtilis waren größer als die nicht gefütterten B. subtilis (Abb. 7b). Für die Rasse der YSY-Seidenraupen zeigte sich, dass Seidenraupen mit B. subtilis-Supplementierung deutlich schwerer waren als solche ohne B. subtilis-Supplementierung (Abb. 7c). Daher wurde in gewissem Maße darauf hingewiesen, dass die Verfütterung von B. subtilis an Seidenraupen deren Wachstum und Entwicklung fördern und insbesondere das Gewicht der Seidenraupen erhöhen kann.

a Durchschnittliche Gewichtsveränderungen aller am probiotischen Versuch beteiligten Seidenraupen in vier verschiedenen Gruppen in unterschiedlichen Wachstumsstadien. b Vergleich der Größen von Seidenraupenkörpern, die im probiotischen Versuch zufällig aus 5 jeder Gruppe ausgewählt wurden. c Vergleich des Gewichts von 5 zufällig ausgewählten Seidenraupen in vier verschiedenen Gruppen (Student-t-Test, zweischwänzig, n = 5, *p = 0,0143 < 0,05). d Quantitative HPLC-Analyse der GPIFs 1–5 und Aglycon 24, nachgewiesen bei λ = 254 nm. e Ergebnisse der quantitativen Analyse des relativen Gehalts von 1-5, 24 aus SWFs in vier Gruppen mittels HPLC im Balkendiagramm. Die vertikale Koordinate bezieht sich auf das Verhältnis des Gehalts jeder Verbindung (1-5 und 24) zum Gesamtgehalt dieser sechs Verbindungen, was den relativen Gehalt der Inhaltsstoffe in SWFs widerspiegelt. f Vergleich der relativen Inhalte der GPIFs 1–5 aus SWFs in den vier verschiedenen Gruppen. Die Daten von c, e, f werden als Mittelwert ± SD angegeben.

Anschließend wurde eine quantitative Analyse der Hauptkomponenten 1–5 und 24 mittels HPLC durchgeführt (Abb. 7d, e). Gemäß den quantitativen Ergebnissen der HPLC wurde das Verhältnis jeder Peakfläche von 1-5 und 24 zur gesamten Peakfläche der sechs Komponenten als Indikator verwendet, um die Änderungen im relativen Gehalt der sechs Komponenten in SWFs zu veranschaulichen der Einfluss von exogenem B. subtilis auf die Veränderungen der Darmmetaboliten von Seidenraupen. Wie in Abb. 7e gezeigt, beeinflusste B. subtilis den Gehalt an Darmmetaboliten bei Seidenraupen. Nach der Zugabe von B. subtilis stieg der relative Gesamtgehalt der fünf Haupt-GPIFs 1–5 in SWFs bei YSY-Seidenraupen an (Abb. 7f), was 2,0 % höher war als bei Seidenraupen, die nicht mit B. subtilis gefüttert wurden, während der relative Gehalt von der Aglycon-DPL (24) nahm ab. Diese Beobachtung könnte mit der Zunahme der relativen Häufigkeit von Bacillus im Darm der YSY-Seidenraupe zusammenhängen. Allerdings stieg der relative Gesamtgehalt von 1-5 in SWFs von HK2-Seidenraupen im Vergleich zu Seidenraupen, die nicht mit B. subtilis gefüttert wurden, leicht um 0,2 % an. Dieses Ergebnis legt nahe, dass YSY-Seidenraupen möglicherweise anfälliger für B. subtilis sind als HK2-Seidenraupen.

Das Phänomen, dass die B. subtilis-Supplementierung bei Seidenraupen eine Erhöhung des Gesamtgehalts an GPIFs und eine Verringerung des entsprechenden toxischen Aglycongehalts in SWFs ermöglichte, könnte auch für die Entgiftung der toxischen PIFs in CTLs relevant sein, um Wirte vor schädlichen Inhaltsstoffen zu schützen.

Wir haben eine Reihe von GPIFs entdeckt, die in SWFs häufig vorkommen. Hierbei handelt es sich um oxyglykosylierte Produkte an einer oder zwei Stellen der 7-, 3′- oder 4′-OH-Position des prenylierten Isoflavon-Gerüsts. Angesichts der wenigen natürlich vorkommenden GPIFs in der Natur44 werden SWFs von Seidenraupen, die mit CTLs gefüttert werden, folglich zu einer reichlich vorhandenen natürlichen Quelle für diese Verbindungen. Darüber hinaus stellten wir fest, dass die Hauptunterschiede bei den Inhaltsstoffen zwischen SWFs und CTLs GPIFs waren. Anschließend bewiesen vorläufige Beweise durch quantitative HPLC-MS-Analyse, dass diese GPIFs nicht in CTLs selbst vorhanden waren, sondern durch den Darmstoffwechsel der Seidenraupen produziert wurden. Eine mikrobielle In-vitro-Biotransformation von DPL (24) durch drei Darmstämme, B. subtilis, S. sciuri und E. hormaechei, die aus dem Darm von Seidenraupen isoliert wurden, deutete außerdem darauf hin, dass die Bildung reichlich vorhandener GPIFs in SWFs eng mit Seidenraupenmikroben zusammenhängt.

Es wurde berichtet, dass einige Mikroben, wie z. B. Bacillus-Arten mit GTs, über eine hervorragende Fähigkeit zur Transglykosylierung mit breiter Substratspezifität verfügen, insbesondere prenylierte phenolische Komponenten mit höherer Affinität44,45. In den letzten Jahren wurden einige GTs von Bacillus-Arten häufig zur Glykosylierung von Flavonoiden eingesetzt46. Umfangreiche Studien machten große Aufmerksamkeit auf O-glykosylierte Flavonoide mit relativ hohen Anteilen an natürlichen Gesamtflavonoidglykosiden und entdeckten, dass GTs aus B. subtilis ATCC 6633 (BsGT110)47, B. subtilis 168 (Bs-YjiC)48, B. licheniformis (Bl -YjiC)49,50 und Bacillus cereus (MgtB, BcGT1 und BcGT-3)51,52,53 konnten die Glykosylierungsreaktion katalysieren, bei der Glykosyleinheiten an Hydroxylgruppen von Flavonoiden gebunden wurden, um Flavonoid-O-glukoside zu biosynthetisieren. Um dies zu veranschaulichen, haben wir bewiesen, dass Bacillus-Arten DPL (24) in die GPIFs Silexcrins AE (1-5) umwandeln können. Darüber hinaus wurde die Bildung der Epimere Silexcrins MP (13–16) mit mutierten Aglyconskeletten auch durch mikrobielle Biotransformation bestätigt.

Glykosylierung kann nicht nur die strukturelle Stabilität und Hydrophilie chemischer Verbindungen verbessern, sondern wird auch als direkter oder indirekter Entgiftungsprozess angesehen54,55,56,57. In unserer vorliegenden Arbeit haben die Toxizitätstests von DPL (24) an G. mellonella gezeigt, dass PIFs in CTLs toxische Wirkungen auf Pflanzenfresser haben, die das Wachstum und die Entwicklung von Seidenraupen beeinträchtigen können. Weitere Tests von DPL (24) mit HUVECs zeigten, dass es Zellapoptose induziert, Zellen daran hindert, in der G1-Phase zu bleiben, und schwere Zellschäden verursacht. Diese Studie ergab, dass die Glykosylierung ein wichtiger Entgiftungsweg für die Umwandlung toxischer PIFs in CTLs in GPIFs mit abgeschwächter oder keiner Toxizität ist. Einigen Studien zufolge unterscheiden sich mit CTLs gefütterte Seidenraupen in Wachstum und Entwicklung, Kokons und der Qualität der Seide (ergänzende Abbildung 217) im Vergleich zu denen mit Maulbeerblättern, die durch die toxischen Bestandteile von CTLs beeinflusst werden können15,17. 18. Daher wurde bestätigt, dass PIFs, eine Unterklasse charakteristischer sekundärer Pflanzenstoffe, die in CTLs häufig vorkommen, schädliche Inhaltsstoffe für das Seidenraupenwachstum sind, was erklärt, warum Seidenraupen bei der Fütterung mit CTLs eine relativ geringe Anpassungsfähigkeit aufweisen.

Jüngste Studien schlugen auch eine mögliche Strategie für einen Probiotika-Versuch vor, der zeigte, dass sich die Darmmikroben entsprechend verändern könnten, wenn Corynebacterium- und Bacillus-Arten als Probiotika verwendet würden, um die mikrobiellen Wechselwirkungen im Darm des Laubfrosches zu überprüfen58. Hier fanden wir heraus, dass B. subtilis als Probiotikum, das dem Darm der Seidenraupe zugesetzt wird, eine wichtige Rolle bei der Veränderung der Zusammensetzung der Darmmikrobiota spielt, indem es den Reichtum und die Gleichmäßigkeit der Darmbakterien erhöht und eine unbelichtete metabolische Entgiftungsstrategie durch phytochemische Glykosylierung bei Seidenraupen manifestiert. Wichtig ist auch, dass ein positiver Einfluss auf das Wachstum und die Entwicklung von Seidenraupen beobachtet wurde. Angesichts der Tatsache, dass das Probiotikum B. subtilis zur Förderung des Wachstums und der Entwicklung von Tieren eingesetzt wurde und sich sogar als vorteilhaft für die Vorbeugung und Behandlung menschlicher Krankheiten erwiesen hat34,59,60,61,62, wird erwartet, dass auch probiotische Bacillus-Arten entwickelt werden in intestinale probiotische Präparate für Seidenraupen.

Die Einschränkungen in der aktuellen Studie bestehen jedoch darin, dass hier keine weiteren endogenen Darmmikrobiota außer drei Isolaten, B. subtilis, S. sciuri und E. hormaechei, aus dem Darm der Seidenraupe untersucht wurden. Da Berichten zufolge die Unterschiede in der Ernährung die Zusammensetzung der Darmmikrobiota von Insekten beeinflussen könnten14,39, konnten wir nicht klären, ob andere Inhaltsstoffe in probiotischem Pulver auch die Zusammensetzung der Darmmikrobiota von Seidenraupen beeinflussen könnten.

Hier ist es erwähnenswert, dass wir herausgefunden haben, dass die Darmmikrobiota der Seidenraupe die Fähigkeit entwickelt hat, Lebensmittelinhaltsstoffe zu entgiften, indem sie sie in glykosylierte Derivate umwandelt (Abb. 8). Es legt eine Grundlage für zukünftige Forschungsarbeiten zur Verbesserung der Anpassungsfähigkeit von Seidenraupen, die mit CTLs gefüttert werden, und bietet eine mögliche Richtung für die weitere Entwicklung von Probiotika, die in für Seidenraupen geeigneten mikrobiellen Präparaten eingesetzt werden.

Wenn sich Seidenraupen von CTLs ernähren, gelangt die toxische Komponente DPL (24) in CTLs in den Darm der Seidenraupe und wird unter dem Einfluss der Mikrobiota des Seidenraupendarms in GPIFs wie Silexcrin B (2) mit stark abgeschwächter Toxizität umgewandelt.

CTLs und SWFs von mit Seidenraupen gefütterten CTLs wurden in Linyi, Shandong, China, gesammelt. Ein probiotisches Trockenpulverpräparat von B. subtilis wurde von Shandong Yihao Biotechnology Co., Ltd. (China) gekauft. Die Reagenzien für die HPLC- oder LC-MS-Analyse waren von chromatographischer Qualität, die anderen Reagenzien von analytischer Qualität.

Luftgetrocknete SWFs (1,8 kg) wurden durch dreimaliges Erhitzen unter Rückfluss mit 95 %igem Ethylalkohol für jeweils 3 Stunden extrahiert. Der eingedampfte Rohextrakt, suspendiert in H2O, wurde nacheinander mit Petrolether, Ethylacetat und n-Butylalkohol extrahiert. Kurz gesagt, der Ethylacetatextrakt wurde nacheinander mit einem Gradienten aus MeOH-H2O (3:7 bis 1:0), CH2Cl2-MeOH (200:1 bis 0:1), MeOH (100 %) und einer MeOH-H2O-Elution aufgeteilt System über eine MCI-Gelsäule, eine Kieselgelsäule (100–200 Mesh), eine Sephadex LH-20-Chromatographie und eine semipräparative HPLC (SHIMADZU LC-20AT, DAD-Detektor, Shim-Pack GIS-C18 (5 μm, 10×). 250 mm)). Dreiunddreißig GPIFs wurden gereinigt und die Aufklärung der Silexcrine AU (1-21) sowie NMR-Daten, HRESIMS-, ECD-, UV- und IR-Spektren sind in den ergänzenden Materialien dargestellt.

NMR-Spektren wurden mit den Spektrometern Avance DRX-400 und 600 (Bruker, Deutschland, Dimethylsulfoxid-d6 mit 0,3 % internem Standard TMS als Lösungsmittel) aufgenommen. Die UV-Spektren wurden mit dem UV-2550-Spektrophotometer (Shimadzu, Japan) und die IR-Spektren mit dem Nicolet iN10-Mikroinfrarotspektrometer (Thermo Fisher Scientific, Amerika) aufgenommen. Das Chirascan-Zirkulardichroismus-Spektrometer (Applied Photophysics, Vereinigtes Königreich) wurde verwendet, um die Verbindungen der ECD-Spektren zu erhalten. Optische Rotationen wurden mit dem Modular Circular Polarimeter MCP 200 (Anton Parr, Österreich, MeOH als Lösungsmittel, 20 °C) gemessen. Hochauflösende Massenspektren wurden mit dem Thermo Fisher Q-Exactive Orbitrap-Massenspektrometer (Thermo Fisher Scientific, Amerika) erhalten.

Die quantitative Analyse der Veränderungen im Gehalt der charakteristischen chemischen Bestandteile Silexcrine AE (1-5) und DPL (24) aus SWFs und CTLs wurde getrennt durch LC-MS unter den folgenden Analysebedingungen durchgeführt: Gerät, Thermo Fisher Q-Exactive Orbitrap, UtiMate 3000, Dim. (100×2,1 mm); Detektor, DAD-3000; Ionisationsquelle, ESI; Flussrate: 0,3 ml/min; und Injektionsvolumen: 2,0 μL. Für das MeOH-H2O-Elutionssystem wurde eine Gradientenelution durchgeführt: 25:75 von 0,0–1,0 Min., 25:75 bis 95:5 von 1,0–20,0 Min., 95:5 von 20,0–24,0 Min., 95:5 bis 25:75 von 24.0-25.0 Min. und 25:75 von 25.0-28.0 Min. Die sechs Silexcrine AE (1–5) und DPL (24) wurden zusammengemischt, um eine Standardlösung jeder Verbindung in einer Konzentration von 1 μg/ml herzustellen. Die gemischte Standardlösung wurde seriell auf die Konzentrationen 1000, 500, 250, 100, 50, 25, 10, 5 und 2,5 ng/ml für jede Verbindung in jeder Mischlösung verdünnt. Diese neun Standardmischungslösungen wurden verwendet, um die Standardkurven der sechs Komponenten zu erstellen (ergänzende Abbildung 218). Die Methanol-Ultraschallextrakte von SWFs und CTLs wurden durch LC-MS unter den oben genannten Bedingungen getrennt auf eine Konzentration von 200 μg/ml hergestellt. Jede Gruppe wurde dreifach analysiert. Die aus der Analyse gewonnenen Daten wurden verwendet, um den Gehalt von sechs Verbindungen in SWFs und CTLs mit der Thermo Scientific Xcalibur-Software zu ermitteln.

Die qualitative Analyse verschiedener Bestandteile aus den Rohextrakten von SWFs und CTLs wurde mittels HPLC unter den gleichen chromatographischen Bedingungen (Agilent 1260, DAD-Detektor, Eclipse XDB-C18-Säule (5 μm, 4,6 × 250 mm), Gradientenelution aus dem MeOH-H2O-Elutionssystem, 30:70 bis 100:0 in 30 Minuten). Die quantitative Analyse der Gehaltsveränderungen der Silexcrine AE (1-5) und DPL (24) in frischen SWFs wurde getrennt durch HPLC mit den oben genannten chromatographischen Bedingungen durchgeführt. Es gab vier Gruppen von SWFs (YSY, YSY-BS, HK2, HK2-BS), die von zwei Seidenraupenrassen mit oder ohne B. subtilis produziert wurden und alle auf 50 mg/ml zubereitet wurden. Darüber hinaus wurden die in chromatographischem Methanol gelösten Silexcrine AE (1-5) und DPL (24) qualitativ analysiert, um die Retentionszeit unter den oben genannten chromatographischen Bedingungen zu bestätigen. Die sechs erhaltenen chromatographischen Peakflächen wurden verarbeitet, um die relativen Gehalte der sechs Verbindungen in den vier verschiedenen Exkrementen zu vergleichen. Alle frischen SWFs wurden nach der Lyophilisierung zusätzlich zu Wasser zu Pulver gemahlen.

Theorie- und Berechnungsdetails63: Die Berechnungen wurden mit dem Programmpaket Gaussian 09 durchgeführt. Die gescannte potentielle Energieoberfläche wurde mit der semiempirischen AM1-Methode und einem DFT-Ansatz B3LYP/6-31 G (d) verwendet und die Geometrien aller Grundzustandskonformationen wurden bei 298,15 K weiter optimiert. Anschließend wurden diese Minima und Berechnungen von Die freien Energien bei Raumtemperatur wurden durch Berechnungen ihrer harmonischen Frequenzanalyse bestätigt. Die elektronischen Anregungsenergien und Rotationsstärken in der Gasphase für die ersten 60 Zustände wurden durch zeitabhängige Dichtefunktionaltheorie berechnet. Nach Summierung der Rotationskräfte und energetischer Gewichtung auf Basis der Boltzmann-Statistik wurden die endgültigen ECD-Spektren durch die folgende Gleichung 1 erhalten:

σ ist die Breite des Bandes bei 1/e Höhe (σ = 0,1 eV). ΔEi ist die Anregungsenergie. Ri ist rotatorische Stärke für den Übergang.

B. licheniformis K1-30-2 und B. licheniformis K7-30-7, die für die mikrobielle Biotransformation in vitro verwendet werden, wurden zuvor in unserem Labor ausgewählt. In unserer Arbeit wurde der Stamm B. subtilis aus Seidenraupen isoliert. DPL (24) und Silexcrin E (5) wurden als Substrate zur Fütterung von drei Bacillus-Arten verwendet. Die Versuchsgruppen mit Substrat und die Kontrollgruppen ohne Substrat wurden gebildet und jede Gruppe wurde dreifach getestet. Drei Bacillus-Arten wurden durch Kultur auf Agarplatten aktiviert, und aktivierte Isolate wurden in Luria-Bertani (LB)-Lösung mit 5 ml in Eppendorf-Röhrchen als Kulturmedium subkultiviert, um die Glucosequelle auf einem Schütteltisch mit konstanter Temperatur von 37 °C für 24 Jahre bereitzustellen H. Nach der Inkubation der Bakterienlösung wurde DPL (24) oder Silexcrin E (5) (1 mg gelöst in 0,5 % DMSO) als Substrat zu den Versuchsgruppen gegeben und weitere 24 Stunden bei 37 °C kontinuierlich co-inkubiert. Anschließend wurden die gelösten Bakterien durch Ultraschall zerkleinert und dreimal mit Ethylacetat extrahiert. Die Lysate wurden mittels LC-MS (unter den gleichen Bedingungen wie oben erwähnt) analysiert, um die mikrobiellen Biotransformationsprodukte der drei Bacillus-Arten in vitro nachzuweisen.

Zwei der in unserer Studie ausgewählten Seidenraupenrassen, YeSanYuan-Seidenraupe (YSY-Seidenraupe) und HuaKang 2-Seidenraupe (HK2-Seidenraupe), wurden vom Runfa Institute of Cudrania tricuspidata, Linyi (Shandong, China), bereitgestellt. Die Kontrollgruppen (YSY, HK2) im Probiotikatest erhielten CTLs ohne Anwendung von B. subtilis-Probiotikapulver, und die Versuchsgruppen (YSY-BS, HK2-BS) erhielten CTLs mit B. subtilis-Probiotikapulver. An dem Experiment nahmen insgesamt 400 Seidenraupen teil, 100 in jeder Gruppe. Sie wurden ab dem geschlüpften Seidenraupenstadium mit CTLs gefüttert. Ab dem dritten Stadium wurden die Seidenraupen in den Versuchsgruppen durch Besprühen mit CTLs gefüttert, denen B. subtilis-Präparate zugesetzt waren. Das Trockenpulverpräparat von B. subtilis wurde in Wasser auf 1:1000 g/ml verdünnt und dreimal täglich mäßig zu CTLs gegeben, die an Seidenraupen in Versuchsgruppen verfüttert wurden. Gleichzeitig wurden die Veränderungen des Körpergewichts der Seidenraupen aufgezeichnet. Aufgrund der höchsten Bakterienpopulation im Verdauungstrakt der Seidenraupe im fünften Stadium64 wurden fünf lebende Seidenraupen in jeder Gruppe von zwei Rassen zufällig ausgewählt. Nach der Oberflächensterilisierung der Seidenraupenkörper mit 75 % Ethylalkohol wurden diese am Mitteldarm der Seidenraupe präpariert. Der Mitteldarminhalt wurde mit sterilen Spritzen entnommen und bei –80 °C gelagert.

Die Proben des Mitteldarminhalts von Seidenraupen stammten von YSY-Seidenraupen und HK2-Seidenraupen, vier Gruppen mit den Namen YSY, YSY-BS, HK2, HK2-BS, jede Gruppe mit fünf parallelen Individuen und insgesamt 20 Proben. Die folgenden Schritte wurden von Luojie (Jinan) Biological Medicine Co., Ltd. (Shandong, China) durchgeführt. Die Nukleinsäure in den extrahierten Proben wurde mit dem DNeasy PowerSoil Pro Kit (Qiagen, Kat.-Nr. 47016) analysiert. Nachdem die Integrität und Konzentration der Nukleinsäuren bestimmt worden war, wurden DNA-Proben mit High-Fidelity-Enzymen amplifiziert und ein Invitrogen Qubit 4.0-Fluorimeter zur Konzentrationsquantifizierung verwendet. Die Bibliothek wurde mit dem KAPA Hyper Prep Kit erstellt und mit Illumina NovaSeq sequenziert, um Rohdaten zu erhalten. Operationelle taxonomische Einheiten mit Nullradius (ZOTUs) wurden durch effektive Tags konstruiert, die nach einer Reihe von Datentrennung, Primerentfernung, PE-Lese-Spleißen, Tags mit Qualität und Länge, Filterung und Abfangen sowie Entfernung von Chimären erhalten wurden. Bakterien-Alpha-Diversitäts- und Beta-Diversitätsanalysen wurden von ZOTU erhalten. Die 16 S rDNA-Amplikonsequenzierung65 wurde verwendet, um den Unterschied in den Darmmikroben zwischen den Versuchsgruppen und Kontrollgruppen sowie die Veränderungen in der Zusammensetzung der Darmmikroben in unserem Experiment zu analysieren.

Die Genom-DNA-Extraktion: Die gesamte Genom-DNA aus Seidenraupen-Darmbakterien wurde mit dem DNeasy PowerSoil Pro Kit (Qiagen, Kat.-Nr. 47016) gemäß dem Extraktionsverfahren wie folgt extrahiert: Der Probe wird Lysepuffer in gemischten Zirkoniumperlenröhrchen zugesetzt und die Perlen werden geschlagen wird durch einen Tischvortex mit Perlrohradapter zur Homogenisierung durchgeführt. Das rohe Lysat wird zur Reinigung einer Inhibitorentfernung unterzogen und das gereinigte Lysat wird mit einem gleichen Volumen DNA-Bindungslösung gemischt. Das gemischte System durchlief eine Silica-Spinfiltermembran, die mit einem zweistufigen Waschprogramm gewaschen wurde. Anschließend wird ein 10 mM Tris-Elutionspuffer verwendet, um die an Silica gebundene DNA zu eluieren.

PCR-Reaktionssystem und Zyklusverfahren: 16S-rRNA-Gene unterschiedlicher Regionen (16S V3-V4) wurden mit spezifischen Primern (341 F (5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′) und 806 R (5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′) amplifiziert den Barcode. Die PCR-Reaktionen wurden mit 15 μl Phusion® High-Fidelity PCR Master Mix (New England Biolabs), 0,2 μM Vorwärts- und Rückwärtsprimern und etwa 10 ng Template-DNA durchgeführt. Der Thermozyklus bestand aus einer anfänglichen Denaturierung bei 98 °C °C für 1 Minute, gefolgt von 30 Denaturierungszyklen bei 98 °C für 10 Sekunden, Tempern bei 50 °C für 30 Sekunden und Elongation bei 72 °C für 30 Sekunden. Schließlich 72 °C für 5 Minuten.

Wir haben die Seidenraupen-Darmbakterien gemäß der beschriebenen Methode36 mit Modifikation isoliert. Kurz gesagt, es wurden fünf Seidenraupen ausgewählt, die 24 Stunden lang hungerten. Nachdem wir die Körperoberfläche der Seidenraupe mit 75 % Alkohol sterilisiert hatten, sezierten wir Seidenraupen und gewannen den Darminhalt der Seidenraupen. Es wurde unter aseptischen Bedingungen in ein 10-ml-EP-Röhrchen mit 5 ml sterilem Wasser gegeben. Die Darmflüssigkeit wurde durch eine 10-fache Verdünnungsmethode auf 10–1, 10–2 und 10–3 verdünnt. Die Darmflüssigkeit in jeder Konzentration von 100 μl wurde gleichmäßig auf eine NA-Mediumplatte aufgetragen und 12 Stunden lang bei 37 °C kultiviert. Kolonien mit unterschiedlicher Morphologie wurden zur weiteren Streifenbildung und Reinigung ausgewählt, bis sie durch Mikroskopie als einzelner Stamm nachgewiesen und zur 16S-rDNA-Sequenzierung und -Analyse an Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. geschickt wurden.

Die genomische DNA-Extraktion: Die genomische DNA der Seidenraupenstämme wurde mit dem Ezup Column Bacteria Genomic DNA Purification Kit (Sangon Biotech, Kat.-Nr. SK8255) gemäß dem Extraktionsverfahren wie folgt extrahiert: Die über Nacht kultivierte Bakterienlösung (1 ml) wurde zu 1,5 hinzugefügt ml-Zentrifugenröhrchen, zentrifugiert bei Raumtemperatur und 8000 U/min, um den Überstand zu verwerfen und Bakterien zu sammeln. Die Lösung grampositiver Bakterien wird mit 180 μl Lysozymlösung (20 mg/ml) versetzt, resuspendiert und 30–60 Minuten lang bei 37 °C gebadet. Der gramnegativen Bakterienlösung werden 180 μL Buffer Digestion zugesetzt. Den gesammelten Bakterien wird eine Proteinase-K-Lösung (20 μl) zugesetzt, gut gemischt und 1 Stunde lang bei 56 °C im Wasserbad gehalten, bis die Zellen vollständig lysiert sind. Anschließend werden dem Lysat nacheinander Puffer BD (200 μL) und wasserfreies Ethanol (200 μL) zugesetzt und gründlich gemischt. Die Mischung wird 2 Minuten lang auf die Adsorptionssäule geladen, dann 1 Minute lang bei Raumtemperatur und 12.000 U/min zentrifugiert und die Abfallflüssigkeit im Sammelröhrchen entleert. Fügen Sie PW-Lösung (500 μL) hinzu und zentrifugieren Sie 30 s lang bei 10.000 U/min, um das Filtrat abzulassen. Als nächstes fügen Sie Waschlösung (500 μl) hinzu, zentrifugieren und entfernen das Filtrat. Die Adsorptionssäule wurde in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen gegeben, mit CE-Puffer (50–100 μl) versetzt und 3 Minuten lang belassen, 2 Minuten lang bei 12.000 U/min bei Raumtemperatur zentrifugiert und die DNA-Lösung gesammelt.

PCR-Reaktionssystem und Zyklusverfahren: Die extrahierte bakterielle genomische DNA wurde als Matrize verwendet. Die PCR-Amplifikation wurde unter Verwendung der Universalprimer 27 F (5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′) und 1492 R (5′-GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3′) des bakteriellen 16 S-rRNA-Gens durchgeführt. 0,5 μL genomische DNA-Matrize (20–50 ng/μL), 0,5 μL Vorwärts- und Rückwärtsprimer (10 μM), 5 μL 10×PCR-Puffer (Mg2+ plus), 4 μL dNTP-Mischung (2,5 mM L−1) und TaqDNA-Polymerase (5 U μL−1) 0,2 μL, gefüllt mit sterilisiertem Reinstwasser auf 25 μL. Vordenaturierung bei 94 °C für 4 Minuten, Denaturierung bei 94 °C für 45 Sekunden, Glühen bei 55 °C für 45 Sekunden, Verlängerung bei 72 °C für 1 Minute, 30 Zyklen und Reparaturverlängerung bei 72 °C für 10 Minuten ; Anschließend bei 4 °C lagern. Die amplifizierten Produkte wurden durch 1 % AGAR-Gelelektrophorese (BBI, Kat.-Nr. AB0014) gereinigt und mit dem SanPrep Column DNAJ Gel Recovery Kit (Sangon Biotech, Kat.-Nr. SK8131) gewonnen.

Um den Einfluss der Glykosylierung der prenylierten Isoflavone auszunutzen, wurde ein Toxizitätstest an G. mellonella durchgeführt. G. mellonella als Insektenmodell wurde verwendet, um die Toxizität von Silexcrin B (2) und DPL (24) in vivo basierend auf einer beschriebenen Methodik38 mit Modifikation zu testen. Kurz gesagt, insgesamt vierzig Larven von G. mellonella mit einem Gewicht von 0,28–0,35 g wurden vor dem Experiment ausgewählt und zufällig in fünf Gruppen zu je 8 Gruppen aufgeteilt, einschließlich Vehikelkontrolle (wobei Lösungsmittel als Kontrolle diente), Silexcrin B ( 2) (40 μg/Tag für jede Larve), Silexcrin B (2) (80 μg/Tag für jede Larve), DPL (24) (40 μg/Tag für jede Larve) und DPL (24) (80 μg/Tag d für jede Larve). Silexcrin B (2) und DPL (24) wurden in 10 μL Lösung mit 5 % DMSO, 45 % PEG und 50 % normaler Kochsalzlösung gelöst. Larven in der Kontrollgruppe oder in den vier behandelten Gruppen wurden über das letzte rechte Vorderbein 10 μl der vorbereiteten Arzneimittellösung injiziert und sieben Tage lang kontinuierlich injiziert. Anschließend wurden sie im Dunkeln bei 35 °C inkubiert. Das Überleben der Seidenraupen wurde 7 Tage lang täglich überwacht. Die Überlebenskurve wurde mit GraphPad Prism 7 erstellt und das Log-Rank-Überlebensanalysemodell (Mantel‒Cox) verwendet.

HUVECs wurden vom Shanghai Institute for Biological Sciences (SIBS) der China Academy of Sciences (China) erhalten. Gemäß einer zuvor berichteten Methode66 waren die Kulturbedingungen von HUVECs RPMI-1640-Medium (HyClone), bestehend aus 10 % FBS (Sijiqing Company Ltd.), 100 Einheiten/ml Penicillin G und 100 μg/ml Streptomycin in einer Umgebung mit 5 % CO2 bei 37 °C. Zellen aus der HUVEC-Linie wurden zunächst in 96-Well-Platten mit 3–5 × 103 Zellen/Well ausgesät und über Nacht anhaften gelassen. Anschließend wurden unterschiedliche Konzentrationen von 33 Verbindungen und das Kontrollarzneimittel Adriamycin zugegeben, um die Inkubation für die angegebene Zeit fortzusetzen. MTT-Lösung (5,0 mg/ml) mit 12 μl wurde zugegeben, gefolgt von einer Inkubation für weitere 4 Stunden bei 37 °C. Anschließend wurde MTT mit DMSO aus dem Medium entfernt, bevor 150 μl/Vertiefung zu den violetten Formazankristallen gegeben wurden. Die optische Dichte wurde mit einem Mikroplattenlesegerät (Bio-Rad 680) bei 570 nm erfasst und mit GraphPad Prism 7 in IC50-Werte umgerechnet, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu bewerten. Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt.

Durch Vergleich mit der Vehikelkontrolle wurde das Hemmverhältnis der Zelllebensfähigkeit anhand der folgenden Gleichung 2 berechnet:

Zellapoptose und Zellzyklusstillstand wurden mittels Durchflusszytometrie gemäß der Literatur analysiert66,67,68 mit geringfügigen Änderungen wie folgt. Kurz gesagt, nach der Inkubation über Nacht wurden die Zellen 24 Stunden lang 5 % Serummedium mit Konzentrationen von 0, 2,5, 5 und 10 μM DPL (24) ausgesetzt und dann geerntet und mit PBS gewaschen. Nachdem der Überstand durch Zentrifugation entfernt worden war, wurden die Zellen in 400 μl Bindungspuffer resuspendiert und bei Raumtemperatur im Dunkeln 15 Minuten lang mit 5 μl Annexin V-FITC, gefolgt von 5 μl PI (50 mg/l), inkubiert. für weitere 5 Min. Das apoptotische Verhältnis wurde mittels Durchflusszytometrie (Becton Dickinson, USA) unter Verwendung der Software WinMDI 2.9 analysiert. HUVECs wurden 24 Stunden lang mit 0, 1,25, 2,5 oder 5 μM DPL (24) behandelt, und der Stillstand des Zellzyklus wurde durch Durchflusszytometrieanalyse gekoppelt mit PI-Färbung nachgewiesen.

Jedes Experiment wurde aus Gründen der Statistik und Reproduzierbarkeit mit mindestens drei biologisch unabhängigen Proben durchgeführt (n ≥ 3). Die Ergebnisse wurden für die Varianzanalyse verwendet und die Unterschiede zwischen den Mittelwerten wurden durch den Student-t-Test zwischen zwei Gruppen und eine einfache ANOVA zwischen mehreren Gruppen bewertet. P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Alle Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) angegeben.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Alle Datensätze, die die Ergebnisse dieser Studie unterstützen, finden Sie in den Abbildungen, Tabellen und ergänzenden Informationsdateien. Die zur Erstellung der Diagramme verwendeten numerischen Quelldaten sind in Supplementary Data 1 verfügbar. Die gesamten 16S-rRNA-seq-Rohdaten des Darmmikrobioms sind im Sequence Read Archive mit dem Zugangscode PRJNA985806 hinterlegt. Die Rohsequenzdaten von 16S-rDNA-Sequenzen wurden bei GenBank unter den Zugangscodes OR125545 (B. subtilis-Stamm), OR125546 (S. sciuri) und OR125547 (E. hormaechei) öffentlich zugänglich gemacht. Die Strukturaufklärung der Verbindungen 1–21 ist für Einzelheiten in den Ergänzenden Anmerkungen 1 zu finden, und die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Verbindungen 1–21 können in der Ergänzenden Anmerkung 2 eingesehen werden. Alle Daten sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Nr. 82173703, 81874293), dem National Key R&D Program of China (Nr. 2019YFA0905700), dem Major Basic Research Program der Shandong Provincial Natural Science Foundation (Nr. ZR2019ZD26) und der Stiftung unterstützt für innovative Forschungsgruppen des State Key Laboratory of Microbial Technology (Nr. WZCX2021-03). Wir danken den Mitarbeitern des Analyse- und Testzentrums der Shandong-Universität für die Sammlung der spektroskopischen Daten.

Abteilung für Naturstoffchemie, Schlüssellabor für chemische Biologie des Bildungsministeriums, Fakultät für Pharmazeutische Wissenschaften, Shandong-Universität, Jinan, 250012, VR China

Shuangzhi Yuan, Yong Sun, Wenqiang Chang, Jiaozhen Zhang, Minghui Song, Yanan Qiao, Chunyang Zhang, Mingzhu Zhu und Hongxiang Lou

Linyi University, Yishui, Linyi, 276400, VR China

Jifa Sang & Jiachun Zhao

Staatliches Schlüssellabor für mikrobielle Technologie, Shandong-Universität, Qingdao, 266237, VR China

Yajie Tang

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SY und HL haben die Studie entworfen. SY, YS, JS, JZ und MS führten die Experimente durch. SY, HL, YS, WC, JZ, YQ, CZ, YT und MZ analysierten die Daten; SY und HL haben das Manuskript erstellt.

Korrespondenz mit Hongxiang Lou.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Michael Wink und Magdalena Calusinska für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteur: George Inglis. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Yuan, S., Sun, Y., Chang, W. et al. Die Darmmikrobiota der Seidenraupe (Bombyx mori) ist an der metabolischen Entgiftung durch Glukosylierung von Pflanzentoxinen beteiligt. Commun Biol 6, 790 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-05150-0

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Eingegangen: 06. Dezember 2022

Angenommen: 17. Juli 2023

Veröffentlicht: 29. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-05150-0

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