Entwicklung der Leber von Plasmodium falciparum - Zhejiang Hot Products Co., Ltd

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 4631 (2023) Diesen Artikel zitieren

1161 Zugriffe

13 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Die Entwicklung des Parasiten Plasmodium falciparum (Pf) in der Leber stellt den ersten Schritt des Lebenszyklus im menschlichen Wirt nach einem Pf-infizierten Mückenstich dar. Obwohl es sich um eine attraktive Phase für eine Unterbrechung des Lebenszyklus handelt, ist das Verständnis der Parasit-Hepatozyten-Interaktion aufgrund der Einschränkungen bestehender In-vitro-Modelle unzureichend. Wir untersuchen die Eignung von Hepatozyten-Organoiden (HepOrgs) für die Pf-Entwicklung und zeigen, dass diese Zellen die Invasion, Differenzierung und Reifung verschiedener Pf-Stämme durch Parasiten ermöglichten. Durch die Einzelzell-Messenger-RNA-Sequenzierung (scRNAseq) von Pf-infizierten HepOrg-Zellen wurden 80 Pf-Transkripte identifiziert, die am Tag 5 nach der Infektion hochreguliert waren. Es wurden Änderungen des Transkriptionsprofils gefunden, die unterschiedliche Stoffwechselwege in Hepatozyten betreffen, wobei die Transkripte des Scavenger-Rezeptors B1 (SR-B1) stark hochreguliert sind. Eine neuartige funktionelle Beteiligung an der Schizontenreifung wird in frischen primären Hepatozyten bestätigt. Somit bieten HepOrgs eine solide Grundlage für ein vielseitiges In-vitro-Modell für Pf-Leberstadien, das grundlegende biologische Studien und eine beschleunigte klinische Entwicklung neuartiger Instrumente zur Malariakontrolle ermöglicht.

Malaria ist eine der größten Infektionskrankheiten weltweit und mit 247 Millionen Fällen und 619.000 Todesfällen im Jahr 2021 für eine große und zunehmende Krankheitslast verantwortlich, insbesondere in Afrika südlich der Sahara. Obwohl mehrere Plasmodium-Arten den Menschen befallen können, wird der Großteil der Krankheitslast durch Malaria verursacht Plasmodium falciparum (Pf). Malaria wird durch eine kleine Anzahl leberinfektiöser Pf-Parasiten (Sporozoiten) übertragen, die von einer infizierten weiblichen Mücke während der Einnahme einer Blutmahlzeit in die Haut des menschlichen Wirts injiziert werden. Innerhalb von maximal wenigen Stunden gelangen zahlreiche dieser Sporozoiten über den Blutkreislauf in die Leber und dringen in die Hepatozyten ein. Nach einem klinisch stillen Zeitraum von sieben Tagen der intrazellulären Replikation und Differenzierung kann jeder Sporozoit schätzungsweise 10.000 blutinfektiöse Tochterparasiten (Merozoiten) hervorbringen. Diese Merozoiten werden aus aufgebrochenen Hepatozyten in den Blutkreislauf freigesetzt, wo sie ihren 48-Stunden-Zyklus der asexuellen Replikation in zirkulierenden roten Blutkörperchen beginnen, der für die klinische Erkrankung verantwortlich ist.

Angesichts der geringen Anzahl injizierter Sporozoiten stellt diese frühe Phase der Infektion des menschlichen Wirts ein relativ anfälliges und kritisches Stadium im Lebenszyklus des Parasiten dar, bevor bei Malaria im Blutstadium große Parasitenmengen entstehen. Daher wäre die Verfügbarkeit hochwirksamer Medikamente und/oder Impfstoffe gegen diese Parasiten-Leberstadien ein großer Vorteil für die Malariakontrolle und -eliminierung. Ein wesentlicher Faktor ist das mangelnde Verständnis der grundlegenden Biologie der dynamischen Interaktion zwischen sich entwickelnden Parasiten in befallenen Hepatozyten. Dies kann am besten durch eine unvoreingenommene Untersuchung des Transkriptoms/Proteoms von Wirt und Parasit während eines Infektionsprozesses erreicht werden. Ein Haupthindernis ist das Fehlen repräsentativer In-vitro-Leberzellkulturen, die eine vollständige Pf-Entwicklung umfassen. Kryokonservierte primäre menschliche Hepatozyten wurden verwendet, weisen jedoch eine schwankende und geringe Zulässigkeit auf, sodass für eine solche Analyse nicht genügend Material zur Verfügung steht2. Alternativ sind der Zugang und die Verfügbarkeit frisch isolierter primärer menschlicher Hepatozyten begrenzt. Hepatozyten aus beiden Quellen können nur für eine begrenzte Anzahl von Tagen in Kultur gehalten werden. Schließlich ist die Verwendung von Leberzelllinien, einschließlich HC-04, größtenteils auf die Untersuchung der frühesten Ereignisse der Parasiten-Hepatozyten-Interaktion (d. h. Durchquerung und Invasion) beschränkt, obwohl über eine vollständige Entwicklung berichtet wurde3.

Organoide sind dreidimensionale Strukturen, die aus Stammzellen oder Primärgeweben gewonnen werden und wichtige architektonische und funktionelle Aspekte des untersuchten Organs/Gewebes nachbilden. Wenn diese In-vitro-Strukturen aus adulten Stammzellen gewonnen werden, können sie über lange Zeiträume expandiert werden4. Wir haben kürzlich ein Protokoll zur Züchtung von Organoiden aus menschlichen Hepatozyten5 erstellt. Diese Organoide können aus einzelnen Hepatozyten hergestellt und über mehrere Monate gezüchtet werden, wobei wichtige morphologische, funktionelle und Genexpressionsmerkmale erhalten bleiben. Die Transkriptionsprofile der Organoide ähneln denen proliferierender Hepatozyten nach partieller Hepatektomie. Menschliche Hepatozyten-Organoide (HepOrgs) vermehren sich nach der Transplantation in Mäuse stark. Wir haben eine umgekehrte Korrelation zwischen dem Alter des Spenders und der Länge der exponentiellen Expansionsphase beobachtet. Tatsächlich ergeben fötale Hepatozyten organoide Linien, die unbegrenzt ausgedehnt werden können, während sie dennoch den primären Hepatozyten (HuHeps) sehr ähneln6.

Hier zeigen wir die Pf-Zulässigkeit einer Reihe differenzierter HepOrgs. Darüber hinaus wurde die Einzelzell-Messenger-RNA-Seq sowohl an nicht infizierten als auch an infizierten HepOrgs durchgeführt, um Profile von hoch- und herunterregulierten Gentranskripten sowohl von Pf als auch von Wirtszellen, die reife Schizonten enthalten, zu untersuchen. Transkripte des Scavenger-Rezeptors B1 (kodiert durch das Gen SCARB1; Protein, das als SR-B1 bezeichnet wird) werden hochreguliert und eine neue kritische Funktion dieses Leberproteins für die Pf-Entwicklung wird anschließend in frischen primären HuHeps bestätigt.

Vier verschiedene fetale HepOrg-Linien (KIFM, KK2, KK3 und KU1) wurden mit PfNF175-Sporozoiten7,8 infiziert. Die Infektionsraten wurden am Tag 5–8 nach der Infektion (pi) durch Bestimmung der Anzahl der PfHSP70-positiven Schizonten bestimmt (Abb. 1A). In allen vier HepOrg-Linien wurde eine Infektionsrate zwischen 0,5 und 1 % ermittelt, was niedriger ist als bei frisch isolierten primären HuHeps7.

Ein Prozentsatz der Wirtszellen (HepOrgs) mit NF175-Schizonten. Jeder Balken stellt den Durchschnitt der Dreifachproben dar, während für Tag 8 nur Duplikate angezeigt werden. (n = 4 Spender; KIFM, KK2, KK3 und KU1; Fehlerbalken ist der Mittelwert ± SD von drei technischen Replikaten). B Die Größe der NF175-Schizonten in HepOrg-Experiment A und B im Vergleich zu HuHeps. Jeder Punkt repräsentiert den Mittelwert von >100 Schizonten aus drei biologischen Replikaten mit Standardabweichung. Für HepOrg A stellt jeder Punkt den Durchschnitt des Medians von KK2, KIFM, KU1 dar, wobei zu jedem Zeitpunkt >25 Schizonten für jede Linie gemessen werden. Für HepOrg B stellt jeder Punkt den Durchschnitt des Medians von KIFM, KK2, KK3 und KU1 dar, wobei zu jedem Zeitpunkt > 100 Schizonten für jede Linie gemessen werden. Die Flächen unter den Schizonten-Wachstumskurven von Huheps bzw. HepOrg A (p = 0,001; n = 4 Spender) und HepOrg B (p = 0,0002; n = 4 Spender) unterschieden sich signifikant (Welch-t-Test, zweiseitig). C Konfokale Bilder von HepOrgs und D HuHeps am Tag 5 pi, die die Expression typischer Leberstadium-Marker zeigen; Von oben nach unten: Circumsporozoite-Protein (CSP), Exportiertes Protein 2 (EXP2), Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) und menschliche Glutamin-Synthetase (hGS). Der Maßstabsbalken beträgt 25 Mikrometer. E Konfokale Bilder von Merozoite Surface Protein 1 (PfMSP1) in Schizonten von HuHeps (oben) und HepOrgs (unten) am Tag 7–9 pi. Der Maßstabsbalken beträgt 25 Mikrometer. Für C, D und E wurden diese Färbungen in drei unabhängigen Experimenten wiederholt und hier wird für jede Färbungskombination ein repräsentatives Bild gezeigt. F Der durchschnittliche Prozentsatz mit Standardabweichung von PfMSP1-positiven Schizonten aus HepOrg B (n = 4; KIFM, KK2, KK3, KU1) und HuHep (n = 3) bewertete > 100 Schizonten pro Linie und Zeitpunkt. Siehe auch Abb. S1.

Die Größen der HepOrg-Schizonten unterschieden sich in zwei unabhängigen Experimenten (HepOrg A und HepOrg B) an den Tagen 3, 5 und 7 pi nicht signifikant von denen in primären HuHeps (Abb. 1B). Darüber hinaus zeigten Schizonten eine ähnliche Expression typischer Marker im Pf-Leberstadium, einschließlich Circumsporozoit-Protein (PfCSP), exportiertem Protein 2 (PfEXP2) und Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (PfGAPDH) (Abb. 1C, D; Tabelle 1). Schließlich zeigten HepOrg-Schizonten am 7. und 8. Tag pi das typische Merozoiten-Oberflächenprotein 1 (PfMSP1), was auf die Reifung hinweist (Abb. 1F).

Als nächstes untersuchten wir die Empfindlichkeit von NF175-HepOrg-Schizonten gegenüber Atovaquon, einem etablierten Medikament mit Anti-Leber-Stadium-Aktivität2 (Abb. S1). Die Behandlung mit Atovaquon (10 nM und 50 nM) reduzierte die Infektionsrate um mehr als 75 %, was den Ergebnissen bei HuHeps ähnelt2,9. Auch die übrigen Schizonten zeigten eine 90-prozentige Verkleinerung. NF175 war sowohl in HepOrgs als auch in kryokonservierten HuHeps nicht empfindlich gegenüber Pyrimethamin. Die kombinierten Daten zeigen, dass Pf-Sporozoiten HepOrgs infizieren und sich dort entwickeln, während sie gleichzeitig auf das etablierte leberschizontizide Medikament Atovaquon ähnlich ansprechen.

Als nächstes untersuchten wir Wirtszelltranskripte in NF175-infizierten HepOrgs und verwendeten fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS), um einzelne Zellen (sowohl infizierte als auch nicht infizierte) zu erhalten (Abb. S2). Isolierte primäre Hepatozyten dedifferenzierten schnell in einem 2D-Format in einem Prozess, der als epithelial-mesenchymaler Übergang bekannt ist10. Dies trat auch bei differenzierten HepOrgs auf, was sich in einer Verringerung des Albuminspiegels zeigte, wenn sie in einem Medium kultiviert wurden, das das Wachstum von Schizonten begünstigt (Abb. S2E). Zur Bewertung transkriptomischer Veränderungen in Hepatozyten während der intrazellulären Parasitenentwicklung testeten wir eine Reihe von Medien mit dem Ziel, den hepatischen Phänotyp (Albumin-Auslesung) aufrechtzuerhalten und gleichzeitig die Parasitenentwicklung zu ermöglichen; Es wurde eine Mischung aus Williams B (WLB) und HuHeps-Lebermedium (HLM) im Verhältnis 1:1 ausgewählt (Abb. S2C–E). Insgesamt wurden 1920 Zellen 4 und 5 Tage pi isoliert und durch Sortieren und robotergestützte Transkriptomsequenzierung (SORT-seq)11 verarbeitet. Die Sequenzen wurden auf Referenzgenome menschlichen und Pf-Ursprungs abgebildet und mit Seurat v412 analysiert. Einzelzell-Genexpressionsprofile der menschlichen Lesevorgänge (n = 1277 Zellen), gruppiert in 5 Hauptcluster (Abb. 2A, Abb. S3A – C, Zusatzdaten 1, 5 und 6). Die Cluster 0, 1, 2 und 3 exprimierten stark ALB und AFP, zwei Marker für differenzierte Hepatozyten (Abb. 2A, B). Cluster 2 war mit MKI67-exprimierenden proliferativen Hepatozyten angereichert (Abb. 2A, B). Zellen in Cluster 3 zeigten die höchsten Transkriptzahlen von ALB und AFP sowie anderen Hepatozyten-Differenzierungsmarkern, was auf eine Anreicherung der am stärksten differenzierten Hepatozyten schließen lässt (Abb. 2A – C, Abb. S4). Cluster 4 enthielt Zellen, die hohe Mengen an Cholangiozyten-Abstammungsmarkern EPCAM und KRT7 exprimierten (Abb. 2A, B, Abb. S5). Die Verhältnisse der Hauptzellcluster waren zwischen Testproben (Zellen, die Pf-Parasiten ausgesetzt waren) und nicht infizierten Kontrollen konsistent (Abb. S3D, E).

Eine t-SNE-Karte, die die Seurat-Cluster und die wichtigsten Zelltypen im vom Menschen gelesenen Datensatz zeigt (n = 1277 Zellen; Cluster 0, n = 571 Zellen; Cluster 1, n = 426 Zellen; Cluster 2, n = 117 Zellen; Cluster 3). , n = 100 Zellen; Cluster 4, n = 63 Zellen). B Violindiagramm, das die Genexpression des Abstammungsmarkers pro Seurat-Cluster zeigt. C Violindiagramm, das die Anreicherungswerte der Hepatozyten-Gensignatur pro Seurat-Cluster zeigt. D-t-SNE-Karte, die die Infektionsraten der Zellen hervorhebt (keine, n = 786 Zellen; niedrig, n = 269 Zellen; hoch, n = 222 Zellen). E Säulendiagramm, das die Zellanteile pro Seurat-Cluster und die Infektionsrate zeigt. Säulendiagramm, das die Zellanteile pro Infektionsrate und F-Seurat-Cluster oder G-Sammeltag (4 oder 5 Tage pi) zeigt. H t-SNE-Karte, die die SCARB1-Expression zeigt. Violindiagramme, die die SCARB1-Expression pro I-Seurat-Cluster und die J-Infektionsrate zeigen. Zweiseitiger Mann-Whitney-U-Test (Wilcoxon-Rangsummentest): ns p ≥ 0,05, ****p < 0,0001. Die Statistiken für C und I wurden im Vergleich zu Cluster 3 berechnet. C p < 2–16 (alle Vergleiche); I p < 2–16 (gegenüber Cluster 0), p = 3,1–13 (gegenüber Cluster 1), p = 8,6–8 (gegenüber Cluster 2), p = 2,7–12 (gegenüber Cluster 4); J p = 0,53 (keine vs. niedrig), p < 2,22–16 (keine vs. hoch), p = 1,9–14 (niedrig vs. hoch). Boxplots in C, I und J zeigen den Median (Q2), das 25. Perzentil (Q1) und das 75. Perzentil (Q3), wobei die Whiskers das Minimum (Q1 – 1,5 × Interquartilsabstand) und das Maximum (Q3+ 1,5 × Interquartilsabstand) anzeigen. Siehe auch Abb. S2–S6, S11 und Zusatzdaten 1. Quelldaten werden als Quelldatendatei und Zusatzdaten 5 bereitgestellt.

CD81 ist ein gut etablierter Wirtszellligand für den Pf-Hepatozyteneintritt13,14,15, während eine ähnliche, wenn auch umstrittene Rolle für SR-B1 (kodiert durch das Gen SCARB1) und EphA216,17,18 vorgeschlagen wurde. Sowohl die CD81- als auch die EPHA2-Expression waren in Cluster 3 am niedrigsten (Abb. S6A, B), während die SCARB1-Expression (kodierend für SR-B1) in diesem Cluster am höchsten war (Abb. 2H, I). Cluster 3 wies die höchste Anzahl infizierter Zellen auf (Abb. 2D–F) und entsprechend war die SCARB1-Expression in stark infizierten Zellen (d. h. Zellen mit hohen Parasitentranskriptzahlen) im Vergleich zu nicht infizierten Zellen oder Zellen mit niedrigem Parasitentranskript signifikant erhöht zählt (Abb. 2J). Im Gegensatz dazu wurden die niedrigsten Transkriptzahlen für CD81 und EPHA2 in stark infizierten Zellen gefunden (Abb. S6A, B). Darüber hinaus korrelierte die SCARB1-Expression stark mit den Hepatozytenmarkern ALB, AFP und RBP4 (r ~ 0,5), während sie mit den Cholangiozytenmarkern EPCAM, KRT19 und KRT8 (r <–0,2) mäßig negativ korrelierte (Abb. S6C). Die kombinierten Daten zeigen, dass sich Pf-Parasiten in allen fünf identifizierten Zellclustern entwickeln, mit einer starken Präferenz für reife Hepatozyten, wie durch Cluster 3 dargestellt.

Auf der Suche nach möglichen Wirtszellunterschieden zwischen infizierten und nicht infizierten HepOrgs haben wir den Datensatz hochinfizierter Zellen (n = 348 Zellen) am Tag 5 pi in Subcluster unterteilt (Abb. 2G, A). Gene wurden in infizierten Hepatozyten im Vergleich zu nicht infizierten Hepatozyten unterschiedlich exprimiert (DE) und zeigten 674 hochregulierte bzw. 1218 herunterregulierte Transkripte in infizierten Zellen (Abb. 3B, ergänzende Daten 2). Gene, die mit dem Lipidstoffwechsel assoziiert sind, einschließlich APOA1, APOB, FASN, MTTP und PPARA, sowie Gene, die mit der Glykolyse in Zusammenhang stehen, wie etwa G6PC, waren in infizierten Hepatozyten signifikant hochreguliert (Abb. 3C, Zusatzdaten 2). Eine unvoreingenommene Analyse mit EnrichR19 ergab, dass Gene im Zusammenhang mit dem Cholesterinstoffwechsel (WP4718), dem PPAR-Signalweg (WP3942), der nichtalkoholischen Fettlebererkrankung (WP4396), dem Stoffwechselweg von LDL, HDL und TG, einschließlich verwandter Krankheiten (WP4522), und Fettsäuren stehen Biosynthese (WP357), Glykolyse und Gluconeogenese (WP534), Kernrezeptoren im Lipidstoffwechsel und in der Toxizität (WP299) sowie die Betaoxidation von Fettsäuren (WP143) waren in infizierten Hepatozyten signifikant hochreguliert (Supplementary Data 3). Die kombinierten Daten deuten darauf hin, dass eine Pf-Infektion Veränderungen im Stoffwechsel des Wirts hervorruft, die dem Energieverbrauch Rechnung tragen.

Eine t-SNE-Karte von Zellen am Tag 5 pi, die den Infektionszustand zeigt (nicht infizierte Zellen, n = 222; infizierte Zellen, n = 126). B Heatmap, die unterschiedlich exprimierte (DE) Gene zwischen infizierten und nicht infizierten Zellen zeigt. C Violindiagramme, die eine Auswahl von DE-Genen zwischen infizierten und nicht infizierten Zellen zeigen. Zweiseitiger Mann-Whitney-U-Test (Wilcoxon-Rangsummentest): **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. CPT1A, p = 3,3−5; FASN, p = 5,8−10; APOA1, p > 2,22−16; HMGCR, p = 0,0062; G6PC, p = 0,0011; PCSK9, p = 2−10; APOB, p > 2,22−16; PPARA, p > 2,22−16; LSS, p = 1,3−7; MTTP, p > 2,22−16. Boxplots in C zeigen den Median (Q2), das 25. Perzentil (Q1) und das 75. Perzentil (Q3), wobei die Whiskers das Minimum (Q1 – 1,5 × Interquartilsabstand) und das Maximum (Q3 + 1,5 × Interquartilsabstand) zeigen. Siehe auch Zusatzdaten 2 und 3. Quelldaten werden als Quelldatendatei und Zusatzdaten 5 bereitgestellt.

Schließlich zeigte das Pf-Transkriptom in infizierten HepOrgs am Tag 5 pi eine signifikante Hochregulierung von mehr als achtzig Markern, einschließlich leberstadienspezifischem CSP, LISP1 und SLARP (Abb. 4A, C, D und ergänzende Daten 4). Das Expressionsprofil unterschied sich auch von dem, das von Parasiten im Blutstadium erzeugt wurde (Abb. 4B, C, Zusatzdaten 4, Zusatzdaten 7).

A, B Von Parasiten abgeleitete t-SNE-Karten einzelner Zellen, die Seurat-Zellcluster zeigen (A; n = 395 Zellen; Cluster 0, n = 109 Zellen; Cluster 1, n = 90 Zellen; Cluster 2, n = 66 Zellen; Cluster 3, n = 63 Zellen; Cluster 4, n = 36 Zellen; Cluster 5, n = 31 Zellen) und infizierte HepOrg-Zellen (Pf-Leberstadium; n = 40 Zellen) oder Erythrozyten (Pf-Blutstadium; n = 355 Zellen), bzw. B. Cluster 4 ist mit infizierten Zellen von HepOrgs angereichert, während die restlichen Cluster hauptsächlich rote Blutkörperchen enthalten. C Heatmap, die unterschiedlich exprimierte (DE) Gene zwischen Leber- und Blutstadium zeigt. D Violindiagramme, die DE-Gene zeigen, die im Leberstadium im Vergleich zum Blutstadium angereichert sind. Zweiseitiger Mann-Whitney-U-Test (Wilcoxon-Rangsummentest): *p < 0,05. CSP, p = 0,019; LISP1, p = 0,031; SLARP, p = 0,031. Boxplots in D zeigen den Median (Q2), das 25. Perzentil (Q1) und das 75. Perzentil (Q3), wobei die Whiskers das Minimum (Q1 – 1,5 × Interquartilsabstand) und das Maximum (Q3 + 1,5 × Interquartilsabstand) zeigen. Siehe auch Ergänzende Daten 4. Quelldaten werden als Quelldatendatei und Ergänzende Daten 7 bereitgestellt.

SR-B1 ist ein bekannter Wirtsfaktor, der an der Invasion von Leberzellen durch Plasmodium-Sporozoiten beteiligt ist16,17. Wie in Abb. 2I, J gezeigt, kam es ab Tag 5 pi zu einer deutlichen Hochregulierung der SR-B1-Transkripte, was auf eine späte und unbekannte funktionelle Rolle bei der Parasitenentwicklung schließen lässt, was sich in einer erhöhten SR-B1-Färbung in infizierten HuHeps am Tag 5 widerspiegelt pi (Abb. S12). Wir haben die möglichen toxischen Wirkungen von zwei bekannten SR-BI-Inhibitoren, Block Lipid Transport BLT116,17 und ITX506120, in HepOrg- und HuHep-Kulturen getestet (Abb. S7A). Nur ITX5061 zeigte in den beiden höchsten getesteten Konzentrationen sowohl in HepOrg als auch in HuHeps Toxizität. Abbildung S7C–E zeigte, dass bei HuHeps, das mit BLT1 bei 20–40 μM behandelt wurde, die Schizontenzahl um 50 % reduziert wurde, nicht jedoch bei ITX5061, das eine höhere Konzentration (40–80 μM) erforderte. HuHeps wurden als biologisch relevantere Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten mit BLT1 (20 μM) behandelt (Abb. S8), um ihren Einfluss auf die Parasitenentwicklung von PfNF54, PfNF135 und PfNF175 am Tag 7 pi zu untersuchen (Abb. 5, Abb. S9)16,21. Bei Anwendung 24 Stunden vor der Infektion (Tag −1) verhinderte BLT1 im Gegensatz zu NF54 nicht die Sporozoiteninvasion von NF135 und NF175 (Abb. 5A – C). Dies deutete darauf hin, dass die früheren Stämme offenbar über alternative SR-B1-unabhängige Eintrittswege verfügen. Wenn die infizierte Monoschicht jedoch ab Tag 1 pi behandelt wurde, kam es bei allen drei Pf-Stämmen zu einer drastischen Verringerung der Schizontenzahl, insbesondere am Tag 3 und 4 pi (Abb. 5A – C). Dies spiegelte sich auch in der verringerten Schizontengröße für alle Pf-Stämme wider (Abb. 5D – F, Abb. S10). Die kombinierten Daten zeigen, dass SR-B1 funktionell an der Leberreifung im Spätstadium aller drei getesteten Pf-Stämme beteiligt ist, während es für die Invasion von NF54 nur entscheidend ist.

Die durchschnittliche (dreifache) Anzahl (A–C) und Größe (D–F) von Schizonten in HuHeps, die mit den Stämmen NF175 (Magenta), NF135 (Grün) und NF54 (Schwarz) infiziert und entweder mit DMSO oder BLT1 behandelt wurden. Jeder Balken stellt den Durchschnitts- und Fehlerbalken (SD) von drei technischen Replikaten (A–C) aus zwei biologischen Experimenten (n = 2) dar. Für die Größe der Schizonten (D–F) werden Daten von zwei technischen Replikaten von mindestens 100 Schizonten gezeigt, mit Ausnahme von NF54 aufgrund der geringen Anzahl überlebender Schizonten (D–F). Rohzahlen für dieses Panel sind in den Abbildungen dargestellt. S8 und S9. Sidaks Mehrfachvergleichstest (zweiseitig) wird zum Vergleich der DMSO- und BLT1-Bedingungen für A–F verwendet und mit *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 versehen. Für A betragen die p-Werte von links nach rechts 0,0014, 0,0004, 0,0004 und 0,0005. Für B betragen die p-Werte 0,0032, 0,0010, 0,0009. Für C betragen die p-Werte 0,0369, 0,0216, 0,0447. Für E betragen die p-Werte 0,0182 und 0,0387.

Es wurde zuvor gezeigt, dass P. yoelii und P. berghei (Plasmodium-Arten muriner Malariamodelle) Wirtslipide abfangen müssen, um eine erfolgreiche Entwicklung im Leberstadium zu gewährleisten22,23. Für ihr intrahepatisches Wachstum und ihre Entwicklung müssen wachsende Parasiten ihre Plasmamembranen sowie die umgebende parasitophore Vakuolenmembran (PVM) erweitern. Wir stellten daher die Hypothese auf, dass die Hemmung der SR-B1-Funktion die Verpackung des Tochterparasiten beeinträchtigen könnte, der essentielle Lipide benötigt. SR-B1 bindet an High-Density-Lipoprotein (HDL) und vermittelt den Eintritt des Cholesterinesters oder anderer im HDL-Partikelkern vorhandener Lipide in die Hepatozyten24,25. Mit BLT1 behandelte PfNF54-, PfNF135- und PfNF175-infizierte HuHeps zeigten am 3. und 4. Tag einen verringerten Trend zu MSP-1-positiven Leberschizonten (Abb. 6A – C). Die verbleibenden MSP-1-positiven Schizonten zeigten ein atypisches MSP-1-Färbemuster (Abb. 6D – F). Die kombinierten Daten legen nahe, dass SR-B1 an der Reifung von Leberschizonten beteiligt sein könnte.

Der Prozentsatz der HuHep-Schizonten, die für die PfMSP1-Expression für NF175 (A), NF135 (B) und NF54 (C) positiv sind. Insgesamt wurden zwei biologische Experimente durchgeführt (n = 2), jedes mit zwei technischen Replikaten: Mindestens 100 Schizonten wurden von jedem technischen Replikat gemessen, mit Ausnahme von NF54, da nur wenige Schizonten überlebten. Jeder Balken stellt den Durchschnitts- und Fehlerbalken (SD) zweier technischer Replikate (A–C) aus zwei biologischen Experimenten (n = 2) dar. Konfokale Bilder zeigen DMSO- und BLT1-behandelte Schizonten, gefärbt auf PfMSP1 und PfHSP70 für NF175 (D), NF135 (E) und NF54 (F) in HuHeps. Der Maßstabsbalken beträgt 25 Mikrometer. Diese Bilder sind repräsentativ für zwei unabhängige Experimente. Sidaks Mehrfachvergleichstest (zweiseitig) wird verwendet, um die DMSO- und BLT1-Bedingungen für jeden Parasitenstamm (A–C) zu vergleichen: Die p-Werte für die signifikanten Parameter sind mit Anmerkungen versehen (*p < 0,05, **p < 0,01, ** *p < 0,001). Für A beträgt der p-Wert 0,0488; B (von links nach rechts), p-Werte sind 0,0054 und 0,0012.

In dieser Studie zeigen wir, dass differenzierte fötale menschliche Hepatozyten-Organoide für eine Infektion mit Pf-Parasiten anfällig sind und das reife Schizontenleberstadium aufrechterhalten. Aus fetalen HepOrgs erzeugte differenzierte Hepatozyten stellen ein alternatives In-vitro-Kultursystem dar, das vorteilhafte Eigenschaften sowohl von primären Hepatozyten als auch von Leberzelllinien vereinen kann. Infizierte HepOrgs weisen Merkmale auf, einschließlich Morphologie und ausgeprägtem Markerprofil, die denen von primären HuHeps ähneln. Die in diesen HepOrgs gebildeten Schizonten sind im Allgemeinen größer als die in HuHeps vorkommenden und ähneln in ihrer Größe denen, die bei Mäusen mit humanisierten Lebern beobachtet werden26,27. Darüber hinaus bestätigt das Vorhandensein einer MSP-1-Expression in späten Leberstadien die ordnungsgemäße Reifung. Wichtig ist, dass die sich entwickelnden intrazellulären Parasiten empfindlich auf das bewährte schizontizide Medikament Atovaquon reagieren. Insgesamt zeigen unsere Ergebnisse, dass aus fetalen HepOrgs erzeugte differenzierte Hepatozyten ein funktionelles In-vitro-Kultursystem bereitstellen, das wichtige Einschränkungen sowohl von primären HuHeps- als auch von Leberzelllinien erfüllt. Beispielsweise leiden frische und/oder kryokonservierte HuHeps unter einer Heterogenität in der Pf-Zulässigkeit sowie einer begrenzten In-vitro-Lebensdauer der Zellen, die sich bereits wenige Tage nach der Aussaat zu verschlechtern beginnt28, während hepatische Zelllinien nur eine begrenzte Unterstützung für die Pf-Entwicklung zeigen28.

Zuvor haben wir eine starke Korrelation zwischen der Schizontengröße und den intraparasitären menschlichen Glutaminsynthetase (GS)-Spiegeln in NF175-HuHeps-Schizonten gezeigt7. Allerdings scheint die Fähigkeit, GS zu akkumulieren, nicht der entscheidende Faktor für die Schizontengröße bei HepOrgs zu sein, da positive und negative GS-Schizonten ähnliche Größen aufweisen. Eine mögliche Erklärung könnte mit der GS-Verfügbarkeit und -Umverteilung innerhalb des Parasiten zusammenhängen: HepOrg-Schizonten weisen ausgedehntere GS-Netzwerke auf als der einzige konzentrierte Fleck, der in HuHeps-Schizonten vorhanden ist. Ein Grund könnte sein, dass HepOrgs in Gegenwart von CHIR99021 kultiviert werden, einem starken Inhibitor der Glykogensynthasekinase 3 (GSK3), einem Protein, das β-Catenin phosphoryliert und so auf den proteasomalen Abbau abzielt29,30. Eine der Funktionen von β-Catenin ist die eines wichtigen Effektors des Wnt-Signalwegs, der die Transkription verschiedener Wnt/β-Catenin-Zielgene einschließlich GLUL (kodierend für GS)31 induziert. Daher kann man davon ausgehen, dass HepOrg-Zellen einen Überschuss an GS enthalten (Abb. S11), was das Parasitenwachstum fördern kann, auch wenn es nicht in den Parasiten transportiert wird.

Die Organoid-Technologie erweist sich als In-vitro-Modellsystem, um einige der Herausforderungen herkömmlicher Modelle zu überwinden32,33. Ein Vorteil von Organoiden ist das Potenzial, einen dreidimensionalen Zellcluster zu bilden, der anatomisch und funktionell dem untersuchten Wirtsorgan besser ähnelt und gleichzeitig die Fähigkeit zur Selbsterneuerung und Selbstorganisation beibehält. Bei Leberstudien verlieren Hepatozyten in einer zweidimensionalen Monoschicht schnell ihre Hepatozytenfunktionen20. Chua und Kollegen führten ein Lebersphäroidmodell für die Malaria-Leberstadiumsforschung ein, das auf primären Hepatozyten basiert, die in 3D-Cellusponge gezüchtet wurden, um Sphäroide zu bilden21. Ein großes Manko ist die Unfähigkeit, schizonte Bilder zu visualisieren, da es nur begrenzte 3D-Bilder gibt. Hier konnten wir diese Einschränkung überwinden, indem wir differenzierte Organoide dissoziierten und die einzelnen Zellen vor der Infektion 24–48 Stunden lang in einer 2D-Monoschicht ausplattierten. Ein weiterer Vorteil von HepOrg ist die Möglichkeit, das Wirtsgenom genetisch zu verändern, um Faktoren zu verstehen, die an der Parasitenentwicklung beteiligt sind, und zwar mithilfe des kürzlich etablierten Protokolls des CRISPR/Cas9-basierten Gen-Knock-Ins und -Knock-Outs6.

Detaillierte transkriptomische Studien zur intrazellulären Plasmodium-Entwicklung in Leberzellen sind bekanntermaßen schwierig durchzuführen und beschränken sich auf Plasmodium-Arten, die nicht-menschliche Wirte infizieren, darunter murines P. berghei34, P. yoelii34,35 und Affen-P. cynomolgi36. In diesen Studien wurde eine fluoreszierend markierte transgene Reporterparasitenlinie verwendet, um infizierte Zellen von nicht infizierten Zellen zu trennen. Hier zeigen wir Einzelzell-RNA-seq-Daten von Pf-infizierten HepOrgs-Zellen, die an den Tagen 4 und 5 pi erhalten wurden. Es können unterschiedliche Cluster identifiziert werden, die reife Hepatozyten, proliferierende Hepatozyten und cholangiozytenähnliche Zellen sowohl in Kontrollen als auch in infizierten Zellen umfassen. Dies bestätigt, dass eine auf Flusssortierung basierende Isolationsstrategie die Auswahl nicht auf einen bestimmten Zelltyp ausrichtet und dass die scRNA-seq-Daten repräsentativ für die integrale HepOrg-Zelle sind. Die höchste Anzahl hochinfizierter Zellen findet sich in einem bestimmten Cluster, der mit reifen Hepatozyten angereichert ist. Dies stützt die Annahme, dass die Parasitenentwicklung bevorzugt in den stärker differenzierten Hepatozyten und nicht in cholangiozytenähnlichen Zellen stattfindet7.

Zuvor wurden Änderungen des Wirtstranskripts während der Entwicklung des Maus-Malariamodells P. berghei34 sorgfältig analysiert. In dieser Studie wurden zwei aufeinanderfolgende Zeitpunkte (Tag 4 und 5 pi) mit einer Hochregulierung von Genen untersucht, die am Lipidstoffwechsel und der Energieerzeugung (Glykolyse und Gluconeogenese) beteiligt sind, vergleichbar mit dem 12–18-stündigen pi-Zeitpunkt in der Entwicklung des Leberstadiums P. berghei (der in 48 Stunden abgeschlossen ist). Eine weitere bemerkenswerte Veränderung in der Entwicklung von P. berghei im Leberstadium ist die allgemeine Herunterregulierung der Apoptosemaschinerie und der Entzündungsreaktion während der Entwicklung des Parasiten (ab 12 Stunden pi). Dies wurde in unserem Datensatz nicht beobachtet, könnte aber auf die nicht krebsartige Natur von HepOrg im Gegensatz zur Hepatomzelllinie Hepa1-634 zurückzuführen sein.

Der Befund einer SR-B1-Hochregulierung in der Leber nach einer Pf-Infektion ist neu; Bisher war es nur als Wirtsrezeptor assoziiert, der an der Invasion beteiligt war16,17. Außerdem spielt es eine zusätzliche Rolle bei der Entwicklung von Nagetier-Malariamodellen (P. berghei und P. yoelii) in Hepatozyten-Zelllinien. In Nagetier-Malariamodellen ist der Wirt SR-B1 der natürliche bestimmende oder limitierende Faktor für eine Parasiteninfektion. Dies kann für PfNF54 der Fall sein, wo die Vorinkubation von HuHeps mit BLT1-Inhibitoren die intrazelluläre Parasitenzahl drastisch reduziert, nicht jedoch für PfNF135 und PfNF175. Einzelzell-RNA-Seq von frisch isolierten HuHeps zeigt, dass nur sehr wenige Zellen SCARB1-Transkripte enthalten (im Vergleich zu CD81, einem anderen Wirtsinvasionsrezeptor), was die relativ geringe Infektiosität von PfNF54 im Vergleich zu NF175 und NF135 erklären könnte (unveröffentlichte Daten). Während die Infektion mit Malariaparasiten bei Nagetieren durch natürlich vorkommendes SR-B1 eingeschränkt werden kann, ist dies bei Pf anders, da es nach der Infektion zu einer Hochregulierung der SCARB1-Transkripte kommt, die entweder eine Reaktion des Wirts auf eine Infektion oder eine aktive Parasitenmanipulation des Wirts sein kann. Leider konnten wir die Wirkung des SR-B1-Inhibitors auf infizierte HepOrgs nicht testen, da die Fähigkeit von PfNF175, Sporozoiten zu übertragen und zu erzeugen, zunehmend nachlässt37,38. Basierend auf unseren Erkenntnissen nehmen wir an, dass die durch SR-B1 vermittelte Lipidaufnahme für die Bildung von Parasitenmembranen einschließlich Plasmamembranen und/oder für die parasitophore Vakuole, aber auch für die Verpackung von Tochtermerozoiten verwendet wird: Mit BLT1 behandelte Schizonten sind kleiner in Größe und Erscheinung atypische MSP-1-Färbung. Die Lipide können auch dazu verwendet werden, dass der Wirt seine Plasmamembran erweitert, um die wachsenden Parasiten aufzunehmen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass menschliche HepOrgs eine vielseitige Quelle für die In-vitro-Kultur darstellen, die zu einem besseren Verständnis der Biologie im Pf-Leberstadium beitragen wird. Wir stellen RNA-seq-Profile einzelner infizierter Zellen bereit. Es wird eine neue Rolle des hepatischen Wirtsfaktors SR-B1 identifiziert, die Heterogenität zwischen Pf-Stämmen aufzeigt. Der Einsatz menschlicher HepOrgs wird die klinische Entwicklung neuartiger Medikamente und Impfstoffe beschleunigen. Zukünftige Studien mit anderen (menschlichen) Plasmodium-Arten werden dieses Potenzial weiter beleuchten.

Am Leiden University Medical Center (LUMC) wurden menschliche fetale Leberproben entnommen. Die Verwendung von Proben zu Forschungszwecken wurde von der Ethikkommission des LUMC genehmigt und bei Bedarf wurde die Einverständniserklärung der Spender eingeholt.

Primäre menschliche Leberzellen wurden frisch aus chirurgischem Restmaterial isoliert. Die Proben sind anonymisiert und die allgemeine Genehmigung für die Verwendung von chirurgischem Restmaterial wurde in Übereinstimmung mit der niederländischen Ethikgesetzgebung erteilt, wie sie im Gesetz über medizinische Forschung (Menschen) beschrieben und vom Ausschuss für Forschung mit menschlichen Probanden in der Region Arnheim bestätigt wurde -Nijmegen, Niederlande.

Menschliche Hepatozyten-Organoide (HepOrgs) wurden hergestellt und kultiviert, im Wesentlichen wie in Hendriks et al.6 beschrieben. Kurz gesagt, menschliche Hepatozyten wurden aus menschlichem fötalem Gewebe durch Kollagenase IV-Verdau und anschließende 5-minütige Zentrifugation bei 100 g isoliert. Ungefähr 10.000 Zellen wurden mit Human Hep-Medium (HuHep-Lebermedium oder HLM) und MatrigelR (im Verhältnis 1:3) gemischt und pro 24 Vertiefungen ausgesät. Nach der Verfestigung wurde alle 2 Tage HLM-Expansionsmedium (siehe unten) hinzugefügt und erneuert. Für die vorliegende Studie wurden vier zuvor etablierte Hepatozyten-Organoidlinien verwendet (KK2, KK3, KU1 und K1FM).

Humanes HepOrg-Lebermedium-Expansionsmedium (HLM-EM) besteht aus AdDMEM/F12 (Thermo Scientific, mit Hepes, GlutaMax und Penicillin-Streptomycin) plus 15 % konditioniertem RSPO1-Medium (hausgemacht), B27 (ohne Vitamin A), 50 ng /ml EGF (Peprotech), 1,25 mM N-Acetyl-L-Cystein (Sigma), 10 nM Gastrin (Sigma), 3 mm ChIR99021 (Sigma), 50 ng/ml HGF (Peprotech), 100 ng/ml FGF7 (Peprotech ), 100 ng/ml FGF10 (Peprotech), 2 nM A83-01 (Tocris), 10 mM Nicotinamid (Sigma), 10 mM Rho-Inhibitor Y-27632 (Calbiochem) und 20 ng/ml TGFa.

Für fetale HepOrgs wurde zur Organoiddifferenzierung humanes HepOrg-Lebermedium-Differenzierungsmedium (HLM-DM) verwendet. DM besteht aus EM plus 10 ng/ml Oncostatin M, 100 nM DAPT und 100 nM Dexamethason. Während der Kultivierung wurde das Medium alle 2–3 Tage erneuert. Organoide werden in der Regel im Verhältnis 1:3–1:4 alle 7 Tage vor Passage 6 und 1:3 alle 7–10 Tage nach Passage 6 passagiert. Die zukünftige Verteilung von Organoiden an Dritte (akademische oder kommerzielle) Parteien muss erfolgen auf Antrag des HUB vom METC UMCU genehmigt werden, um die Einhaltung der niederländischen medizinischen Forschung zu gewährleisten, bei der es um Handlungen an menschlichen Probanden geht.

William's B-Medien bestehen aus 1X William's E+ Glutamax (Invitrogen 32551-087) mit 100 mM Natriumpyruvat (Invitrogen 11360-036), 1 % Insulin, Transferrin, Selen (Invitrogen 41400-045), 1 % MEM-NEAA (Invitrogen 11140-036). 035), 2 % Pen/Strep (Invitrogen 15140-122), 1 % Fungizone (GE Healthcare SV30078.01) und 12,8 mM Dexamethoson. Die Medien wurden filtersterilisiert und 10 % hitzeinaktiviertes Humanserum (lokal gemäß ethisch anerkannten Protokollen gewonnen) wurde hinzugefügt, wo immer dies angezeigt war.

HLM:WLB-Medien bestehen aus gleichen Volumina (1:1) von HLM-DM- und WLB-Medien ohne Serum. Beide Medien sollten frisch zubereitet und gemischt werden.

Fünf Organoidlinien (KU1, KK2, KK3, K1FM) wurden in HLM-EM-Medium gehalten. 10–14 Tage vor der Infektion wurden HepOrgs auf HLM-DM-Medium übertragen. Das Medium wurde alle 2–3 Tage aufgefüllt und um Tag 7 herum erneut in frisches Matrigel ausplattiert. Falcon 96-Well Black/Clear Flat Bottom TC-behandelte bildgebende Mikrotiterplatten (Corning 353219) wurden 2 Tage lang mit Kollagenbeschichtungslösung (Sigma 125-50) beschichtet im Inkubator. Vor der Zellplattierung wurde Kollagen mit 150 µl DMEM neutralisiert. HepOrgs wurden mit TrypLE in einzelne Zellen dissoziiert und 50.000 Zellen/Well wurden in den mit Kollagen beschichteten Platten mit 150 µl HLM ausplattiert. Die plattierten Zellen wurden 10 Minuten lang bei 3000 U/min zentrifugiert (Beschleunigung 9, Bremse 1) und im Inkubator bis zur Infektion inkubiert.

Pf asexuelle und sexuelle Blutstadien wurden in einem halbautomatischen System wie in Lit. beschrieben kultiviert. 39,40,41. Anopheles stephensi-Mücken wurden im Insektengehege des Radboud University Medical Center (Nijmegen, Niederlande) nach Standardarbeitsanweisungen gezüchtet. Infizierte Mücken wurden von Hand auf ihre Speicheldrüsen präpariert, die in komplettem Williams-B-Medium (William-E-Medium mit Glutamax [Thermo Fisher, 32551-087], ergänzt mit 1X Insulin/Transferrin/Selen [Thermo Fisher, 41400-045]) gesammelt wurden. 1 mM Natriumpyruvat [Thermo Fisher, 11360-070], 1X MEM-NEAA [Thermo Fisher, 11140-035], 2,5 µg/ml Fungizon [Thermo Fisher 15290-018], 200 U/ml Penicillin/Streptomycin [Thermo Fisher 15140 -122] und 1,6 µM Dexamethason [Sigma Aldrich D4902-100MG]) ohne Serum. Nach der Homogenisierung wurden die Sporozoiten in einer Burker-Turk-Kammer unter einem Phasenkontrastmikroskop gezählt. Die Sporozoiten wurden unmittelbar vor der Infektion entweder auf HepOrg oder HuHeps mit hitzeinaktivierten menschlichen Seren (HIHS) in einer Menge von 10 % des Gesamtvolumens ergänzt.

Speicheldrüsen von im Labor gezüchteten infizierten A. stephensi-Mücken wurden zwischen dem 16. und 21. Tag nach der Blutmahlzeit präpariert. Zur Infektion wurden 50.000 Sporozoiten in jede Vertiefung gegeben, suspendiert in WLB+ 10 % Humanserum bei MOI = 1. Die Platten wurden 10 Minuten lang bei 3000 g zentrifugiert (Beschleunigung 9, Bremse, 1) und 3 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Das Medium wurde nach 3 Stunden aufgefüllt, um Ablagerungen zu entfernen. Nach der Erstinfektion wurden die HepOrg-Monoschichten in HLM:WLB (1:1) ohne Serum gehalten. Nach der Infektion wurde das Medium täglich mit HLM:WLB (1:1) aufgefüllt.

Primäre menschliche Hepatozyten wurden von Patienten isoliert, die sich einer elektiven partiellen Hepatektomie in Yang et al.7 unterzogen. Frisch isolierte Hepatozyten, suspendiert in vollständigem Williams-B-Medium, wurden in 96 Vertiefungen mit 62.500 Zellen pro Vertiefung ausplattiert und in einem Inkubator bei 37 °C (5 % CO2) mit täglichen Medienauffrischungen aufbewahrt. Präparierte Sporozoiten (Tag 16–21 nach der Blutmahlzeit) wurden dem HuHeps 48 Stunden nach dem Ausplattieren im Verhältnis 1:1 in Duplikaten/Triplikaten zugesetzt und 10 Minuten lang bei 3000 U/min bei niedrigen Bremsen heruntergeschleudert. Das Medium wird nach 3 Stunden und dann täglich aufgefrischt. Die mit Sporozoiten infizierte Kultur wurde 5 oder 7 Tage lang gehalten, danach wurden die Zellen 10 Minuten lang mit 4 % Paraformaldehyd (ThermoFisher Scientific: Katalognummer 28906) fixiert. Die Proben wurden mit 1 % Triton permeabilisiert und mit den verschiedenen oben aufgeführten P. falciparum- oder menschlichen Antikörpern angefärbt.

Für die Dosis-Wirkungs-Kurve von BLT1 und ITX5061: Kryokonservierte Hepatozyten (zwei Spender: AY40 und AY76) wurden aufgetaut und nach dem Ausplattieren entweder mit PfNF175 oder PFNF135 infiziert. Eine Reihe von Arzneimittelkonzentrationen (0, 0,5, 1, 5, 10, 20, 40, 80, 100 μM) wurden infizierten Kulturen am Tag 3 nach der Infektion 48 Stunden lang zugesetzt (eine Medienauffrischung alle 24 Stunden). Der infizierte Monolayer wurde am Tag 7 nach der Infektion fixiert und verarbeitet.

Kryokonservierte Hepatozyten werden aufgetaut und entweder fünf oder sechs Tage nach dem Ausplattieren (dh Tag 3 oder Tag 4 nach der Infektion) mit unterschiedlichen Konzentrationen von ITX5061 oder BLT1 behandelt. Am 9. Tag nach der Ausplattierung wurde die Lebensfähigkeit mit dem CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay (Promega: #G7570) bestimmt. Um die Toxizität dieser jeweiligen Arzneimittel auch in HepOrgs (KK2) zu testen, wurden Monoschichten wie oben beschrieben hergestellt. Drei Tage nach dem Ausplattieren wurden HepOrg-Monoschichten 48 Stunden lang mit einem Dosisbereich von ITX5061 oder BLT1 behandelt und am Tag 7 wurde die Lebensfähigkeit mit CellTiter-Glo gemessen. Aufgrund von Schwankungen bei Parametern wie der Aussaatdichte oder der Lage der Vertiefungen in einer Platte können Schwankungen zwischen den Vertiefungen bei der Lebensfähigkeit zwischen 80 und 120 % liegen. Eine echte Toxizität sollte nur bei einer Lebensfähigkeit von weniger als 80 % im Vergleich zu Kontrollproben oder unbehandelten Proben in Betracht gezogen werden.

Pf-asexuelle Stadien wurden in einem halbautomatischen System kultiviert, wie in beschrieben. Die Reinigung parasitierter Erythrozyten erfolgte auf einem Stufen-Percoll-Gradienten, der aus einer oberen 35 %- und einer unteren 65 %-Percoll-Schicht bestand, wie zuvor gezeigt42. Nach der Zentrifugation enthält die untere Grenzfläche angereicherte parasitierte Erythrozyten. Diese Schnittstelle wurde gesammelt und in PBS verdünnt und dann mithilfe der Gates sortiert, die für infizierte Leberzellen verwendet wurden. Da Erythrozyten keinen Zellkern haben, wurde davon ausgegangen, dass die Körnigkeit der Zellen (SSC) auf eine Infektion und das Vorhandensein von Parasiten zurückzuführen ist. Die Methode zur RNA-Isolierung finden Sie im Methodenabschnitt mit dem Titel „RNA-Isolierung und qRT-PCR“.

Die RNA-Isolierung von Organoiden, Geweben und Primärzellen wurde mit dem RNeasy Micro Kit (Qiagen) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die RNA wurde mit M-MLV Reverse Transkriptase, RNase H Minus (Promega) revers transkribiert. Die qPCR-Analyse wurde mit dem qPCR-Gerät SYBR Green Mixture (Bio-rad Laboratories) 384 (Bio-rad Laboratories) durchgeführt. Primer für qPCR wurden mit NCBI Primer-BLAST entworfen und in der Ergänzungstabelle aufgeführt.

Organoide wurden mithilfe von TryPLE in einzelne Zellen trypsinisiert. Für Monoschichten wurden Zellschaber mit 96 Vertiefungen (Biotium 22003) zum Ablösen der Zellen verwendet und 3 Minuten lang mit Accutase (Sigma A6964) behandelt, gefolgt von der Neutralisierung mit DMEM. Die Zellen wurden 5 Minuten lang bei 1200 U/min zentrifugiert und in HLM:WLB-Medien resuspendiert. Zellklumpen wurden durch Filtrieren durch einen 70-µm-Filter entfernt. Propidiumiodid (Thermo Fisher P1304MP) wurde zur Unterscheidung lebender/toter Zellen verwendet. Nicht infizierte Kontrollzellen wurden verwendet, um FSC- und SSC-Gates festzulegen. Infizierte Zellen wurden mithilfe regulärer und strenger Tore sortiert. Stringente Tore wurden so eingestellt, dass sie Zellen mit der höchsten Granularität (SSC) einschlossen.

Die Einzelzell-mRNA-Sequenzierung (scRNA-seq) wurde mit der SORT-seq-Methode11 durchgeführt, die auf der CEL-Seq2-Methode43 basiert. Kurz gesagt, einzelne lebensfähige Zellen (dh von HepOrg abgeleitete Zellen oder Erythrozyten) wurden direkt in Vertiefungen einer Platte mit 384 Vertiefungen sortiert, die mit Lysepuffer gefüllt war, der wellspezifische CEL-Seq2-Primer enthielt. Die Platten wurden in einer gekühlten Tischzentrifuge kurz bei 500 × g zentrifugiert und sofort bei –80 °C gelagert. Zur Bibliotheksvorbereitung wurden die gelagerten Platten aufgetaut und 5 Minuten lang auf 70 °C erhitzt, um die Zellen zu lysieren und die RNA zu extrahieren. Die gereinigte RNA wurde dann einer Erststrang- und Zweitstrangsynthese unterzogen, gefolgt von einem In-vitro-Transkriptionsschritt über Nacht, um amplifizierte RNA (aRNA) zu erzeugen. Die aRNA wurde als Input zur Generierung komplementärer (cDNA-)Bibliotheken unter Verwendung von Illumina TruSeq-Primern verwendet. Die Qualitätskontrolle wurde mit einem Qubit Fluorometer (Thermo Fisher Scientific) und einem 2100 Bioanalyzer Instrument (Agilent) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Alle eingereichten Bibliotheken wurden auf einem Illumina NextSeq500 unter Verwendung einer 75-bp-Pair-End-Sequenzierung mit hoher Leistung (150 Millionen Lesevorgänge pro Lauf) sequenziert.

Die Lesevorgänge wurden auf die menschliche GRCh37-Genomanordnung abgebildet, die mit dem Referenztranskriptom des P. falciparum 3D7-Stamms (PF3D7) verkettet war, wobei alle Multi-Mapping-Lesevorgänge verworfen wurden. Die Lesezahlen wurden gefiltert, um Lesevorgänge mit identischen Bibliotheks-, Zell- und Molekülbarcodes auszuschließen, und die UMI-Zahlen wurden mithilfe der Poisson-Zählstatistik angepasst11.

Alle weiteren bioinformatischen Analysen wurden in der R/Bioconductor-Umgebung durchgeführt. scRNA-seq-Bibliotheken wurden mit dem Seurat v4-Paket12 analysiert. Der anfängliche Datensatz, der sowohl menschliche als auch P. falciparum 3D7-Daten enthielt, wurde nach Art aufgeteilt und die beiden resultierenden Datensätze wurden separat analysiert.

Für den menschlichen Datensatz wurden doppelte Gennamen mithilfe der make.unique-Funktion und ERCC92-Spike-Ins eindeutig gemacht und Gesamtzelltranskriptome mit weniger als 2001 Transkript-UMIs wurden aus dem Datensatz entfernt. Die verbleibenden Transkriptome wurden mithilfe der SCTransform-Funktion von Seurat unter Verwendung der Einstellung vars.to.regress normalisiert, um verwirrende Variationsquellen wie die gesamte UMI-Anzahl (nCount_RNA), die gesamte Genzahl (nFeature_RNA) und verarbeitete Platten zu entfernen. Wir haben die AddModuleScore-Funktion von Seurat verwendet, um die Expression von Nekrosegenen (FOSB, FOS, JUN, JUNB, ATF3, EGR1, HSPA1A, HSPA1B, HSPB1, IER3, IER2, DUSP1) zu bewerten44. Für die weitere Analyse wurden nur Zellen mit einem Nekrose-Genanreicherungs-Score von weniger als 1 zurückbehalten. SCTransform wurde mit denselben Einstellungen wie zuvor für den bereinigten Datensatz erneut ausgeführt. Die anfängliche Zellclusterung wurde basierend auf Genexpressionsähnlichkeiten unter Verwendung von FindClusters von Seurat mit einer Auflösung von 0,4 generiert. Das SNN-Diagramm wurde mit der FindNeighbor-Funktion von Seurat berechnet und mithilfe eines an anderer Stelle veröffentlichten Skripts visualisiert (https://romanhaa.github.io/projects/scrnaseq_workflow/#snn-graph). Der Clusterbaum wurde mit der BuildClusterTree-Funktion von Seurat generiert. Die Zellzyklusanalyse wurde mit der CellCycleScoring-Funktion von Seurat durchgeführt. Um die Genexpression von Hepatozytenmarkern (ALB, AFP, RBP4, FABP1, SERPINA1, ASGR2, ASGR1, APOA2, APOC3) oder Cholangiozytenmarkern (KRT19, KRT8, KRT18, EPCAM, KRT7) zu bewerten, verwendeten wir die AddModuleScore-Funktion von Seurat. Zellcluster-Markergene wurden mithilfe der FindAllMarkers-Funktion von Seurat mit den folgenden Einstellungen identifiziert: only.pos = TRUE, min.pct = 0,25, thresh.use = 0,25. Die Expression von Abstammungsmarkergenen (ALB, AFP, MKI67, KRT7, EPCAM) pro Zellcluster wurde mithilfe der VlnPlot-Funktion von Seurat visualisiert, die auf stack = TRUE eingestellt war. Die Infektionsrate von HepOrg-Zellen wurde wie folgt definiert: keine, ≤ 1 Pf-Transkripte; niedrig, 1 50 Pf-Transkripte. Es wurde definiert, dass infizierte HepOrg-Zellen mehr als 1 Pf-Transkript aufwiesen.

Für die Unterclusterung des Datensatzes ab Tag 5 pi wurde der menschliche Datensatz pro Erfassungstag mithilfe der SplitObject-Funktion von Seurat aufgeteilt. Nach dem Sub-Clustering mit der gleichen Strategie und Einstellung (z. B. Auflösung = 0,4) wie beim anfänglichen Clustering verwendeten wir das EnrichR-Paket19 und die FindMarkers-Funktion von Seurat, um jeweils eine Gene-Set-Enrichment-Analyse (GSEA) durchzuführen und differenziell exprimierte Daten zu identifizieren (DE)-Gene (angepasster p-Wert ≤ 0,05) beim Vergleich infizierter Zellen (d. h. Zellen mit mehr als 1 Gesamt-Read-Zählung, die den Genen von Plasmodium falciparum zugeordnet ist) und nicht infizierten Zellen (d. h. Zellen mit 1 oder weniger Gesamt-Read-Zählung, die den Genen von Plasmodium falciparum zugeordnet ist). ). DE-Gene zwischen Infizierten und Nichtinfizierten wurden mit der DoHeatmap-Funktion von Seurat aufgezeichnet.

Für den P. falciparum 3D7-Datensatz wurden doppelte Gennamen mithilfe der make.unique-Funktion eindeutig gemacht und Gesamtzelltranskriptome mit weniger als 50 Transkript-UMIs wurden aus dem Datensatz entfernt. Die Normalisierung wurde erneut mithilfe der SCTransform-Funktion von Seurat mit der Einstellung vars.to.regress durchgeführt, um verwirrende Variationsquellen wie die gesamten UMI-Zählungen (nCount_RNA), die gesamten Genzahlen (nFeature_RNA) und verarbeitete Platten zu entfernen. Das Clustering wurde wie oben beschrieben unter Verwendung von FindClusters von Seurat mit einer Auflösung von 0,4 durchgeführt und Cluster-Marker-Gene wurden unter Verwendung der FindAllMarkers-Funktion von Seurat mit den folgenden Einstellungen identifiziert: only.pos = TRUE, min.pct = 0,25, thresh.use = 0,25. Die Expression der TOP 2-Gene jedes Clusters (dh der am stärksten exprimierten Gene pro Cluster) wurde mithilfe der VlnPlot-Funktion von Seurat visualisiert, die auf stack = TRUE eingestellt war. Um DE-Gene (angepasster p-Wert ≤ 0,05) zu identifizieren, indem wir Transkriptome des Leberstadiums (d. h. Zellen, die von infizierten HepOrgs gesammelt wurden) und des Blutstadiums (d. h. gesammelte infizierte Erythrozyten) verglichen, verwendeten wir die FindMarkers-Funktion von Seurat. DE-Gene, die die beiden Stadien vergleichen, wurden mit der DoHeatmap-Funktion von Seurat aufgezeichnet.

Das Hochleistungsmikroskop Leica DMI6000B wurde zur Kachelung von 96 Vertiefungen zur Bestimmung der Infektionsrate verwendet. Für jede Vertiefung wurde eine Kachelgröße von 9 × 9 bei 20-facher Objektivierung erhalten. Zur Aufnahme hochauflösender konfokaler Bilder wurden der Zeiss LSM880 mit Airyscan mit 63-fachem Objektiv (Öl) und 2-fachem Zoom oder der Leica SP8 SMD mit 63-fachem Objektiv (Wasser) verwendet.

Für die Analyse verwendete FIJI-Version 1,53 t

Siehe Abschnitt „Methoden“ von Yang et al.7.

Mit dem High-Content-Mikroskop aufgenommene Bilder wurden in Fidschi geöffnet. Es wurden zufällige Bilder ausgewählt, bis 100 Parasiten gemessen wurden. Parasiten wurden über das Region of Interest (ROI)-Tool unter Verwendung der PfHSP70-Positivität (roter Kanal) ausgewählt und gemessen.

Dies wurde bereits veröffentlicht7. Kurz gesagt, für jedes der im vorherigen Abschnitt gemessenen Bilder wurde mithilfe der Region of Interest (ROI) eine Gesamthintergrundintensität (RawIntDen) im grünen Kanal (da PfMSP-1/hGS mit Alexa-488 gekennzeichnet ist) bestimmt. Es wurde eine Hintergrundintensität pro Fläche (x) bestimmt (Gesamtintensität des gesamten Bildes dividiert durch die Flächengröße des Bildes). Die Gesamthintergrundintensität für den Parasiten wurde mithilfe der Formel x multipliziert mit der gemessenen Größe des Parasiten ermittelt. Die gemessene Grünintensität innerhalb eines Parasiten wird mit dem ROI-Tool ermittelt, um einfach den betreffenden Parasiten auszuwählen. Die tatsächliche Intensität innerhalb des Parasiten wird durch Subtrahieren des Hintergrundwerts von der gemessenen Intensität berechnet. Wenn die tatsächliche Intensität höher ist als der Hintergrundwert, gilt der Parasit als „positiv“ für die hGS/PfMSP1-Expression. Wenn niedriger, dann ist der Parasit „negativ“. Für jede Erkrankung wurden mehr als 50 Schizonten gemessen, außer in den Fällen der BLT1-Behandlung, da bei einigen Pf-Linien nur wenige überlebende Schizonten vorhanden waren.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die in dieser Studie generierten Sequenzierungsdaten wurden im Gene Expression Omnibus (GEO) unter der Zugangsnummer GSE199239 hinterlegt. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

R-Skripte für die Einzelzellanalyse sind unter https://github.com/KaiKretzschmar/HepOrgMalaria verfügbar.

WER. Weltmalariabericht 2021 (WHO, 2021).

Roth, A. et al. Ein umfassendes Modell zur Bewertung von Therapien im Leberstadium gegen Plasmodium vivax und Plasmodium falciparum. Nat. Komm. 9, 1837 (2018).

Artikel ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sattabongkot, J. et al. Etablierung einer menschlichen Hepatozytenlinie, die die In-vitro-Entwicklung der exoerythrozytären Stadien der Malariaparasiten Plasmodium falciparum und P. vivax unterstützt. Bin. J. Trop. Med. Hyg. 74, 708–715 (2006).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Clevers, H. Modellierung von Entwicklung und Krankheit mit Organoiden. Zelle 165, 1586–1597 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hu, H. et al. Langfristige Erweiterung funktioneller Maus- und menschlicher Hepatozyten als 3D-Organoide. Zelle 175, 1591–1606.e19 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hendriks, D. et al. Etablierung menschlicher fetaler Hepatozyten-Organoide und CRISPR-Cas9-basierter Gen-Knockin und Knockout in Organoidkulturen aus menschlicher Leber. Nat. Protokoll. 16, 182–217 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Yang, ASP et al. Zonale menschliche Hepatozyten sind für den Malariaparasiten Plasmodium falciparum unterschiedlich durchlässig. EMBO J. 40, e106583 (2021).

Graumans, W. et al. Plasmodium falciparum-Gametozytenanreicherung in peripheren Blutproben durch magnetische Fraktionierung: Gametozytenausbeuten und Möglichkeiten zur Wiederverwendung von Säulen. Bin. J. Trop. Med. Hyg. 100, 572–577 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Barata, L. et al. In-vitro-Analyse der Wechselwirkung zwischen Atovaquon und Proguanil gegen Malariaparasiten im Leberstadium. Antimikrob. Agenten Chemother. 60, 4333–4335 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Xiang, C. et al. Langfristige funktionelle Aufrechterhaltung primärer menschlicher Hepatozyten in vitro. Wissenschaft 364, 399–402 (2019).

Artikel ADS MathSciNet CAS PubMed Google Scholar

Muraro, MJ et al. Ein Einzelzell-Transkriptomatlas der menschlichen Bauchspeicheldrüse. Zellsystem 3, 385–394.e3 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hao, Y. et al. Integrierte Analyse multimodaler Einzelzelldaten. Zelle 184, 3573–3587.e29 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Foquet, L. et al. Anti-CD81, aber nicht Anti-SR-BI blockiert die Leberinfektion mit Plasmodium falciparum in einem humanisierten Mausmodell. J. Antimicrob. Chemother. 70, 1784–1787 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Silvie, O. et al. Die Expression von menschlichem CD81 wirkt sich je nach Plasmodium-Art unterschiedlich auf die Anfälligkeit der Wirtszelle für Malaria-Sporozoiten aus. Cell Microbiol 8, 1134–1146 (2006).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Silvie, O. et al. Hepatozyten-CD81 ist für die Infektiosität von Plasmodium falciparum und Plasmodium yoelii-Sporozoiten erforderlich. Nat. Med. 9, 93–96 (2003).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Yalaoui, S. et al. Der Scavenger-Rezeptor BI erhöht die Permissivität der Hepatozyten gegenüber einer Plasmodium-Infektion. Cell Host Microbe 4, 283–292 (2008).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Rodrigues, CD et al. Der Wirtsfängerrezeptor SR-BI spielt eine doppelte Rolle bei der Entstehung einer Malariaparasiten-Leberinfektion. Cell Host Microbe 4, 271–282 (2008).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kaushansky, A. et al. Malariaparasiten zielen auf den Hepatozytenrezeptor EphA2 ab, um eine erfolgreiche Wirtsinfektion zu erreichen. Science 350, 1089–1092 (2015).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Xie, Z. et al. Entdeckung von Gen-Set-Wissen mit Enrichr. Curr. Protokoll. 1, e90 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rowe, IA et al. Wirkung des Scavenger-Rezeptor-Klasse-B-Typ-I-Antagonisten ITX5061 bei Patienten mit einer Hepatitis-C-Virusinfektion, die sich einer Lebertransplantation unterziehen. Lebertranspl. 22, 287–297 (2016).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Nieland, TJ et al. Entdeckung chemischer Inhibitoren des selektiven Lipidtransfers, der durch den HDL-Rezeptor SR-BI vermittelt wird. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 99, 15422–15427 (2002).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mikolajczak, SA et al. L-FABP ist ein entscheidender Wirtsfaktor für die erfolgreiche Entwicklung des Malaria-Leberstadiums. Int J. Parasitol. 37, 483–489 (2007).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Labaied, M. et al. Plasmodium rettet durch LDL internalisiertes und de novo in der Leber synthetisiertes Cholesterin. Cell Microbiol 13, 569–586 (2011).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Acton, S. et al. Identifizierung des Scavenger-Rezeptors SR-BI als hochdichten Lipoproteinrezeptor. Science 271, 518–520 (1996).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Krieger, M. Das Schicksal des „guten Cholesterins“ aufzeichnen: Identifizierung und Charakterisierung des hochdichten Lipoproteinrezeptors SR-BI. Annu. Rev. Biochem. 68, 523–558 (1999).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Sacci, JB Jr. et al. Plasmodium falciparum-Infektion und exoerythrozytische Entwicklung bei Mäusen mit chimären menschlichen Lebern. Int. J. Parasitol. 36, 353–360 (2006).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Yang, ASP et al. Die Zelldurchquerungsaktivität ist wichtig für die Leberinfektion mit Plasmodium falciparum bei humanisierten Mäusen. Cell Rep. 18, 3105–3116 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Gural, N. et al. Künstliche Lebern für Infektionskrankheiten. Zellmol. Gastroenterol. Hepatol. 5, 131–144 (2018).

Artikel PubMed Google Scholar

Sekine, S. et al. Der leberspezifische Verlust von Beta-Catenin blockiert die Aktivität des Glutaminsynthesewegs und die Expression von Cytochrom p450 bei Mäusen. Hepatology 43, 817–825 (2006).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Naujok, O. et al. Zytotoxizität und Aktivierung des Wnt/Beta-Catenin-Signalwegs in embryonalen Stammzellen der Maus, die mit vier GSK3-Inhibitoren behandelt wurden. BMC Res Notes 7, 273 (2014).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Boj, SF et al. Das Diabetes-Risikogen und Wnt-Effektor Tcf7l2/TCF4 steuert die Leberreaktion auf den Stoffwechselbedarf von Perinatalen und Erwachsenen. Zelle 151, 1595–1607 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Dutta, D., Heo, I. & Clevers, H. Krankheitsmodellierung in aus Stammzellen gewonnenen 3D-Organoidsystemen. Trends Mol. Med. 23, 393–410 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Bartfeld, S. & Clevers, H. Organoide als Modell für Infektionskrankheiten: Kultur menschlicher und muriner Magenorganoide und Mikroinjektion von Helicobacter pylori. J. Vis. Exp. https://doi.org/10.3791/53359, 53359 (2015).

Albuquerque, SS et al. Das Transkriptionsprofil der Wirtszelle während einer Malaria-Leberstadium-Infektion zeigt eine koordinierte und aufeinanderfolgende Reihe biologischer Ereignisse. BMC Genomics 10, 270 (2009).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Tarun, AS et al. Eine kombinierte Transkriptom- und Proteomuntersuchung der Leberstadien von Malariaparasiten. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 105, 305–310 (2008).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Voorberg-van der Wel, A. et al. Eine vergleichende transkriptomische Analyse replizierender und ruhender Leberstadien des rezidivierenden Malariaparasiten Plasmodium cynomolgi. Elife 6, e29605 (2017).

Tripathi, AK et al. Plasmodium falciparum Gametozytenkultur und Mückeninfektion durch künstliche Membranfütterung. J. Vis. Exp. https://doi.org/10.3791/61426 (2020).

Brockelman, CR Bedingungen, die die Gametozytogenese in der kontinuierlichen Kultur von Plasmodium falciparum begünstigen. J. Protozool. 29, 454–458 (1982).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ifediba, T. & Vanderberg, JP Vollständige In-vitro-Reifung von Plasmodium falciparum-Gametozyten. Natur 294, 364–366 (1981).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Ponnudurai, T. et al. Kultivierung fruchtbarer Plasmodium falciparum-Gametozyten in halbautomatischen Systemen. 1. Statische Kulturen. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 76, 812–818 (1982).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ponnudurai, T. et al. Infektiosität kultivierter Plasmodium falciparum-Gametozyten gegenüber Mücken. Parasitology 98, 165–173 (1989).

Artikel PubMed Google Scholar

Miao, J. & Cui, L. Schnelle Isolierung einzelner mit Malariaparasiten infizierter roter Blutkörperchen durch Zellsortierung. Nat. Protokoll. 6, 140–146 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hashimshony, T. et al. CEL-Seq2: empfindliche hochmultiplexierte Einzelzell-RNA-Seq. Genombiol. 17, 77 (2016).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

van den Brink, SC et al. Die Einzelzellsequenzierung zeigt die durch Dissoziation induzierte Genexpression in Gewebesubpopulationen. Nat. Methoden 14, 935–936 (2017).

Artikel PubMed Google Scholar

Schindelin, J. et al. Fidschi: eine Open-Source-Plattform für die Analyse biologischer Bilder. Nat. Methoden 9, 676–682 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Referenzen herunterladen

Wir möchten Marga van de Vegte-Bolmer, Rianne Stoter und Wouter Graumans für ihre hervorragende Arbeit bei der Erzeugung von P. falciparum-Parasiten und Mückeninfektionen danken. Wir möchten Jolanda Klaasan, Laura Pelser-Posthumus, Astrid Pouwelsen und Jacqueline Kuhnen für die geschickte Züchtung von Mücken und die Sektion infizierter Mücken auf Sporozoiten danken. Wir möchten dem Microscopic Imaging Centre (MIC) der Radboud-Universität für den Zugang zu seinen Einrichtungen danken. Wir möchten Reinier van den Linden für seine Unterstützung bei der Fließsortierung danken; Maya Sen, Judith Vivié und Single Cell Discoveries für Hilfe bei SORT-seq; die Utrecht Sequencing Facility (USEQ) für die Sequenzierung und Anko de Graaf und das Hubrecht Imaging Centre (HIC) für Hilfe bei der konfokalen Mikroskopie. Abschließend möchten wir Judith Bolscher und Marloes de Bruijni (TropIQ Health Sciences) für die Daten zur Arzneimittelsensitivität der Pf-Stämme danken. ASPY ist Empfänger eines Veni-Stipendiums des Talentprogramms des Dutch Research Council (NWO) (VI.Veni.192.171) und eines ZonMW Off-Road-Stipendiums (04510012010050). GJvG wird durch das Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Fördervereinbarung Nr. 733273 unterstützt. Diese Arbeit wurde durch einen EU/ERC Advanced Grant (an HC, Fördervereinbarung: 67013e) und einen CRUK-Zuschuss OPTIMISTICC (an HC, Fördernummer) unterstützt : C10674/A27140). DD erhielt ein VENI-Stipendium des niederländischen Forschungsrats (NWO-ALW, 016.Veni.171.015). KK war Langzeitstipendiat der Human Frontier Science Program Organization (HFSPO, LT771/2015), Empfänger eines VENI-Stipendiums (NWO-ZonMW, 016.166.140) und wird derzeit von der Deutschen Krebshilfe gefördert (über MSNZ Würzburg/ NG3) und einen EU/ERC Starting Grant (Fördervereinbarung: 101042738). DH wurde durch ein Postdoktorandenstipendium der Swedish Society of Medical Research (Nr. P19-0074) unterstützt und wird durch ein VENI-Stipendium des Dutch Research Council (Nr. VI.Veni.212.134) unterstützt.

Devanjali Dutta

Aktuelle Adresse: Merus, Utrecht, Niederlande

Jens Puschhof

Derzeitige Adresse: Abteilung Mikrobiom und Krebs, Deutsches Krebsforschungszentrum (DKFZ), Im Neuenheimer Feld 280, 69120, Heidelberg, Deutschland

Huili Hu

Aktuelle Adresse: Forschungszentrum für Stammzellen- und Regenerative Medizin, Abteilung für Systembiomedizin, School of Basic Medical Sciences, Cheeloo College of Medicine, Shandong University, Jinan, China

Kim E. Boonekamp

Derzeitige Adresse: Abteilung Signalisierung und funktionelle Genomik, Deutsches Krebsforschungszentrum (DKFZ), Im Neuenheimer Feld 280, 69120, Heidelberg, Deutschland

Hans Clevers

Aktuelle Adresse: Pharma, Forschung und frühe Entwicklung (pRED) von F. Hoffmann-La Roche Ltd, Basel, Schweiz

Robert W. Sauerwein

Derzeitige Adresse: TropIQ Health Sciences, Nijmegen, Niederlande

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Annie SP Yang, Devanjali Dutta, Kai Kretzschmar, Delilah Hendriks.

Diese Autoren haben diese Arbeit gemeinsam betreut: Hans Clevers, Robert W. Sauerwein.

Radboud-Zentrum für Infektionskrankheiten, Abteilung für medizinische Mikrobiologie, Radboud University Medical Center, Nijmegen, Niederlande

Annie SP Yang, Youri van Waardenburg, Geert-Jan van Gemert, Teun Bousema und Robert W. Sauerwein

Hubrecht-Institut, Königlich Niederländische Akademie der Künste und Wissenschaften, Utrecht, Niederlande

Devanjali Dutta, Kai Kretzschmar, Delilah Hendriks, Jens Puschhof, Huili Hu, Kim E. Boonekamp und Hans Clevers

Oncode Institute, Utrecht, Niederlande

Devanjali Dutta, Kai Kretzschmar, Delilah Hendriks, Jens Puschhof, Huili Hu, Kim E. Boonekamp und Hans Clevers

Mildred Scheel Early Career Center (MSNZ) für Krebsforschung Würzburg, Universitätsklinikum Würzburg, Würzburg, Deutschland

Kai Kretzschmar

Anatomie und Embryologie, Universitätsklinikum Leiden, Leiden, Niederlande

Susana M. Chuva de Sousa Lopes

Abteilung für Chirurgie, Radboud University Medical Center, Nijmegen, Niederlande

Johannes HW de Wilt

Princess Maxima Center (PMC) für pädiatrische Onkologie, Utrecht, Niederlande

Hans Clevers

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Diese Studie wurde von ASPY, DD, KK, HC und RWS entworfen. Die Experimente wurden von ASPY, DD, KK, DH und YvWHH, KEB und SMCdSL durchgeführt, die bei der Organoidkultur unterstützt wurden. Die Datenanalyse wurde von ASPY, DD, KK, HC und DH durchgeführt. Die bioinformatische Analyse wurde von KK durchgeführt und JPJHWdW und GJvG lieferten die menschlichen Lebersegmente bzw. infizierten Mücken. Das Manuskript wurde von ASPY, DD, KK, TB, HC, RWS verfasst und von allen Co-Autoren kommentiert.

Korrespondenz mit Annie SP Yang, Hans Clevers oder Robert W. Sauerwein.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Gary Peltz, Roberta O'Connor, Alexis Cotto-Rosario, Stefan Kappe und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die Originalautor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Yang, ASP, Dutta, D., Kretzschmar, K. et al. Entwicklung von Plasmodium falciparum-Leberstadien in Hepatozyten, die aus Organoidkulturen menschlicher fötaler Leber stammen. Nat Commun 14, 4631 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40298-7

Zitat herunterladen

Eingegangen: 08. Mai 2022

Angenommen: 19. Juli 2023

Veröffentlicht: 02. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-40298-7

Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:

Leider ist für diesen Artikel derzeit kein gemeinsam nutzbarer Link verfügbar.

Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt

Durch das Absenden eines Kommentars erklären Sie sich damit einverstanden, unsere Nutzungsbedingungen und Community-Richtlinien einzuhalten. Wenn Sie etwas als missbräuchlich empfinden oder etwas nicht unseren Bedingungen oder Richtlinien entspricht, kennzeichnen Sie es bitte als unangemessen.