Das 3D-In-vitro-Bindehautmodell in voller Dicke ermöglicht die Differenzierung von Becherzellen

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 12261 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die In-vitro-Kultur und Erzeugung hochspezialisierter Becherzellen stellt bei konjunktivalen 3D-In-vitro-Äquivalenten immer noch eine große Herausforderung dar. Ein Modell, das alle physiologischen Faktoren, einschließlich schleimsekretierender Becherzellen, umfasst, könnte als neue Plattform für Studien zu Bindehauterkrankungen dienen. Wir haben primäre Bindehautepithelzellen und Fibroblasten aus menschlichen Biopsien isoliert. 3D-Modelle wurden entweder aus Epithelschichten oder einer Kombination davon mit einem Bindegewebsäquivalent erstellt. Epithelmodelle wurden auf Markerexpression und Barrierefunktion untersucht. Vollwandmodelle wurden mittels Immunfluoreszenz und quantitativer Echtzeit-PCR auf Becherzellmorphologie und Markerexpression analysiert. Einfache Epithelmodelle, die an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche kultiviert wurden, zeigten geschichtete mehrschichtige Epithelien mit pathologischer Verhornung und ohne Becherzellbildung. Die Kombination mit einem Bindegewebsäquivalent zur Erzeugung eines Vollschichtmodells führte zur Bildung eines nicht keratinisierten geschichteten mehrschichtigen Epithels und induzierte die Differenzierung von Becherzellen. In unserem Modell wurde eine hohe Ähnlichkeit zur natürlichen Bindehaut durch die Kombination von Bindehautepithelzellen mit Fibroblasten erreicht, die in ein Kollagen-Hydrogel als Bindegewebsäquivalent eingebettet waren. Unser konjunktivales In-vitro-Äquivalent ermöglicht künftig die Untersuchung der Becherzelldifferenzierung, konjunktivaler Pathologien sowie Drogentests.

Die Bindehaut trägt zum Tränenfilm der Augenoberfläche bei, indem sie glättenden Schleim absondert1,2. Wesentliche Funktionen der Bindehaut sind der Schutz vor mechanischen und pathogenen Einflüssen sowie die Fähigkeit, durch IgE- und Eosinophil-regulierte Schleimproduktion auf Schadstoffe und Allergene zu reagieren3. Über diesen Mechanismus trägt die Bindehaut zum privilegierten Immunsystem der Augenoberfläche bei. Unerwünschte Einflüsse wie Schwankungen der Luftfeuchtigkeit, Erkrankungen des trockenen Auges, Allergene, Infektionen und Autoimmunreaktionen, z. B. Stevens-Johnson-Syndrom oder Schleimhautpemphigoid, können zur Zerstörung der Bindehaut und schließlich zur Erblindung führen4,5.

Im nicht keratinisierten Epithel aus 2 bis 9 Schichten geschichteter Plattenepithel- und Säulenzellen sind hochspezialisierte Becherzellen verstreut. Ihre abgesonderten Mucine tragen zum Tränenfilm bei und sorgen für eine glatte Augenoberfläche. Ein hoher Prozentsatz des inneren Teils von Becherzellen ist mit Vesikel gefüllt, die Schleim enthalten, während sich die Zellkerne auf ihrer Basalseite befinden6. Im Allgemeinen sind Mucine gewebeabhängig und werden in zwei Klassen eingeteilt: membranassoziierte und sezernierte Mucine. Im Zusammenhang mit dem Bindehautepithel wurden die membranassoziierten Mucine MUC1, MUC4 und MUC16 sowie das sekretierte gelbildende Mucin MUC5AC und das sekretierte lösliche MUC7 identifiziert1,7. Bindehautbecherzellen exprimieren hauptsächlich MUC5AC und in geringerem Maße MUC161,8,9. In den letzten Jahren wurden konjunktivale In-vitro-Testsysteme unter Verwendung von 2D- und 3D-Kulturen zur Behandlung von Konjunktivitis, trockenem Auge, Pterygium-Fibroblastenmigration, Fibrose und Arzneimittelabgabe entwickelt und haben wichtige Informationen geliefert10,11,12,13. Von verschiedenen Autoren wurden komplexe 3D-Modelle entwickelt, die die gesamte Bindehautstruktur umfassen, wobei ein Bindegewebsäquivalent als Gerüst für die darauf befindliche Epithelzellenkultur verwendet wurde. In diesen Studien wurden Gerüste aus Kollagen I, Fibrin oder dezellularisierter Bindehaut verwendet, während Kollagen I- und Fibrin-Matrizen Stromazellen umfassten14,15,16. Diese Modelle waren in der Lage, spezifische Fragen der Bindehautforschung zu beantworten, darunter Differenzierung, Entzündungsstudien und klinische Zwecke. Während in diesen Modellen Schleim über ELISA- und Alcianblau/PAS-Färbungen nachgewiesen werden konnte, sind Explantatkulturen schwer zu standardisieren und in vitro erzeugte Bindehautmodelle weisen einige, aber nicht alle Merkmale auf. Daher besteht weiterhin Bedarf an einem Modell, das ein mehrschichtiges, geschichtetes Epithel mit Becherzellen und einer spezifischen MUC5AC-Färbung in ihren becherartigen Strukturen kombiniert. Darüber hinaus bleibt die Kultivierung dieser spezialisierten Becherzellen aufgrund fehlender oder unbekannter Schlüsselfaktoren in ihrer Entwicklung eine große Herausforderung6.

Daher werden immer noch Tierversuche eingesetzt, um Wege der Becherzelldifferenzierung und die Pathophysiologie von Mucin-bedingten Erkrankungen im Allgemeinen zu untersuchen. Tiermodelle der Bindehaut umfassen eine große Vielfalt an Spezies wie Mäuse, Ratten, Meerschweinchen, Katzen, Kaninchen, Hunde und sogar nichtmenschliche Primaten. Die Auswahl der Tiere hängt von den physiologischen und biochemischen Eigenschaften sowie der Augengröße ab17,18. Im Allgemeinen werden biochemische Eigenschaften, Tränenfilm und Augengröße ähnlich dem menschlichen Gewebe bevorzugt. Dennoch bestehen bekannte Unterschiede zwischen Menschen und anderen Spezies fort, z. B. unterschiedliche Meibom-Lipidome und Tränenzusammensetzungen18,19,20,21,22,23. Es besteht Bedarf an der Weiterentwicklung von In-vitro-Lösungen mit Schlüsselfunktionen wie der Bildung von Becherzellen, um Krankheiten zu modellieren und Medikamente anhand hochprädiktiver Modelle zu testen. Wenn diese In-vitro-Modelle vollständig entwickelt sind, können sie die Arzneimittelentwicklung für verschiedene Krankheiten enorm verbessern, insbesondere im Zusammenhang mit personalisierten Behandlungen durch die Verwendung von Zellen, die von Patienten stammen. Letztendlich können diese In-vitro-Gewebe das Sprungbrett für gewebetechnisch hergestellte Implantate sein.

Bei der Entwicklung von konjunktivalen In-vitro-Modellen sind die Differenzierung von Becherzellen und Epithelzellen und der Nachweis von Muzinen die wichtigsten und schwierigsten Herausforderungen. Die Mechanismen hinter dieser Differenzierung sind nicht vollständig geklärt. Immunreaktionen, die die IL-4-, IL-13- und IgE-Spiegel erhöhen, sind mit einem Anstieg der MUC5AC-Expression in Bindehautepithelzellen verbunden, was auf eine Rolle im Differenzierungsprozess zu Becherzellen hindeutet24,25,26. Tian et al. zeigten, dass die Beeinflussung des Notch-Signals durch Gamma-Sekretase-Inhibitoren zur Differenzierung von Becherzellen in einem Bindehaut-In-vitro-Modell führen kann27. Nomi et al. beschrieben, dass die Zugabe von Wachstumsfaktoren wie dem Keratinozyten-Wachstumsfaktor (KGF) und dem epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) für die Differenzierungsprozesse von iPSC-abgeleiteten Bindehautepithelzellen von entscheidender Bedeutung ist28. Allgemeiner gesagt, Tsai et al. zeigten, dass Bindehautfibroblasten an der Differenzierung von Becherzellen beteiligt sind15. Bisher ist es nicht gelungen, in vitro ein komplexes Bindehautmodell mit ausreichender Becherzellmorphologie und Markerexpression in einem hochgeschichteten mehrschichtigen Epithel nachzubilden. Das in dieser Studie gezeigte Bindehautäquivalent zeigt eine umfassende Differenzierung und Markerexpression der Becherzellen und eröffnet neue Ansätze zur Entschlüsselung von Faktoren, die an der Entwicklung der Bindehautbecherzellen beteiligt sind. Es bietet auch ein neuartiges In-vitro-Modell für die Untersuchung von Erkrankungen des trockenen Auges, die die Anzahl der Bindehautbecherzellen beeinflussen29.

Alle Versuchsprotokolle wurden von der örtlichen Ethikkommission (Ethik-Kommission der Universität Würzburg, Genehmigungsnummer 280/18sc) genehmigt. Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Regeln für Untersuchungen an menschlichen Probanden durchgeführt, wie sie in der Deklaration von Helsinki festgelegt sind. Mit Einverständniserklärung von Patienten des Universitätsklinikums Würzburg wurden menschliche Bindehautbiopsien durchgeführt. Diese Biopsien stammten von erwachsenen Personen, die wegen eines Glaukoms einer Drainageoperation oder wegen einer Netzhautablösung einer Skleraknickoperation unterzogen wurden und keine andere Augenerkrankung aufwiesen. Insbesondere litt die Bindehaut nicht unter Erkrankungen wie Pterygium, Neoplasie, Pemphigoid oder erheblicher Entzündung. Für diese Studie wurden insgesamt 9 Biopsien verschiedener Spender verwendet.

Primäre Bindehautzellen wurden aus einzelnen menschlichen Gewebeproben isoliert und nicht gepoolt. Die Biopsien wurden in einer Dispase-Lösung (2 U/ml) 1 Stunde lang bei 37 °C oder über Nacht bei 4 °C inkubiert. Nach der Dispase-Verdauung wurden die Biopsien zum Waschen in PBS (ohne Calciumchlorid und Magnesiumchlorid) überführt. Epithelschichten wurden vorsichtig mit einer gebogenen Pinzette abgekratzt und in eine Petrischale mit Hornhautepithelzell-Basalmedium (A1: Corneal Epithelial Cell Basal Medium + Corneal Epithelial Cell Growth Kit, American Type Culture Collection, ATCC + 1 % Penicillin/Streptomycin (Sigma) überführt Aldrich, Darmstadt, Deutschland)). Das verbleibende Gewebe wurde 2 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) trypsiniert. Epithelzellen in A1-Medium wurden 5 Minuten lang bei RT mit 300 × g zentrifugiert und der Überstand entfernt. Das verbleibende trypsinierte Gewebe wurde ebenfalls 5 Minuten lang bei RT mit 300 × g zentrifugiert und der Überstand entfernt. Beide Proben wurden in 1 ml A1-Medium resuspendiert. Vor der Zellisolierung wurden zwei separate T25-Zellkulturflaschen mit 2 ml konjunktivalem Fibroblasten-konditioniertem Medium bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden menschliche Bindehautepithelzellen aus dem Schaben und Trypsinieren in einen T25-Kolben mit einem Gesamtvolumen von 3 ml überführt.

Zur Isolierung primärer menschlicher Bindehautfibroblasten wurde das verbleibende Gewebe in einer Kollagenase-A-Lösung (5 U/ml) bei 37 °C 1 Stunde lang verdaut, während das Röhrchen nach der Isolierung der Epithelzellen alle 15 Minuten gewirbelt wurde. Nach der Verdauung wurde das Röhrchen 5 Minuten lang bei RT mit 300 × g zentrifugiert und in 2 ml DMEM (Thermo Fisher, Waltham, USA) + 10 % FCS (Bio&SELL GmbH, Feucht, Deutschland) + 1 % Penicillin/Streptomycin (Sigma Aldrich) resuspendiert , Darmstadt, Deutschland), dann in einen T25-Kulturkolben ausgesät.

Für beide isolierten Epithelzellen und Fibroblasten wurde das Medium alle 2–3 Tage gewechselt. Epithelzellen erhielten 3,5 ml A1-Medium und Fibroblasten erhielten 3,5 ml DMEM.

Die Zellen wurden in einer Konzentration von 4.500 Zellen/cm2 in einer Kulturflasche ausgesät, vier Tage lang kultiviert, mit Accutase (Thermo Fisher, Waltham, USA) abgelöst und gezählt. Anschließend wurden die Zellen in einem neuen Kolben in der gleichen Konzentration ausgesät. Die Verdopplungszeiten wurden nach folgender Formel berechnet30:

Bindehautfibroblasten wurden in einer Kulturflasche in DMEM kultiviert. Das Medium wurde alle 2–3 Tage gewechselt. Nach Erreichen der Konfluenz wurde das Medium alle 24 Stunden gewechselt und das Medium gesammelt. Dieser Vorgang wurde 4 Tage lang wiederholt. Das gesammelte Medium wurde zweimal 5 Minuten lang bei 300 × g bei RT zentrifugiert und steril filtriert. Das konditionierte Medium wurde bei –20 ° C gelagert.

Zur Erzeugung von rhConE wurden ~ 70 % konfluente Epithelzellen in 24-Well-Brand-Einsätzen (BRAND Insert 2in1, für 24 Well, Bio-CERT CELL CULTURE STERILE, Brand, Wertheim, Deutschland) in einer Konzentration von 3 × 105 ausgesät Zellen (5 × 105 Zellen/cm2) ein Volumen von 300 µL PromoCell Keratinozyten-Wachstumsmedium 2 + SupplementMix + 1,5 mM CaCl2-Lösung (PromoCell, Heidelberg, Deutschland) (Pro2-Medium). Die Zellen wurden bis zur Passage 2 (p2) in 2D kultiviert, daher wurden sie in 3D-Modellen in p3 kultiviert. Nach 2 Stunden Adhäsionszeit wurden 1,4 ml Pro2-Medium in die Vertiefung gegeben. Nach 24 Stunden wurde eine Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche (Airlift) eingestellt. Airlift wurde als Tag 1 der Modellkulturzeit angesehen, an dem rhConE Pro2-Medium + 73 µg/ml Ascorbinsäure-2-phosphat (AA2P) + 10 ng/ml KGF (Pro3-Medium) oder Pro3-Medium + 10 % FibroLife-Medium (+) erhielt 2 % FCS, ohne Supplement LifeFactor, EGF-/TGF-β, Gentamicin und Amphotericin, Lifeline Cell Technology, San Diego, USA).

Für FTConM wurden 12 mm Snapwell™-Einsätze mit 0,4 μm Poren-Polycarbonatmembran verwendet (Corning Incorporated, Corning, USA). Als Bindegewebsäquivalent verwendeten wir 700 µl eines komprimierten Hydrogels aus gereinigtem Kollagen I, das aus Rattenschwänzen isoliert wurde, und kombinierten es mit 4,5 × 104 Fibroblasten (6,43 × 104 Zellen/ml), basierend auf einer Studie von Reuter et al. 31. Für eine submerse Kultur erhielten Bindegewebsäquivalente 250 µL DMEM apikal und 5 ml DMEM basolateral. Nach 4 Tagen untergetauchter Kultur wurde das gesamte Medium abgesaugt und 5,0 × 105 Epithelzellen auf das Bindegewebsäquivalent in 250 µL Pro2-Medium ausgesät. Nach 2 Stunden Adhäsionszeit wurden 2,5 ml Pro2-Medium in die Vertiefung gegeben. Nach 24 Stunden wurde ein Airlift eingestellt und das Medium auf Pro10-Medium umgestellt. Das Medium wurde alle 48–72 Stunden gewechselt.

An den jeweiligen Kulturtagen (Tage 10, 15 und 20) wurde ein Lebensfähigkeitstest für rhConE zusammen mit histologischen Analysen durchgeführt. MTT (3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromid) wird von lebenden Zellen in Formazankristalle umgewandelt, was durch mitochondriale Aktivität gesteuert wird32. Die Menge an lebenden Zellen korreliert mit dem Farbumschlag von Gelb nach Blau-Lila während der Inkubation mit dem Reagenz. Markeneinsätze wurden basolateral mit 200 μl vorgewärmter MTT-Lösung inkubiert. Nach 3-stündiger Inkubation bei 37 °C wurden die Einsätze in eine neue Vertiefung überführt. 500 μL Isopropanol wurden basolateral und apikal zugegeben. Die Platte wurde 1,5–2 Stunden lang auf einen Plattformschüttler gestellt, bis der gesamte Farbstoff aus dem Modell extrahiert war. Anschließend wurde 1 ml Isopropanol zum weiteren Spülen der Modelle verwendet. In einer 96-Well-Platte wurden dann 200 µL durch kolorimetrische Messung der Extinktion bei 570 nm analysiert (Tecan-Plattenlesegerät M Infinite nano, Männedorf, Schweiz).

Für histologische Analysen auf Paraffinobjektträgern wurden rhConE und FTConM 2–3 Stunden lang bei RT in Rotifix® (Carl Roth, Deutschland) fixiert. Anschließend wurden die Einsätze herausgeschnitten, in dH2O gewaschen und über eine Ethanol/Isopropanol-Reihe (50 %, 70 %, 80 %, 96 %, Isopronanol I, Isopropanol II) dehydriert. Der restliche Alkohol wurde mit Xylol entfernt, bevor die Sonden in Paraffin eingebettet wurden.

Mit einem Mikrotom (HistoCore AutoCut, Leica, Wetzlar (Deutschland)) wurden 3,5 µm dicke Schnitte aus Paraffingewebeblöcken geschnitten und auf SuperFrost-Objektträger (ThermoFisher Scientific, Waltham, USA) übertragen. Zur weiteren Färbung wurden die Schnitte bei 60 °C entparaffiniert und sofort zur Rehydratisierung in Xylol überführt, gefolgt von einer absteigenden Ethanolreihe und dH2O (96 %, 96 %, 70 %, 50 %, dH2O). Nach dem Färben der Schnitte mit entweder Hämatoxylin und Eosin (Morphisto, Offenbach am Main, Deutschland) oder einem Alcianblue-PAS, Kit (Anpassung: Mayer's Hematoxylin anstelle von GILL III, Morphisto, Offenbach am Main, Deutschland) wurden sie durch aufsteigendes Ethanol dehydriert /Isopronanol-Reihe und in Xylol überführt (70 %, 96 %, Isopronanol I, Isopronanol II, Xylol I, Xylol II). Anschließend wurden die Objektträger mit Entellan (Merck, Darmstadt, Deutschland) und Glasdeckgläsern eingedeckt.

Zur Bewertung der von rhConE und FTConM exprimierten Epithelmarker wurde eine Immunfluoreszenz an Paraffinschnitten und ganzen Präparaten durchgeführt. Paraffinschnitte wurden wie oben angegeben unter Verwendung von Polysine™-Adhäsionsmikroskopobjektträgern (epredia, Portsmouth, NH, USA) hergestellt. Für Whole-Mount-Färbungen wurden FTConM aus den Einsätzen herausgeschnitten und in der Carnoy-Fixierung fixiert, bis sie 30 Minuten lang bei RT bedeckt waren. Paraffinobjektträger wurden 20 Minuten lang in 5 % Serum (Esel) blockiert. Primärantikörper wurden aufgetragen und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Am folgenden Tag wurden die Objektträger dreimal 5 Minuten lang mit Waschpuffer gewaschen. Sekundärantikörper wurden aufgetragen und 1 Stunde bei RT inkubiert. Die Objektträger wurden erneut dreimal gewaschen und mit FluoroMount (Fluoromount-G mit DAPI, Thermo Fisher, Waltham (USA)) montiert.

Für Whole-Mount-Färbungen wurden die Modelle aus ihren Einsätzen herausgeschnitten und in einer 24-Well-Platte fixiert. Nach der Fixierung wurden die Modelle 30 Minuten lang mit 0,2 % Triton behandelt. Anschließend wurden die Sonden 5 Minuten lang mit Waschpuffer gewaschen. 5 %ige Blockierungslösung wurde 30 Minuten lang bei RT aufgetragen. Die Färbung mit primären und sekundären Antikörpern wurde ähnlich wie bei Paraffinobjektträgern durchgeführt. Anstatt zu montieren, wurden die Modelle in Kammerobjektträger überführt und mit FluoroMount abgedeckt. Primärantikörper: Cytokeratin 1 (Abcam, ab185628, Verdünnung 1:600), Cytokeratin 13 (Abcam, ab92551, Verdünnung 1:200), Cytokeratin 14 (Sigma-Aldrich, HPA023040, Verdünnung 1:1000), Cytokeratin 19 (Abcam, ab7754 , Verdünnung 1:100), MUC5AC (Invitrogen, MA5-12178, Verdünnung 1:100), Vimentin (Abcam, ab92547, Verdünnung 1:2000), E-Cadherin (BD Biosciences, 610181, Verdünnung 1:100). Sekundärantikörper: AlexaFluor® 488, 555, 647 (Verdünnung 1:400, LifeTechnologies, Carlsbad, CA, USA). Für histologische Analysen wurden Bilder aus repräsentativen Bereichen aufgenommen.

Mittels Impedanzspektroskopie wurde der transepitheliale elektrische Widerstand (TEER) bei einer Frequenz von 1000 Hz gemessen, um die Barrierequalität und Integrität von Gewebemodellen zu bewerten. Für die Barrierebewertung haben wir TEER1000-Hz-Werte definiert, um möglichst genaue Informationen über die Integrität eines mehrschichtigen Epithels zu erhalten33. Gewebemodelle wurden in eine 24-Well-Markenplatte überführt und erhielten basolateral und apikal 600 μl ihres jeweiligen Impedanzmessmediums. Eine TiN-Messplatte mit 24 Vertiefungen wurde verwendet, um die Amplitude und Phase der Modelle mit dem Impedanzanalysator LCR HiTESTER 3522-50 (HIOKI EE Corporation, Nagano (JP)) zu analysieren. Die Ergebnisse wurden mit der LabVIEW-Software angezeigt. Nach der Messung wurde das Medium aus den Modellen abgesaugt und dann in die vorherigen Well-Platten zurückübertragen.

Mit Zellen besäte Gerüste wurden in TRK-Puffer, ergänzt mit β-Mercaptoethanol, lysiert, mit einem Tissue Lyser (Qiagen) homogenisiert und die Gesamt-RNA wurde mit dem peqGOLD MicroSpin Total RNA Kit (VWR) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. 1 µg Gesamt-RNA wurde mit dem i-Script Reverse Transcription Supermix Kit (Bio-Rad) revers in cDNA transkribiert. Eine quantitative Echtzeit-PCR wurde mit 1 µL cDNA unter Verwendung des SsoFAST™ EvaGreen® Supermix (Bio-Rad) und des CFX 96 Touch™ Echtzeit-PCR-Cyclers (Bio-Rad) durchgeführt. Alle Läufe wurden bei einer Annealing-Temperatur von 60 °C durchgeführt und die Genexpression wurde in Bezug auf GAPDH (F-5'-GAAGGGCT CATGACCACAGT und R-5'-GGATGCAGGGATGATGTTCT) als Referenzgen gesetzt. Die verwendeten Primersequenzen (Eurofins, Deutschland) waren MUC5AC (F-5ʹ-GTTTGACGGGAAGCAATACA und R-5ʹ-CGATGATGAAGAAGGTTGAGG) und MUC16 (F-5ʹ-GCCTCTACCTTAACGGTT ACAATGAA und R-5ʹ-GGTACCCCATGGCTGTT GTG). Die fache Änderung der Genexpression wurde gemäß der ΔΔCT-Methode bewertet.

Die statistische Signifikanz von MTT-Assays, Impedanzspektroskopie und qRT-PCR wurde mittels Zwei-Wege-ANOVA-Tests analysiert. Werte von p < 0,05 wurden als signifikant angesehen. Für statistische Tests wurde die Software GraphPad Prism 8 verwendet (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA).

Zur Erstellung von Bindehautmodellen wurden zunächst isolierte Epithelzellen in einer 2D-Umgebung hinsichtlich ihrer Morphologie und ihres Wachstums charakterisiert. Hellfeldbilder von in Pro1-Medium kultivierten Epithelzellen wurden in den Passagen (p) 1–5 aufgenommen. Epithelzellen behielten ihre kopfsteinpflasterartige Morphologie bis p4 bei, wohingegen Zellen in p5 eine differenziertere Morphologie zeigten, die dadurch gekennzeichnet war, dass sie ihre kopfsteinpflasterartige Morphologie verloren und größere und gestreckte Zellformen zeigten (Abb. 1A). Die Verdopplungszeit von Epithelzellen wurde in drei verschiedenen Medien getestet: Pro1, E1 (EpiLife™ Medium (E) + Nahrungsergänzungsmittel für menschliches Keratinozytenwachstum (HKGS) + 1 % Penicillin/Streptomycin) und A1. In den früheren Passagen 2 und 3 zeigten Epithelzellen die geringste Verdopplungszeit, wenn sie in A1-Medium kultiviert wurden, während Zellen in Pro1 und E1 in den Passagen 4 und 5 im Vergleich zu A1 eine kürzere Verdopplungszeit zeigten (Abb. 1C).

Menschliche primäre Bindehautepithelzellen behalten in vitro spezifische Marker und Wachstum bei. Mikroskopische Charakterisierung isolierter menschlicher primärer Bindehautepithelzellen und ihrer Verdopplungszeit in drei verschiedenen Medien. (A) Lichtmikroskopische Aufnahmen von Epithelzellen aus den Passagen (p) 2–5. Maßstabsbalken = 100 µm. (B) Immunfluoreszenz (IF) von Cytokeratin (CK) 13 und CK19, durchgeführt an Epithelzellen, die nach 6 Tagen und 10 Tagen auf Glasdeckgläsern kultiviert wurden. Blau = DAPI, grün = entsprechendes Zytokeratin. Maßstabsbalken = 100 µm. (C) Zellverdopplungszeitdiagramm von Epithelzellen in drei verschiedenen Medien (Pro1, E1, A1), ausgewertet von p2 bis p5 (Mittelwert und Standardabweichung, n = 3).

Bindehautspezifische Zytokeratine (CK) 13 und 19 wurden mittels Immunfluoreszenz nach 6 Tagen und 10 Tagen 2D-Kultur positiv gefärbt, während mehr Zellen positiv für CK19 als für CK13 waren (Abb. 1B).

Unter 3D-Bedingungen kultivierte Bindehautepithelzellen wurden hinsichtlich ihrer Entwicklung mehrschichtiger Epithelien und Zelldifferenzierung untersucht. Die für den Wachstumstest verwendeten Mediumbedingungen wurden auch in der 3D-Kultur von Epithelzellen mit entsprechender Ergänzung für die 3D-Kultur getestet (+ CaCl2, + KGF, AA2P, siehe Methoden). Nach Einstellung einer Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche wurden rhConE nach 11 Tagen, 15 Tagen und 20 Tagen mittels Histologie und MTT-Assays bewertet. H&E-Färbungen zeigten, dass in allen drei Mediumformulierungen kultiviertes rhConE zu jedem Zeitpunkt ein mehrschichtiges Epithel mit geschichteten Zellen sowie keratinisierten Schichten entwickelte (Abb. 2A). MTT-Assays wurden auf Pro3-Medium normalisiert und zeigten keinen signifikanten Unterschied in der Lebensfähigkeit zwischen den verschiedenen Medien zu jedem Zeitpunkt der Kultur (Abb. 2C). An kultivierten Modellen wurde an mehreren Tagen während der gesamten Kulturzeit eine nicht-invasive Impedanzspektroskopie durchgeführt, die die zunehmende Barriereintegrität der Modelle demonstrierte. Analysen zeigten einen Barrierenanstieg in Modellen aller getesteten Bedingungen während der gesamten Kulturdauer, während TEER1000 Hz bei Kultivierung in A3-Medium am höchsten war. Dieser Effekt war besonders ab 11 Tagen zu beobachten (A3 = 1074 ± 424 Ω cm2, Pro3 = 291 ± 291 Ω cm2, E3 = 335 ± 186 Ω cm2), bis er nach 18 Tagen einen signifikanten Höhepunkt erreichte (A3 = 2992 ± 1259 Ω cm2, Pro3 = 1233 ± 874 Ω cm2, E3 = 1344 ± 442 Ω cm2) (Abb. 2D). Nach 20 Tagen Kultur zeigten die Modellbarrieren aller Bedingungen vergleichbare TEER-Werte.

Bindehautzellen reifen an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche und bilden ein mehrschichtiges Epithel. Bewertung verschiedener Medien auf rekonstruiertem menschlichem Bindehautepithel (rhConE). (A) Histologische Analyse mittels Hämatoxylin- und Eosin (HE)-Färbung von rhConE, kultiviert in Pro3-, E3- oder A3-Medium, nach 11 Tagen, 15 Tagen und 20 Tagen. Maßstabsbalken = 100 µm. (B) IF von CK1, CK13, CK14, CK19, durchgeführt auf rhConE, kultiviert in Pro3, E3 oder A3 nach 15 Tagen Kultur. Blau = DAPI, grün = entsprechendes Zytokeratin. Maßstabsbalken = 100 µm. (C) MTT-Assay von rhConE, kultiviert in E3- oder A3-Medium, normalisiert auf Modelle, die in Pro3 kultiviert wurden (n = 3). (D) Messung des transepithelialen elektrischen Widerstands (TEER) 1000 Hz von rhConE, kultiviert in Pro3, E3 oder A3 von 6 Tagen bis 20 Tagen Kultur (n = 3). *p < 0,05, ***p < 0,001.

Zur weiteren Auswertung wurden die konjunktivaspezifischen CK13, CK19 sowie die allgemeinen Epithelmarker CK1 und CK14 nach 15 Tagen in Kultur durch IF untersucht (Abb. 2B). Die allgemeinen Epithelmarker CK1 und CK14 waren für alle getesteten Mediumformulierungen und Zeitpunkte positiv. Während in allen Modellen bindehautspezifisches CK13 nachgewiesen wurde, konnte CK19 in allen getesteten Medien nur in einzelnen Zellen nachgewiesen werden (Abb. 2B). Insgesamt entwickelten Epithelmodelle ein dichtes mehrschichtiges Epithel zusammen mit einer spezifischen Markerexpression. In diesen Modellen konnte jedoch eine pathologische Keratinisierung und keine Becherzelldifferenzierung beobachtet werden.

Um die Bindehautumgebung wiederherzustellen und physiologische Bedingungen zu erreichen, haben wir ein Bindegewebsäquivalent erzeugt, indem wir in Kollagen Typ I eingebettete Fibroblasten mit Epithelzellen kombiniert haben. Diese Co-Kultur führte zu einem geschichteten mehrschichtigen Epithel aus 7–9 Zellschichten, ähnlich dem Epithelmodell allein, jedoch ohne Keratinisierung. Darüber hinaus begannen Bindehautepithelzellen mit der weit verbreiteten Becherzelldifferenzierung, durch die wir die Hauptzelltypen des Bindehautepithels erzeugten. Becherzellen zeichnen sich dadurch aus, dass sich ihr Kern an einem Zellpol befindet, während das meiste Volumen mit Schleimkörnchen gefüllt ist34. Diese morphologische Charakterisierung konnte innerhalb von FTConM beobachtet werden, während Alcianblau- und Perjodsäure-Schiff-Reaktionsfärbungen (PAS) zeigten, dass Schleim in Becherzellen auf der Oberseite des Epithels abgesondert wurde. Beide Färbungen umfassen die optimale Kombination von PAS, bei dem neutrale Muco-Polysaccharide violett gefärbt werden, während Alcianblau saure Schleimsubstanzen hellblau färbt. In der Kollagenmatrix wurde eine gleichmäßige Verteilung der Fibroblasten beobachtet. Ab Tag 10 der Kultur wurden deutliche morphologische Unterschiede beobachtet, die auf eine Becherzelldifferenzierung hinweisen, während Alcianblue und PAS eine Schleimsekretion zeigten. Nach 15 Tagen in Kultur differenzierten sich die Epithelzellen vollständig zu Becherzellen und bildeten mit Schleim gefüllte Vesikel (Abb. 3). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Einführung eines Bindegewebsäquivalents die Differenzierung von Becherzellen induzierte und zu 7–9 Zellschichten im FTConM-Epithel im Vergleich zu 4–6 in rhConE führte.

Durch die Kombination von Epithelzellen und Bindegewebsäquivalenten wurde die Anatomie in vivo nachgebildet. Histologische Analyse des Volldicken-Konjunktivalmodells (FTConM). H&E-, Alcianblau- und PAS-Färbungen wurden an Modellen nach 10 Tagen, 15 Tagen und 20 Tagen sowie an nativem Bindehautgewebe durchgeführt. Maßstabsbalken = 100 µm.

Als nächstes wurde die epitheliale Markerexpression von FTConM durch Immunfluoreszenz bewertet. Epithelschichten wurden auf die Keratinmarker CK1, CK13, CK14 und CK19 gefärbt. Alle getesteten Marker zeigten zu jedem getesteten Kulturzeitpunkt ein positives Signal. Mit der Reifung des Modells wurden CK1 und CK14 größtenteils in Basalzellen exprimiert (Tag 20), was der Expression von nativem Gewebe ähnelt. Signale der Bindehaut-spezifischen Marker CK13 und CK19 wurden in allen Epithelschichten nachgewiesen und konnten mit denen in nativem Gewebe verglichen werden (Abb. 2 vs. Abb. 4). Die Immunfluoreszenzfärbung von CK13 und insbesondere CK19 zeigte einen weiteren wichtigen Einfluss des Bindegewebsäquivalents. Während rhConE eine CK19-Expression nur in einzelnen Zellen zeigte (Abb. 2B), zeigten Epithelzellen in FTConM zu jedem getesteten Zeitpunkt eine hohe Expression von CK19 (Abb. 4). Zellverbindungen wurden mit E-Cadherin gefärbt, was auf eine Zellbarriere hindeutet. Darüber hinaus wurde der Fibroblasten-spezifische Marker Vimentin für jede Reifungszeit positiv gefärbt und konnte auch mit nativem Gewebe verglichen werden (Abb. 4).

Konjunktivalmodelle voller Dicke (FTConM) zeigten die Markerexpression in vivo. Immunfluoreszenzfärbung von CK1, CK13, CK14, CK19, Vimentin und E-Cadherin, durchgeführt auf FTConM nach 10 Tagen, 15 Tagen und 20 Tagen Kultur. Blau = DAPI, Grün = jeweiliges Cytokeratin/Vimentin, Rot = E-Cadherin. Maßstabsbalken = 100 µm.

Während CK13 und CK19 häufige Marker für Bindehautepithelzellen sind, ist der häufigste Marker für Bindehautbecherzellen MUC5AC, ein gelbildendes Muzin, das zur Glättung der Augenoberfläche beiträgt, was wir mittels Ganzkörper-Immunfluoreszenzfärbung und Genexpressionsanalysen untersucht haben. Konfokale Mikroskopie von Ganzkörperfärbungen zeigte ein MUC5AC-Signal um Kerne und mit MUC5AC gefüllte Vesikel von Becherzellen (Abb. 5A, ergänzende Daten S1). Darüber hinaus konnte durch die epithelspezifische Färbung von CK13 und MUC5AC gezeigt werden, wo die Basalschicht endet und das Bindegewebe beginnt (Abb. 5B, Zusatzdaten S1), da diese Marker ausschließlich im Bindehautepithel und nicht im Bindegewebe exprimiert werden substantia propria.

Konjunktivalmodelle voller Dicke (FTConM) induzierten die Bildung von Becherzellen und die Schleimproduktion. (A) Becherzellbildung in FTConM. Immunfluoreszenzfärbung von FTConM nach 20 Tagen Kultur. Blau = DAPI, Grün = CK13, Rot = MUC5AC. Maßstabsbalken = 50 µm. Nahaufnahme des Maßstabsbalkens = 25 µm. (B) 3D-Bild von FTConM nach 20 Tagen. Blau = DAPI, Grün = CK13, Rot = MUC5AC. Pfeil = Becherzelle. Maßstabsbalken = 100 µm. (C) Quantitative Echtzeit-PCR-Analyse von MUC5AC und MUC16 im Vergleich zu nativem Bindehautgewebe. Signifikanter Unterschied der MUC16-Expression zwischen 15 Tagen und nativem Gewebe (n = 3, *p < 0,05). Kein signifikanter Unterschied zwischen 20 Tagen und nativem Gewebe (n = 3, p = 0,491).

Die Genexpressionsanalyse von FTConM zeigte die MUC5AC-Expression zu allen getesteten Kulturzeitpunkten, während natives Gewebe eine deutlich höhere Expression als das Modell aufwies (Abb. 5C).

MUC16 ist eines der wichtigsten membranassoziierten Mucine der Augenoberfläche und wurde von Gipson et al. in konjunktivalen Becherzellen exprimiert werden9. Die quantitative Analyse zeigte einen signifikanten Unterschied zwischen der Expression des Modells am Tag 15 und nativem Gewebe (p < 0,05). Allerdings wurde nach 20 Tagen Kultur in FTConM ein Trend zu einer zunehmenden MUC16-Expression beobachtet, der keinen signifikanten Unterschied in den Expressionsniveaus im Vergleich zum nativen Gewebe zeigte (p = 0,491). Insgesamt konnten wir zeigen, dass das FTConM die konjunktivalen Becherzellmarker MUC5AC und MUC16 auf Gen- und Proteinebene exprimiert.

Um zu zeigen, welche Faktoren für die Induktion der Becherzelldifferenzierung in FTConM verantwortlich sind, wurden im Vergleich zu rhConE drei Variablen analysiert: Medien, Kollagen und Vorhandensein von Fibroblasten. Um den Einfluss des Mediums auszuschließen, erhielt rhConE wie FTConM Pro10-Medium. Im Vergleich zur Pro3-Kultur zeigte rhConE einen Anstieg der Basalzellen im Pro10-Medium. Neben einer Zunahme um 1–3 Zellschichten war in Pro10-kultivierten Modellen auch eine erhöhte Keratinisierung zu beobachten. Darüber hinaus zeigten in Pro10-Medium kultivierte rhConE-Modelle in allen Epithelschichten Zellen, die für Alcianblue und PAS positiv waren, während in Pro3-Medium kultivierte Modelle eine weniger intensive PAS-Färbung zeigten (Abb. 6A). Die Immunfluoreszenz zeigte positive Signale für CK1 und CK13 in allen Epithelschichten, während CK14 in Basalzellen nachgewiesen wurde. Bei der Kultivierung in Pro10-Medium zeigte rhConE in allen Schichten eine erhöhte CK19-Expression im Vergleich zu denen, die in Pro3-Medium kultiviert wurden (Abb. 6B vs. Abb. 2B). MTT-Assays bestätigten lebensfähige Zellen in allen getesteten Modellen. Unter beiden getesteten Bedingungen wurde kein signifikanter Einfluss auf die Lebensfähigkeit der Zellen beobachtet (Abb. 6C). Während der gesamten Kultivierungszeit zeigte die Messung von TEER1000 Hz eine Barriereentwicklung unabhängig vom verwendeten Medium (Abb. 6D). Während die TEER1000-Hz-Werte während der Kulturdauer keine signifikanten Unterschiede zeigten, neigten in Pro10 kultivierte Modelle am 15. Tag zu einer höheren Impedanz (Pro3 = 329 ± 208 Ω cm2 vs. Pro10 = 669 ± 170 Ω cm2), während in Pro3 kultivierte Modelle danach eine höhere Impedanz zeigten 20 Tage (Pro3 = 1145 ± 208 Ω cm2 vs. Pro10 = 555 ± 156 Ω cm2). Diese Ergebnisse untergraben den Unterschied zwischen Pro3- und Pro10-kultiviertem rhConE zu späten Kultivierungszeitpunkten, wie aus der histologischen Auswertung hervorgeht (Abb. 6A). Trotz der höheren PAS-Färbeintensität konnte durch die Kultivierung von Epithelmodellen in Pro10-Medium keine Becherzelldifferenzierung erreicht werden, was die Bedeutung des Bindegewebsäquivalents zeigt.

Eine Medienergänzung mit rhConE induziert keine Becherzelldifferenzierung. Medientest von Pro3 vs. Pro10 auf rhConE. (A) Histologische Analyse von in Pro3 oder Pro10 kultiviertem rhConE über H&E (linke zwei Spalten) und AB/P (rechte zwei Spalten) nach 10 Tagen, 15 Tagen und 20 Tagen Kultur. (B) Immunfluoreszenz von CK1, CK13, CK14 und CK19, durchgeführt an in Pro10 kultiviertem rhConE nach 15 Tagen. Blau = DAPI, grün = entsprechendes Zytokeratin. Maßstabsbalken = 100 µm. (C) MTT-Assay von Pro3 vs. Pro10 kultiviertem rhConE, gemessen über die optische Dichte von 570 nm Extinktion (n = 3). (D) TEER1000-Hz-Messung von rhConE, kultiviert in Pro3- oder Pro10-Medium über die Kulturzeit von 6 Tagen bis 20 Tagen (n = 3).

In dieser Studie haben wir ein In-vitro-Bindehautmodell voller Dicke entwickelt, das ein mehrschichtiges Epithel und schleimsezernierende Becherzellen umfasst. Wir verwendeten isolierte primäre Epithelzellen aus menschlichen Bindehautbiopsien. Epithelzellen behielten die Bindehautepithelmarker CK13 und CK19 und wurden bis zur Passage 5 in der 2D-Kultur vermehrt, was eine ausreichende Versorgung mit Zellmaterial für die Modellgenerierung ermöglichte. Die verschiedenen getesteten Medien zeigten nur einen geringen Einfluss auf die Zellen, was zeigt, dass HKGS (E-Medium), Bovine Hypophyse Extract (Pro- und A-Medium) und Corneal Epithelial Growth Factor (A-Medium) die Verdoppelungszeit nicht enorm verändern 2D-Bindehautepithelzellen. Diese Faktoren trugen auch nicht zur Becherzelldifferenzierung in 3D-rhConE bei.

Epithelzellen entwickelten ein differenziertes mehrschichtiges Epithel, was durch eine zunehmende Barrierefunktion während der Kultur und die Proteinexpression der Marker CK13 und CK19 angezeigt wurde. H&E-Färbungen zeigten, dass rhConE bis zu sechs Zellschichten aufbaute, während die oberen Schichten keratinisierten. Im Allgemeinen wird die Verhornung des Bindehautgewebes in vivo durch pathologische Ereignisse verursacht, z. B. durch Vitamin-A-Mangel oder Sjögren-Syndrom35,36. In unseren In-vitro-Modellen ist es wahrscheinlicher, dass suboptimale Kulturbedingungen zur Verhornung führten. Verschiedene Medien verbesserten diese nichtphysiologischen Merkmale nicht, was auf andere fehlende Hinweise hindeutet, die die Entwicklung von natürlichem Modellgewebe verhindern. Daher wurden unterstützende Faktoren wie die extrazelluläre Matrix (ECM) und Fibroblasten in das Modell einbezogen, da bekannt ist, dass diese die Differenzierung und Gewebeentwicklung beeinflussen können37,38.

Um ein reproduzierbares Bindegewebsäquivalent zu erzeugen, verwendeten wir ein komprimiertes Kollagen-I-Hydrogel mit eingebetteten Bindehautfibroblasten in Kombination mit Epithelzellen. In FTConM wurde ein mehrschichtiges Epithel beobachtet, das schleimgefüllte und schleimabgebende Becherzellen zeigte. Gleichzeitig war keine Keratinisierung mehr zu beobachten, was auf optimale Kulturbedingungen für die Reifung des Gewebes hindeutet. Die Differenzierung von Becherzellen wurde durch Morphologie, Alcianblau- und PAS-Färbung und MUC5AC-Nachweis nachgewiesen, dem häufigsten Marker für die Expression und Sekretion von konjunktivalen Becherzellen1. Neben einer qualitativen Auswertung der Becherzellen wurden MUC5AC und MUC16 mittels RT-qPCR analysiert. Beide Marker wurden im Modell zu allen getesteten Kulturzeitpunkten exprimiert. Für einen weiteren Vergleich zwischen rhConE und nativem Gewebe wurde die Zytokeratinexpression von CK1, CK13, CK14 und CK19 auf FTConM untersucht. Während CK1 und CK14 mit der Reifung des Modells hauptsächlich in Basalzellen exprimiert wurden, wurden CK13 und CK19 in allen Epithelschichten exprimiert. Im Vergleich zu rhConE waren die detektierten Signale von CK19 in FTConM deutlich stärker, was darauf hindeutet, dass FTConM eine Umgebung bietet, die eine natürlichere Entwicklung des Gewebes ermöglicht.

Der Vergleich zwischen rhConE und FTConM beweist die Bedeutung eines Bindegewebsäquivalents, das die Differenzierung von Becherzellen ermöglichte und dadurch unser Bindehautmodell entscheidend verbesserte. Einflussfaktoren, die die Becherzelldifferenzierung induziert haben, können auf drei Hauptkomponenten eingegrenzt werden. Unser Bindegewebsäquivalent umfasste Kollagen-I und Bindehautfibroblasten sowie zusätzliche Mediumzusätze. Während rhConE Pro3-Medium erhielt, erhielt FTConM Pro10-Medium, das zusätzlich Fibroblasten-Wachstumsfaktor-2 (FGF2) und kleine Mengen fetales Kälberserum (FCS) enthält. In einer Studie aus dem Jahr 2020 haben Yokoo et al. zeigten, dass FGF2 an der Differenzierung der Bindehautbecherzellen beteiligt sein kann39. In rhConE induzierte die FGF2-Supplementierung in Pro10-Medium keine Becherzelldifferenzierung. Andererseits wurde mit fortschreitender Kulturdauer ein Anstieg der Basalzellen in Pro10-kultiviertem rhConE beobachtet. Keratinisierte Schichten von Pro10 rhConE begannen sich nach 15–20 Tagen Kultur zu lösen und abzuschwimmen, während die Zellen AB/P-positiv waren. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Medienergänzung einen Einfluss auf rhConE hatte, die Epithelzellen jedoch nicht vollständig in Richtung Becherzelldifferenzierung verlagerte.

In einer aktuellen Studie haben Nomi et al. Zeigte, dass der Keratinozyten-Wachstumsfaktor (KGF) für die Entwicklung von menschlichen iPSC zu Bindehautepithelzellen, insbesondere Becherzellen, von entscheidender Bedeutung ist28. In unserem rhConE-Modell löste eine KGF-Supplementierung allein diesen Effekt nicht aus, was darauf hindeutet, dass für Primärzellen weitere Faktoren erforderlich sind. Auch kokultivierte Fibroblasten könnten einen großen Einfluss auf die Differenzierung haben. Tsai et al. zeigten, dass die Verwendung von Bindehautfibroblasten in einem Kollagen-I-Gel zu Alcianblau- und PAS-positiven Zellen einschließlich einer becherzellähnlichen Morphologie führte, während eine Co-Kultur mit 3T3-Zellen zu einem Epithel höherer Schichten, jedoch nicht zu Alcianblau und PAS-positiv führte Zellen15. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Bindehautfibroblasten Faktoren exprimieren, die die Differenzierung von Becherzellen induzieren. Die positive Wirkung kokultivierter Fibroblasten in einem Kollagen-Hydrogel konnte auch in unserem FTConM nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse legen nahe, dass eine Kombination aus ergänzenden und von Fibroblasten sezernierten Wachstumsfaktoren und ECM wichtig ist, um die natürliche Entwicklung des Bindehautgewebes wiederherzustellen. In unserem Modell haben wir eine Umgebung geschaffen, die eine solche natürliche Entwicklung ermöglicht. Daher können die Schlüsselfaktoren der Becherzelldifferenzierung weiter entschlüsselt werden. Darüber hinaus bietet unser Modell möglicherweise neue Möglichkeiten zur Reduzierung von Tierversuchen bei Bindehauterkrankungen.

Die Kombination aus einem mehrschichtigen Epithel, das Becherzellen mit becherartigen Strukturen umfasst, und der MUC5AC-Expression betont die physiologische Homöostase und unterscheidet es von den anderen In-vitro-Bindehautmodellen. Aktuelle konjunktivale In-vitro-Modelle zeigen die Expression spezifischer Marker wie CK19 und MUC5AC. Das Fehlen von mit Schleim gefüllten becherartigen Strukturen und die spezifische MUC5AC-Färbung oder die Darstellung eines mehrschichtigen Epithels nach der Differenzierung deuten jedoch darauf hin, dass Hinweise auf seine natürliche Physiologie fehlen14,27,40. Die Kombination aller physiologisch ähnlichen Faktoren in einem In-vitro-Modell ist eine Herausforderung. Witt et al. konnten diese Ergebnisse in einem In-vitro-Modell der menschlichen Bindehautexplantation an dezellularisierter Schweinebindehaut erzielen16. Mit dem Explantat konnten AB/P-positive Becherzellen beobachtet werden, obwohl MUC5AC im Modell nur an einzelnen Stellen angefärbt werden konnte. Diese Ergebnisse waren nicht reproduzierbar, da isolierte Epithelzellen auf dem Gerüst anstelle eines Explantats verwendet wurden16. Dennoch ist das Explantatmodell für seine klinischen Zwecke vielversprechend, da es sich um regenerative Methoden zur Behandlung von Bindehautnarben handelt. Für die Untersuchung von Bindehauterkrankungen in vitro wäre jedoch ein explantatfreies Modell aufgrund der besseren Reproduzierbarkeit und Gewinnung des Bindegewebsäquivalents, basierend auf einem definierten Kollagenhydrogel, besser geeignet. Sobald alle Schlüsselfaktoren entschlüsselt sind, die Bindehautepithelzellen in der 3D-Kultur in die Becherzelldifferenzierung überführen, können diese Kulturbedingungen in verschiedenen Forschungsbereichen der Bindehaut-In-vitro-Kultur übernommen werden und 3D-Modelle der physiologischen Ähnlichkeit und damit der physiologischen Ähnlichkeit einen entscheidenden Schritt näher bringen höhere Vorhersagbarkeit von Arzneimitteltests und Krankheitsmodellierung. Darüber hinaus werden Modelle zur Untersuchung von Bindehautfibrosen nach Glaukomoperationen entwickelt und untersucht. Zuletzt wurde von Kozdon et al. ein Schnittstellenmodell zwischen Zapfenkapsel und Bulbärbindehaut entwickelt, das Makrophagen enthält. und wurde auf seine mechanischen Eigenschaften getestet41. In Kombination mit unserem Modell könnten solche Experimente mit einem voll funktionsfähigen Epithel weiterentwickelt werden, um die Interaktion von Fibrose mit Epithelzellen in einem 3D-In-vitro-Modell zu analysieren.

In unserer Studie konnten wir alle konjunktivaspezifischen Faktoren kombinieren, einschließlich geschichteter mehrschichtiger Epithelien, die Becherzellen enthalten. Die Expression von Markern, die für die Differenzierung von Bindehautepithelzellen spezifisch sind, wurde auf der Ebene von Protein (Immunfluoreszenz) und mRNA (RT-qPCR) bestätigt. Mittels konfokaler Mikroskopie konnten wir MUC5AC-gefüllte Becherzellenbecher zeigen. Durch die Verwendung eines Stromaäquivalents erhöht unser Modell die Reproduzierbarkeit und Anwendbarkeit konjunktivaler In-vitro-Studien. Zukünftig könnte dieses Modell zur Untersuchung verschiedener Ursachen von Bindehauterkrankungen eingesetzt werden, um eine hochprädiktive, vom Menschen abgeleitete Grundlage für klinische Studien bereitzustellen und den zusätzlichen Vorteil zu haben, dass Tierversuche reduziert werden.

Die während der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Translational Center Regenerative Therapies (TLC-RT), Fraunhofer-Institut für Silicatforschung (ISC), Würzburg, Deutschland

Julian Schwebler, Christina Fey & Christian Lotz

Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin (TERM), Universitätsklinikum Würzburg, Würzburg, Deutschland

Christian Lotz

Abteilung für Augenheilkunde, Universitätsklinikum Würzburg, Würzburg, Deutschland

Julian Schwebler & Daniel Kampik

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JS verfasste das Hauptmanuskript und führte alle Experimente teilweise gemeinsam mit anderen Autoren durch. CF führte Experiment 5 durch und erstellte zugehörige Abbildungen und ergänzende Daten. DK stellte biologisches Material zur Verfügung und überwachte die Experimente. CL stellte Material für alle Experimente zur Verfügung und überwachte die Experimente. Alle Autoren haben an der Erstellung und Durchsicht des Manuskripts mitgewirkt.

Korrespondenz mit Christian Lotz.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Zusatzvideo 1.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Schwebler, J., Fey, C., Kampik, D. et al. Das 3D-In-vitro-Bindehautmodell in voller Dicke ermöglicht die Differenzierung von Becherzellen. Sci Rep 13, 12261 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-38927-8

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Eingegangen: 25. April 2023

Angenommen: 17. Juli 2023

Veröffentlicht: 28. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-38927-8

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