Vergleichende Wirkungen von CFTR-Modulatoren auf phagozytische, metabolische und entzündliche Profile von CF- und Nicht-CF-Makrophagen

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 11995 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Eine Funktionsstörung der Makrophagen ist bei Mukoviszidose (CF) gut beschrieben und kann zur bakteriellen Persistenz in der Lunge beitragen. Ob die CF-Makrophagen-Dysfunktion direkt mit dem Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) in Makrophagen zusammenhängt oder eine indirekte Folge chronischer Entzündung und Mukostase ist, wird derzeit diskutiert. CFTR-Modulatoren, die die CFTR-Funktion in Epithelzellen wiederherstellen, verbessern die globalen Entzündungsreaktionen von CF-Monozyten, ihre direkten Auswirkungen auf Makrophagen sind jedoch weniger gut verstanden. Um diese Wissenslücke zu schließen, haben wir Phagozytose, Metabolismus und Zytokinexpression als Reaktion auf einen klassischen CF-Erreger, Pseudomonas aeruginosa, in von Monozyten abgeleiteten Makrophagen (MDM) gemessen, die aus homozygoten CF-F508del-Probanden und Nicht-CF-Kontrollen isoliert wurden. Unerwarteterweise stellten wir fest, dass CFTR-Modulatoren die Phagozytose sowohl in CF- als auch in Nicht-CF-Kohorten verstärkten. CFTR-Dreifachmodulatoren hemmten auch die mitochondriale MDM-Funktion, was mit der MDM-Aktivierung übereinstimmt. Im Gegensatz zu Studien am Menschen, in denen CFTR-Modulatoren die Konzentration entzündlicher Zytokine im Serum senkten, veränderten Modulatoren die Zytokinsekretion in unserem System nicht. Unsere Studien legen daher nahe, dass modulatorinduzierte Stoffwechseleffekte die bakterielle Clearance sowohl in CF- als auch in Nicht-CF-Monozyten-Makrophagen fördern können.

Zystische Fibrose (CF) ist eine genetische Multisystemerkrankung, bei der Atemwegserkrankungen eine herausragende Rolle bei Morbidität und Mortalität spielen1. Menschen mit CF (pwCF) werden von chronischen Lungeninfektionen geplagt, die oft mit den stereotypischen Krankheitserregern Staphylococcus aureus und Haemophilus influenzae beginnen, gefolgt von einem Übergang zur Besiedlung mit Pseudomonas aeruginosa (Pa), anderen Bakterien und Pilzen, wenn das Alter der pwCF und die Lungenerkrankung fortschreiten2. Nach klassischer Auffassung entsteht dieser Prozess aus einer Kaskade, die mit einem Mangel an CFTR-vermittelter Chloridsekretion beginnt, was zu einer Hyperviskosität des Schleims, einem Versagen der mukoziliären Rolltreppe und der Bildung von Biofilmen führt und schließlich in einem Mangel an sterilisierender Immunität in der Lunge gipfelt1.

Dieses Modell wurde durch die realen Erfahrungen von pwCF, die eine hochwirksame CFTR-Modulator-Therapie erhalten, etwas in Frage gestellt. Bei Personen mit mindestens einer Kopie der häufigsten CFTR-Mutation, einer Deletion in Phenylalanin an Position 508 (F508del), können Modulatoren die CFTR-Funktion auf Werte wiederherstellen, die denen von Personen ohne CFTR-Mutationen nahe kommen3,4. Während Modulatoren eine deutliche Verbesserung der Lungenfunktion und der Lungenclearance sowie eine Verringerung der Sputumproduktion und der Bakterienmenge bewirken können, ist die bakterielle Besiedlung leider bei den meisten Probanden geblieben und hat das Potenzial, das Fortschreiten der Lungenerkrankung weiter voranzutreiben5,6,7. Dies hat die Notwendigkeit hervorgehoben, zu verstehen, ob bei CF8,9,10,11,12 möglicherweise intrinsische Immundefekte vorliegen. Makrophagen fungieren als Wächter des Immunsystems in der Lunge und die Untersuchung ihrer Reaktion auf CFTR-Modulatoren ist daher von entscheidender Bedeutung für ein umfassenderes Verständnis der CF-Lungenimmunität13.

Frühere Untersuchungen an Serummonozyten von pwCF haben deren Profile vor und nach Beginn einer hochwirksamen Modulatortherapie untersucht, sowohl bei Patienten mit Gating-Mutationen, die mit Ivacaftor begonnen haben, als auch bei Patienten mit F508del-Mutationen, die mit Elexacaftor/Tezacaftor/Ivacaftor (ETI) begonnen haben. Dreifachkombinationstherapie6,14,15,16,17. Diese Studien haben einen Rückgang der entzündlichen Zytokinproduktion durch CF-Monozyten gezeigt, sie können jedoch nicht zwischen direkten Wirkungen von Modulatoren auf Monozyten und indirekten Wirkungen sekundär zu einer verbesserten mukoziliären Funktion und einer verringerten Bakterienlast unterscheiden. Es wurde gezeigt, dass der CFTR-Korrektor Lumacaftor der früheren Generation die Phagozytose und Abtötung von CF-Makrophagen verbessert, während der CFTR-Potentiator Ivacaftor die Sekretion entzündlicher Zytokine verringert18. Eine neuere Veröffentlichung hat die Wirkung der dreifachen CFTR-Modulatoren der neuesten Generation in vitro auf isolierte Monozyten-abgeleitete Makrophagen (MDM) gezeigt19. Sie fanden heraus, dass ETI zwar die bakterielle Clearance durch CF-MDM erhöhte, jedoch keinen Einfluss auf die Zytokinsekretion als Reaktion auf eine Burkholderia-cepacia-Komplex-Infektion hatte. Wir untersuchten die Auswirkungen von ETI im Vergleich zur Kombination Tezacaftor/Ivacaftor (TI) der älteren Generation auf die direkte Pa-Aufnahme durch CF- und Nicht-CF-MDM sowie die Auswirkungen von Modulatoren auf den MDM-Metabolismus und die Zytokinproduktion. Unsere Ergebnisse stützen ein Modell, bei dem ETI Makrophagen aktiviert und die bakterielle Clearance verbessert, anstatt sie in Richtung eines weniger entzündlichen Phänotyps zu verschieben, wie dies bei früheren Modulatorkombinationen der Fall war.

Einige dieser Ergebnisse wurden zuvor in Form von Abstracts20,21,22 präsentiert.

Das Institutional Review Board von Dartmouth Health genehmigte diese Studie (IRB-Protokoll Nr. 22781) und alle Methoden wurden in Übereinstimmung mit den relevanten Richtlinien und Vorschriften durchgeführt. Die Probanden wurden aus der Population unserer CF-Klinik rekrutiert, wenn sie 18–65 Jahre alt waren, F508del-homozygot waren, bei klinischem Studienbeginn keine Symptome einer Exazerbation aufwiesen und normale Hämoglobinwerte aufwiesen. Nicht-CF-Kontrollpersonen wurden durch vom IRB genehmigte Flyer rekrutiert; Raucher oder Personen mit Atemwegserkrankungen oder der Einnahme von Lungenmedikamenten wurden ausgeschlossen. Von allen Probanden wurde eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt und in einer sicheren Datenbank aufgezeichnet. Anschließend wurde zur Monozytenisolierung durch unsere Forschungsschwester eine Phlebotomie durchgeführt (100 ml Vollblut isoliert) und zur weiteren Verarbeitung direkt ins Labor gebracht. Klinische Informationen zu den Probanden finden Sie in Tabelle 1.

MDM wurden gemäß zuvor veröffentlichten Protokollen23,24 generiert. Kurz gesagt, Monozyten wurden aus peripherem Blut durch Ficoll-Gradiententrennung isoliert, gefolgt von der Verarbeitung mit einem Pan-Monozyten-Isolierungskit (Miltenyi Biotech) gemäß den Protokollen des Herstellers, das eine Mischung aus klassischen, nicht-klassischen und intermediären Monozyten produziert. Sie wurden quantifiziert und gemäß dem vorgesehenen Test direkt auf Gewebekulturplatten ausplattiert. MDM wurden durch Behandlung mit 100 ng/ml M-CSF über 7 Tage in RPMI/10 % FCS mit Gentamicin erzeugt. Das Medium wurde alle 2–3 Tage ausgetauscht, bis die Zellen einsatzbereit waren.

MDM wurde mit 2,5 × 105/ml in 24-Well-Platten erzeugt. MDM wurden in RPMI/10 % FBS mit Gentamicin ohne M-CSF gegeben und CFTR-Modulatoren wurden 48 Stunden lang hinzugefügt. Obwohl es keine Standardkonzentrationen von CFTR-Modulatoren für die In-vitro-Verwendung gibt, haben wir die wirksamen Konzentrationen auf der Grundlage zuvor veröffentlichter Daten und Serumspiegel von Menschen mit CF geschätzt. Elexacaftor wurde in einer Konzentration von 6 µM, Tezacaftor in einer Konzentration von 3 µM und Ivacaftor in einer Konzentration von 30 nM verwendet. Die Elexacaftor-Konzentration wurde auf der Grundlage veröffentlichter Daten zu Serumkonzentrationen bei CF-Patienten25, pharmakokinetischen Modelldaten26 und Packungsbeilagen von ETI nach der FDA-Zulassung27 bestimmt. Die maximale Elexacaftor-Konzentration betrug bei diesen Probanden 9,2 µg/ml, was 15,4 µM entspricht. Die für die Arbeit, die erstmals zur klinischen Zulassung von ETI führte, verwendeten In-vitro-Konzentrationen an Epithelzellen betrugen 2–3 µM28. Damit liegen wir deutlich im Konzentrationsbereich, der sich zuvor als wirksam und sicher in vivo erwiesen hat.

Ebenso betrug die maximale Tezacaftor-Konzentration in vivo 7,7 µg/ml oder 14,8 µM27. Eine unabhängige Analyse ergab eine mittlere Serumkonzentration von 5,1 µg/ml oder 9,8 µM. In anderen In-vitro-Studien wurden zwischen 5 und 18 µM17,19 verwendet.

Wir haben eine niedrigere Konzentration von Ivacaftor (30 nM) gewählt, da frühere Arbeiten gezeigt haben, dass es bei höheren Konzentrationen schädliche Auswirkungen auf die Phagozytoserettung haben kann18. Die maximale Konzentration gemäß der klinischen Packungsbeilage betrug 1,2 µg/ml (2,3 µM) und es wird in vivo zu > 97 % an Plasmaproteine gebunden29. Es wurde gezeigt, dass Ivacaftor in vitro bei Konzentrationen von nur 10 nM30 aktiv auf CFTR ist, und höhere Konzentrationen haben nachweislich eine destabilisierende Wirkung auf F508del CFTR31. Schließlich haben vorläufige Experimente, die wir vor der Verfügbarkeit von Elexacaftor durchgeführt haben, gezeigt, dass 30 nM Ivacaftor ausreichten, um in Kombination mit Tezacaftor einen additiven Effekt auf die Verstärkung der Phagozytose zu erzielen.

Anschließend wurden MDM mit PBS gewaschen und das Medium durch identisches Medium ohne Antibiotika ersetzt. Bei allen Medienaustauschen wurden neue CFTR-Modulatoren hinzugefügt.

Die Pa-Stämme PA14 oder DH1137 (ein nicht schleimiges klinisches CF-Isolat) wurden über Nacht in LB bei 37 °C in einem Schüttelinkubator mit einem um 45° abgewinkelten Röhrchen mit loser Kappe gezüchtet, um einen Gasaustausch zu ermöglichen. Wir wählten sowohl einen Standard-Laborstamm, der in der Literatur häufig verwendet wird, als auch ein klinisches Isolat, um sicherzustellen, dass die Auswirkungen auch bei einem CF-Stamm beobachtet wurden. Anschließend wurden die Kulturen 60 Minuten lang im Verhältnis 1:10 in LB subkultiviert, 2 Minuten lang bei 8000 × g zentrifugiert, zweimal gewaschen und dann in antibiotikafreiem Testmedium resuspendiert, und die Bakteriendichte wurde durch Spektrophotometrie bei 600 nm bestimmt. Eine OD600 von 1,0 wurde empirisch ermittelt und entspricht 109 Bakterien/ml Medium. Pa wurden MDM mit einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 10 Bakterien pro Makrophage zugesetzt. Die Zellplatten wurden 20 Minuten lang bei 37 °C inkubiert, dann wurden die Zellen mit PBS gewaschen und 15 Minuten lang MDM-Medium mit 10 × Gentamicin zugegeben. Die Zellen wurden dann zweimal mit PBS bei 4 °C gewaschen, gefolgt von einer Lyse mit 250 µL 0,1 % Triton X-100. 30 µL Lysat wurden dann zur CFU-Bestimmung über Nacht auf LB-Agarplatten ausplattiert. Am nächsten Tag wurden die Kolonien gezählt und die Anzahl der Bakterien pro 106 Makrophagen berechnet. Anschließend wurden die mittleren CFU für jedes Subjekt und jede Bedingung logarithmisch transformiert. Die MOI wurde empirisch aus den Bakterienstammlösungen für jeden Test durch Ausplattieren auf LB-Agarplatten bestätigt.

Monozyten wurden zunächst mit 50.000 Zellen pro Vertiefung auf eine Seahorse-Platte mit 96 Vertiefungen ausplattiert und wie oben beschrieben 7 Tage lang direkt in den Vertiefungen zu MDM differenziert. Zu diesem Zeitpunkt wurde das Differenzierungsmedium entfernt und CFTR-Modulatoren für 48 Stunden hinzugefügt. Pa-konditioniertes Medium wurde im Voraus hergestellt, indem Bakterien über Nacht in Seahorse-Mitostress-Assay-Medium kultiviert, die Kulturen auf eine OD600 von 0,500 normalisiert, zentrifugiert wurden, um die Bakterien zu pelletieren, und dann der Überstand durch einen 0,22-µm-Filter geleitet wurde. Dies wurde als 100 % konditioniertes Medium definiert. Aliquots wurden dann bis zur Verwendung bei –20 °C eingefroren.

Am Tag des Tests wurde das Zellkulturmedium gemäß den Anweisungen des Herstellers gegen Mitostress-Testmedium ausgetauscht. Ein Mitostress-Assay mit akuter Injektion wurde auf einer Agilent Seahorse XFe96-Plattform mit 20 µL Pa konditioniertem Medium im Injektionsanschluss A (Endkonzentration 10 % nach der Injektion) durchgeführt. Für die Kontrollvertiefungen war einfaches Mitostress-Medium enthalten. Oligomycin, FCCP und Rotenon/Antimycin A wurden gemäß dem Mitostress-Protokoll jeweils in die Ports BD gegeben. Pro Bedingung wurden 4–8 technische Replikate durchgeführt. Parameter wie Reaktion auf Injektion, maximale Atmung und andere wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers berechnet.

Zwei ml über Nacht bei 37 °C unter Schütteln gezüchtete LB-Kulturen der angegebenen Pa-Stämme wurden in den angegebenen Medien auf eine OD600 von 0,01 normalisiert, dann wurden CFTR-Modulatoren oder ein äquivalentes Volumen DMSO zugegeben. 100 µL jeder Kultur wurden in eine 96-Well-Platte gegeben und die OD600 wurde jede Stunde mit einem Inkubationsplattenlesegerät bei 37 °C gemessen.

PA14-Wildtyp und sein mutiertes flgK-Derivat32 wurden über Nacht kultiviert und dann auf eine OD600 von 0,100 normalisiert. Aliquots jedes Stammes wurden mit DMSO oder Elexacaftor, Tezacaftor und Ivacaftor (ETI) behandelt und dann sofort auf Glasobjektträger gegeben. 0,01 % Tween-20 wurden hinzugefügt, um die Oberflächenbindung zu verringern. Die Bilder wurden über einen Zeitraum von 1 Minute mit einem 63-fach-Ölimmersionsobjektiv auf einem Zeiss-Mikroskop mit einem iPhone In jeder Serie wurde eine manuelle Partikelverfolgung an 18–20 einzelnen Bakterien durchgeführt. Jeder Datenpunkt stellt die Gesamtstrecke (willkürliche Einheiten) dar, die jedes Bakterium über die Serie zurückgelegt hat, mit Linien im Mittel.

MDM wurde mit 5 × 105/Well in 24-Well-Platten erzeugt und dann wie oben 48 Stunden lang mit CFTR-Modulatoren behandelt. Übernachtkulturen von DH1137 wurden wie in Phagozytosetests am Morgen des Experiments hergestellt. Das Medium wurde aus MDM entfernt und durch antibiotikafreies Medium mit frischen CFTR-Modulatoren ersetzt. Anschließend wurde DH1137 mit einer MOI von 10 für 2 Stunden zugegeben. Die Überstände wurden aus den Vertiefungen entfernt, 10 Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit in einer Tischmikrozentrifuge bei 4 °C zentrifugiert und dann bis zur Verwendung bei –20 °C eingefroren. Der Millipore-Assay für humane 48-Plex-Zytokine wurde von der Dartmouth Immune Monitoring Core Facility durchgeführt.

Die Analysen wurden in R durchgeführt. ANOVA oder lineare Modelle mit gemischten Effekten (wobei der Spender als Zufallseffekt angegeben wurde) wurden für die Analyse verwendet, wie in den Legenden der Abbildungen angegeben. P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Wir untersuchten zunächst die Auswirkungen von CFTR-Modulatoren auf eine der prototypischen Makrophagenfunktionen, die Phagozytose. Für diese Tests verwendeten wir zwei verschiedene Pa-Stämme, einen klassischen Laborstamm (PA14) und einen aus CF-Lungen isolierten klinischen Stamm (DH1137). Wir analysierten alle Ergebnisse durch lineare Mixed-Effect-Modellierung, die es uns ermöglichte, die Variabilität von Subjekt und Pa-Stamm zu berücksichtigen und gleichzeitig die Auswirkungen der Modulatoren global innerhalb der Tests zu bestimmen. Bei Behandlung mit der doppelten CFTR-Modulatorkombination TI zeigte CF MDM eine konsistente Steigerung der Phagozytoseeffizienz (p < 0,001 im Vergleich zu DMSO) (Abb. 1A). Ein weiterer Anstieg der Phagozytose wurde mit dem dreifachen Modulator ETI beobachtet (p < 0,0001).

CF- und Nicht-CF-MDM-Phagozytose wird durch CFTR-Modulatoren verstärkt. (A) MDM von CF-Probanden (n = 7) wurden wie angegeben 48 Stunden lang mit DMSO- oder CFTR-Modulatoren behandelt. Die Phagozytose wurde durch einen Gentamicin-Schutztest gemessen. Jede Linie, die die Punkte verbindet, stellt ein einzelnes Thema dar, Balken stellen Mittelwerte für separate Experimente dar. p < 0,001 für DMSO vs. TI und p < 0,0001 für DMSO vs. ETI. Es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen Bakterienstämmen und keine Wechselwirkungen zwischen Stamm und Modulatoren. (B) Identische Experimente wurden mit Nicht-CF-Spendern (n = 9) durchgeführt. p < 0,01 für DMSO vs. TI, p < 0,0001 für DMSO vs. ETI. Alle Statistiken nach linearem Mixed-Effects-Modell.

Um die Spezifität der Modulatoreffekte zu untersuchen, haben wir diese Studien mit Nicht-CF-MDM wiederholt (Abb. 1B). Obwohl zwischen den Probanden eine größere Variabilität zu bestehen schien, blieb die Reaktion auf TI statistisch signifikant (p < 0,01) und ähnlich wie bei CF-MDM steigerte ETI die Phagozytose im Vergleich zu DMSO-behandelten Zellen weiter (p < 0,0001).

Wir haben in unserem Modell abgefragt, ob es grundlegende Unterschiede zwischen CF-MDM und Nicht-CF-MDM hinsichtlich der Phagozytoseeffizienz gibt, und haben keine offensichtlichen Auswirkungen festgestellt. Angesichts der Art der Tests, die an verschiedenen Tagen durchgeführt werden, sind Vergleiche innerhalb des Tests jedoch wahrscheinlich aussagekräftiger als zwischen-assay. Wir sahen auch keine signifikanten Wechselwirkungen zwischen der Probandenkohorte (CF vs. Nicht-CF) und der Reaktion auf CFTR-Modulatoren, was darauf hindeutet, dass die Modulatoreffekte möglicherweise unabhängig von der CFTR-Mutation waren.

Es gab keine signifikanten Wechselwirkungen zwischen den Pa-Stämmen in ihren Reaktionen auf Modulatoren.

Als nächstes untersuchten wir mögliche mechanistische Faktoren, die zur Effizienz der Phagozytose beitragen. Der Stoffwechselzustand der Makrophagen wirkt sich auf ihre Funktion aus und umgekehrt, wobei entzündungsfördernde aktivierte Makrophagen trotz ausreichender Sauerstoffzufuhr eine Verschiebung hin zu erhöhter Glykolyse und verringerter oxidativer Phosphorylierung erfahren33,34,35,36; Dieses Phänomen wird auch als aerobe Glykolyse oder Warburg-Stoffwechsel bezeichnet. Wir untersuchten daher den Stoffwechselzustand von CF- und Nicht-CF-MDM als Reaktion auf die Behandlung mit CFTR-Modulatoren und sekretierten Faktoren aus PA14 mithilfe eines extrazellulären Flux-Assays von Seahorse. Wir haben uns für die Verwendung eines bakterienfreien konditionierten Mediums entschieden, um metabolische Auswirkungen lebender Bakterien, die den Test beeinträchtigen, zu eliminieren.

Wir fanden heraus, dass ETI, jedoch nicht TI, den Grundsauerstoffverbrauch (ein Indikator für die mitochondriale Aktivität) sowohl bei CF- als auch bei Nicht-CF-MDM hemmte (p = 0,001 nach dem linearen Modell mit gemischten Effekten, Abb. 2A, B). Wir konnten keinen kompensatorischen Anstieg der basalen Glykolyse feststellen (Abb. 2C). Dementsprechend war das Verhältnis der mitochondrialen Aktivität zur Glykolyse in beiden Kohorten in Gegenwart von ETI, jedoch nicht von TI, durchweg verringert (Abb. 2D).

CFTR-Dreifachmodulatoren hemmen die mitochondriale Funktion von MDM. CF- und Nicht-CF-MDM wurden wie in früheren Experimenten 48 Stunden lang in vitro mit CFTR-Modulatoren behandelt. Anschließend wurde ein Seahorse-Mitostress-Assay durchgeführt. (A) Repräsentativer Mitostress-Assay mit Nicht-CF-MDM, vorbehandelt mit DMSO, TI oder ETI. (B) Basalatmung aller einzelnen MDM-Probanden, die mit und ohne Modulatoren getestet wurden. Jeder Punkt mit Verbindungslinien stellt den Mittelwert der technischen Replikate eines einzelnen Subjekts dar (CF n = 10, nonCF n = 11). Balken stellen Mittelwerte aller Probanden innerhalb der Gruppe dar. (C, D) Basale Glykolyse und OCR/ECAR aus den gleichen Tests wie (B).

Wir haben auch die Reaktion auf Pa-konditioniertes Medium (CM) in Gegenwart oder Abwesenheit von CFTR-Modulatoren abgefragt. Pa CM verursachte eine Hemmung der mitochondrialen Aktivität sowie einen akuten Anstieg der Glykolyse (p < 0,0001 für beide Vergleiche; Abb. 3A–C, blaue Linien und Abb. 3D, E), diese Effekte wurden jedoch in Gegenwart von ETI aufgehoben bei denen die mitochondriale Grundfunktion niedrig war, was auf einen Deckeneffekt hindeutet.

Pa Conditioned Medium hemmt die Mitochondrienfunktion von MDM. Gleichzeitig mit den Tests in Abb. 2 wurde eine akute Injektion von Pa-konditioniertem Medium im Vergleich zu Kontrollvertiefungen in einem Seahorse-Mitostress-Assay durchgeführt. (A–C) Repräsentativer Mitostress-Assay mit Nicht-CF-MDM, vorbehandelt mit DMSO, TI oder ETI. (D–F) Berechnete Parameter wie angegeben basierend auf dem Mitostress-Assay. Jeder Punkt mit Verbindungslinien stellt den Mittelwert der technischen Replikate eines einzelnen Subjekts dar (CF n = 10, nonCF n = 11). Balken stellen Mittelwerte aller Probanden innerhalb der Gruppe dar.

Es gab entsprechende Abnahmen der maximalen Atmung (p < 0,0001 für Pa CM und ETI im Vergleich zu den Kontrollen; Abb. 3F), der ATP-verknüpften Atmung (p < 0,001 für Pa CM, p < 0,0001 für ETI, Abb. 3G) und freie Atemkapazität (p < 0,0001 für Pa CM, p < 0,001 für ETI; ergänzende Abbildung 1A).

Es gab keine statistisch signifikanten Auswirkungen auf andere gemessene Parameter, einschließlich nicht-mitochondrialer Atmung und Protonenleck (ergänzende Abbildung 1B bzw. C).

Angesichts der Auswirkungen auf die Mitochondrienfunktion bestätigten wir, dass Modulatoren keinen Zelltod auslösten (ergänzende Abbildung 2); Wir fanden keine Hinweise auf eine LDH-Freisetzung in Gegenwart von Modulatoren.

Es ist möglich, dass einige der mit dem Gentamicin-Schutztest beobachteten Auswirkungen auf die Phagozytose durch Off-Target-Effekte der CFTR-Modulatoren auf Pa in vitro erklärt werden könnten. Wir haben daher getestet, ob CFTR-Modulatoren das Pa-Wachstum unter den Bedingungen unseres Phagozytose-Assays veränderten, und fanden keine Auswirkungen in verschiedenen Medien, einschließlich LB, RPMI oder antibiotikafreien MDM-Medien (Abb. 4A – C). Es gab ein Signal für eine verringerte Bakteriendichte in der stationären Phase > 12 Stunden nach Beginn des Tests, es wurden jedoch keine Unterschiede im Zeitrahmen (im Allgemeinen weniger als 1 Stunde insgesamt) der Phagozytosetests festgestellt. Die Pa-Motilität ist für eine effiziente Phagozytose erforderlich37, CFTR-Modulatoren hatten jedoch keinen nennenswerten Einfluss auf die Motilität von PA14, wobei ein flgK-Mutant ohne Flagellen als nicht bewegliche Kontrolle zum Vergleich diente (Abb. 4D).

CFTR-Modulatoren haben keinen nennenswerten Einfluss auf das Wachstum oder die Motilität von Pa. (A–C) Das Wachstum von PA14 wurde bei 37 °C in einem Plattenlesegerät in verschiedenen Medien mit oder ohne Zusatz von CFTR-Modulatoren gemessen. Punkte stellen Mittelwerte und SEM von drei Einzelexperimenten dar, OD600 des Mediums allein ohne Bakterien wurde von jedem Datenpunkt abgezogen. (D) Die Beweglichkeit der angegebenen Stämme wurde auf einem Glasobjektträger durch manuelle Partikelverfolgung in Gegenwart oder Abwesenheit von ETI gemessen. Als Kontrolle wurden FlgK-Flagellenmutanten verwendet. Jeder Datenpunkt stellt die Gesamtstrecke (willkürliche Einheiten) dar, die jedes Bakterium über die Serie zurückgelegt hat, mit Linien im Mittel.

Es wurde berichtet, dass frühe Modulatoren (Lumacaftor/Ivacaftor) einen basalen hyperinflammatorischen Zustand von CF MDM18 mildern, die Auswirkungen von ETI auf CF MDM in Gegenwart von Pa wurden jedoch nicht untersucht. Wir analysierten die Zytokinproduktion durch MDM nach einer zweistündigen Infektion mit DH1137 mittels Multiplex-Assay. Ohne eine Infektion war die Zytokinsekretion im Allgemeinen gering und es waren keine Auswirkungen von TI und ETI erkennbar. Bei Zugabe von Pa kam es zu einer starken Induktion vieler Zytokine sowohl bei CF (Abb. 5A) als auch bei Nicht-CF-MDM (Abb. 5B). Modulatoren hatten nur einen minimalen Einfluss auf die Zytokinproduktion, wobei ETI nur einen nicht statistisch signifikanten Anstieg entzündlicher Zytokine wie TNFα, IL-1β, IL-8, IL-10, IL-18 und MCP-1 verursachte (ergänzende Abbildung 3). Es gab keine Hinweise auf eine Abnahme der Entzündungsmarker bei TI oder ETI, wie dies bei anderen Modulatorkombinationen berichtet wurde.

Die robuste Induktion entzündlicher Zytokine durch den klinischen Pa-Stamm DH1137 wird durch CFTR-Modulatoren nur minimal beeinflusst. (A) CF MDM (n = 7) wurden 48 Stunden lang in vitro mit CFTR-Modulatoren behandelt, dann wurden die Medien ausgetauscht und eine Untergruppe wurde 2 Stunden lang mit DH1137 bei einer MOI von 10 infiziert. Überstände wurden abzentrifugiert und gesammelt. Zytokin-Multiplex wurde an aggregierten Proben mit 2–4 technischen Replikaten pro Punkt durchgeführt. Die Mittelwerte für jedes Subjekt wurden logarithmisch transformiert und wie angegeben grafisch dargestellt. (B) Nicht-CF-MDM (n = 5) wurden in ansonsten identischen Experimenten wie (A) verwendet.

Es ist bekannt, dass CFTR-Modulatoren die Phagozytose durch CF-Makrophagen steigern18,19,38,39 und die Einleitung von CFTR-Modulatoren in pwCF verringert nachweislich die Entzündungsprofile von Monozyten5,14,15,17,40. Diese Studien befassten sich jedoch nicht direkt mit den Auswirkungen neuerer hochwirksamer Modulatoren auf die Makrophagenfunktion, die sich wahrscheinlich von den Auswirkungen auf Serummonozyten unterscheiden, wenn Modulatoren in vivo initiiert werden. Tatsächlich zeigen unsere Studien, dass ETI zwar die Phagozytose direkt in isolierten Makrophagen steigert, diese Effekte jedoch einigermaßen unabhängig von der CFTR-Mutation zu sein scheinen, da auch Nicht-CF-MDM reagierte (Abb. 1). Dies steht im Einklang mit einem kürzlich veröffentlichten Bericht über die Auswirkungen von ETI auf die Burkholderia-Phagozytose bei isoliertem MDM von Zhang und Kollegen, in dem sie auch Auswirkungen auf Nicht-CF-MDM19 sahen. Interessanterweise fanden die Autoren dieser Studie unterschiedliche Auswirkungen von ETI auf die Abtötung von Staphylococcus aureus, Pa und Burkholderia, wobei nicht-CF-MDM nicht reagierte, CF-MDM jedoch schon. Sie fanden auch keinen Einfluss von ETI auf die entzündliche Zytokinproduktion als Reaktion auf Burkholderia, ähnlich unseren Ergebnissen mit Pa (Abb. 5) und im Gegensatz zu Studien, die verringerte Zytokine mit Lumacaftor/Ivacaftor18 und in ganzen Wirten zeigten5,14,15.

Der Mechanismus, der den Auswirkungen von CFTR-Modulatoren auf die Nicht-CF-MDM-Phagozytose zugrunde liegt, ist nicht ganz klar, und es wurden Off-Target-Effekte in Betracht gezogen. Es schien keine größeren Auswirkungen von CFTR-Modulatoren auf das Pa-Wachstum oder die Pa-Motilität zu geben (Abb. 4), was die Unterschiede in der phagozytischen Effizienz erklären würde. Es ist wichtig anzumerken, dass diese Tests darauf ausgelegt sind, die Frage der Modulatorwirkungen in unserem In-vitro-System zu untersuchen und nicht die gesonderte Frage, ob Modulatoren Pa in den Atemwegen direkt beeinflussen, wo die Modulatorkonzentrationen nicht bekannt sind, aber wahrscheinlich niedriger sind .

Schließlich untersuchten wir die metabolischen Auswirkungen von CFTR-Modulatoren und entdeckten erneut unerwartete Folgen. Es wurde berichtet, dass Makrophagen von F508del/F508del CFTR-mutierten Mäusen im Vergleich zu WT-Gegenstücken eine beeinträchtigte Mitochondrienfunktion aufweisen33. Umgekehrt fanden Lara-Reyna et al.41 heraus, dass CF-Monozyten und MDM im Vergleich zu Nicht-CF-Monozyten sowohl eine Steigerung der Mitochondrienfunktion als auch der glykolytischen Aktivität aufweisen, wenn sie mit IFNγ und LPS stimuliert werden, ein Effekt, der auf die Aktivierung der entfalteten Proteinantwort zurückzuführen ist. Unseres Wissens ist dies die erste Studie zum primären menschlichen CF-Makrophagen-Metabolismus und zur Reaktion auf CFTR-Modulatoren. Im Gegensatz zu anderen experimentellen Systemen, die unterschiedliche Zelltypen verwenden42, 43, 44, fanden wir bei MDM keine konsistenten Unterschiede in der basalen oder maximalen Mitochondrienfunktion zwischen CF und Nicht-CF. Wir fanden jedoch eine starke, reproduzierbare Hemmung der mitochondrialen Atmung durch dreifache, nicht jedoch durch doppelte CFTR-Modulatoren (Abb. 2). Vermutlich ist dies auf die direkte Aktivität von Elexacaftor zurückzuführen, der Mechanismus der Hemmung ist jedoch derzeit nicht klar. Angesichts der Tatsache, dass die maximale Atmung in Gegenwart des Protonenentkopplers FCCP verringert wurde (Abb. 3), ist es möglich, dass dadurch das Mitochondrienmembranpotential direkt verringert wird. Bemerkenswerterweise waren die Effekte sowohl bei CF- als auch bei Nicht-CF-Makrophagen ähnlich. Angesichts der Tatsache, dass CFTR-Modulatoren bei anderen Atemwegserkrankungen wie der chronisch obstruktiven Lungenerkrankung von Interesse sind45,46,47, könnte dies das Verständnis der Modulatorwirkungen außerhalb von CF insbesondere beeinträchtigen. In unserem Labor laufen derzeit Studien, um den Mechanismus ihrer mitochondrialen Hemmung weiter aufzuklären. Interessanterweise haben Riquelme et al. beschrieben die Kolokalisierung des CFTR-Signals mit Mitochondrien in Atemwegsepithelzelllinien48 sowie veränderte mitochondriale Aktivitätsprofile in PBMC von CF-Patienten und in CFTR-Mutantenmäusen. Zu diesen Effekten gehörten erhöhte Superoxid- und Succinatspiegel. Die CFTR-Transfektion schien diese Phänotypen zu verbessern, die Wirkung von Modulatoren wurde jedoch nicht getestet. Es wurde auch eine aerobe Glykolyse bei CF-Neutrophilen in einer Weise beschrieben, die nach einer Lungentransplantation verschwindet, wobei argumentiert wird, dass der Effekt sekundär zu einer systemischen Entzündung und nicht zu einer CFTR innerhalb der Neutrophilen selbst ist49.

Darüber hinaus hemmten Pa-sekretierte Faktoren die Mitochondrienfunktion (Abb. 3), ein Effekt, der zuvor bei verschiedenen Zelltypen beschrieben wurde, darunter Mausleber50, Fibroblasten51 Epithelzellen52 und Krebszelllinien53.

Aerobe Glykolyse in Makrophagen ist klassischerweise mit einem proinflammatorischen Phänotyp verbunden, einschließlich erhöhter Phagozytose34,54, was möglicherweise mit einem Modell übereinstimmt, bei dem CFTR-Dreifachmodulatoren und Pa beide Makrophagen aktivieren und daher die Phagozytose verstärken. Dies erklärt jedoch nicht die Auswirkungen von TI, die dies hatten ein intermediärer Phagozytose-Phänotyp, aber keine Auswirkung auf den Stoffwechsel (Abb. 1 und 2). Letztendlich spielen wahrscheinlich viele Faktoren eine Rolle, die zum Endpunkt der Phagozytose führen.

Eine Stärke unserer Arbeit ist der direkte Vergleich zwischen den Auswirkungen von Vehikel, TI und ETI parallel in Zellen derselben Probanden. Dies ermöglicht es uns, spezifischere Wirkungen der Modulatoren besser herauszuarbeiten als Studien, die die Zellfunktion vor und nach der Aktivierung der Modulatoren untersuchen. ETI verursacht zahlreiche Effekte, darunter eine verringerte Schleimansammlung und einen anschließenden Rückgang der Bakterienlast, die indirekte nachgelagerte Auswirkungen auf die Monozyten-/Makrophagenfunktion haben können, wodurch die allgemeine Entzündung im Wirt verringert wird und daher die Fähigkeit eingeschränkt wird, Rückschlüsse auf die direkten Auswirkungen von Modulatoren auf Immunzellen zu ziehen. Unser experimentelles Design bietet daher einen ergänzenden Ansatz für Humanstudien vor/nach ETI, der die Abfrage von ETI-Effekten mit einer feineren Auflösung ermöglicht.

Zu den Einschränkungen dieser Arbeit gehört, dass alle CF-Freiwilligen dieser Studie zu Studienbeginn ETI einnahmen, was möglicherweise langfristige Auswirkungen auf die Monozytenbiologie, einschließlich epigenetischer Modifikationen, haben könnte13. In unserem System werden Monozyten jedoch während des Makrophagen-Differenzierungsprozesses in vitro sieben Tage lang kultiviert, bevor erneut CFTR-Modulatoren hinzugefügt werden, sodass Zeit zum Auswaschen der Arzneimittel bleibt. Andere haben ein Auswaschen der Modulatorwirkung in Monozyten nach 36 Stunden und 40 Minuten beobachtet. Darüber hinaus spricht die parallele Untersuchung von DMSO im Vergleich zu mit Modulatoren behandelten Zellen für direkte Auswirkungen der Modulatoren selbst und nicht für Übertragungseffekte aus der Modulatorbehandlung in vivo. Darüber hinaus liefern die Auswirkungen auf Nicht-CF-MDM, bei denen in der Vergangenheit keine Modulatorexposition aufgetreten ist, zusätzliche Belege für deren kurzfristige Auswirkungen. Unser Ex-vivo-System zur Untersuchung der Makrophagenfunktion gibt sicherlich keinen vollständigen Hinweis auf In-vivo-Bedingungen, bei denen über einen längeren Zeitraum viel mehr Wechselwirkungen stattfinden, aber es ermöglicht die Abfrage dieser Wechselwirkungen auf einer feineren Ebene, die zum Verständnis von Immunzellen und Bakterien beitragen kann Biologie.

Darüber hinaus sind MDM zwar leichter zu gewinnen und zu untersuchen als über bronchoalveoläre Lavage isolierte Lungenmakrophagen, weisen jedoch wichtige Unterschiede auf. In unserem Labor werden derzeit Untersuchungen durchgeführt, um festzustellen, ob die hier festgestellten Effekte in primären Lungenmakrophagen reproduziert werden. Schließlich sind die Konzentrationen von CFTR-Modulatoren in der Epithelauskleidungsflüssigkeit innerhalb der Alveolen nicht bekannt. Bei einzelnen Probanden wurden Konzentrationen von Ivacaftor im Sputum berichtet55,56 und sie scheinen im Bereich von 10- bis 100-fach niedriger zu liegen als die Serumkonzentrationen. Uns sind keine Studien bekannt, die direkt über die Konzentration in bronchoalveolärer Lavage oder Epithelauskleidungsflüssigkeit bei Menschen berichtet haben. Lungenmakrophagen existieren in einem Kontinuum von infiltrierenden Monozyten bis hin zu differenzierten Alveolarmakrophagen57, daher sind sie wahrscheinlich zunächst Serumkonzentrationen von Modulatoren ausgesetzt, gefolgt von den Konzentrationen in der Epithelauskleidungsflüssigkeit. Wir planen zukünftige Studien, um die Auswirkungen von Modulatoren in verschiedenen Dosen auf die Makrophagenfunktion sowie die Auswirkungen einzelner Modulatoren, die nicht in Kombination verwendet werden, zu ermitteln.

Zusammenfassend haben wir gezeigt, dass CFTR-Modulatoren die Phagozytose primärer menschlicher Makrophagen auf überraschend CFTR-mutationsunabhängige Weise positiv beeinflussen, was mit einer Hemmung der Mitochondrienfunktion verbunden war, ohne die Zytokinsekretion wesentlich zu verändern. Diese Studien werden zusammen mit zukünftigen Studien an primären Lungenmakrophagen, die funktionelle und transkriptionelle Reaktionen auf Modulatoren untersuchen, dazu beitragen, die Mechanismen der veränderten Phagozytose bei CF aufzuklären, mit dem Ziel, die Krankheitserregerkontrolle zu verbessern und die Bakterienlast in der CF-Lunge zu verringern.

Die zur Erstellung der Zahlen in diesem Manuskript verwendeten Primärdaten sind auf Anfrage bei DSA erhältlich.

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DSA wird von CFF ARIDGI20L0 und einem Dartmouth CFF RDP Pilot Award unterstützt. AA wird von NIH/NHLBI R01HL122372, ASHARE21G0, K24HL150453 und CFF ASHARE20P0 unterstützt. Der Dartmouth Translational Research Core wird unterstützt von: STANTO19R0 (CFF RDP), P30-DK117469 (NIDDK P30/DartCFCore-Einrichtungen unterstützt von P20-GM113132 (bioMT COBRE). DAH wird von CFF Hogan220 unterstützt.

Abteilung für Lungen- und Intensivmedizin, Dartmouth-Hitchcock Medical Center, Lebanon, NH, USA

Daniel S. Aridgides, Diane L. Mellinger, Lorraine L. Gwilt und Alix Ashare

Abteilung für Mikrobiologie und Immunologie, Dartmouth College, Geisel School of Medicine, Hanover, NH, USA

Thomas H. Hampton, Dallas L. Mould, Deborah A. Hogan und Alix Ashare

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Korrespondenz mit Daniel S. Aridgides.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Aridgides, DS, Mellinger, DL, Gwilt, LL et al. Vergleichende Wirkungen von CFTR-Modulatoren auf phagozytische, metabolische und entzündliche Profile von CF- und Nicht-CF-Makrophagen. Sci Rep 13, 11995 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-38300-9

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Eingegangen: 14. April 2023

Angenommen: 06. Juli 2023

Veröffentlicht: 25. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-38300-9

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