Proteomveränderungen von Fibroblasten und Endothelzellen nach Inkubation mit subviralen Dense Bodies des humanen Cytomegalievirus

Scientific Data Band 10, Artikelnummer: 517 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Das humane Zytomegalievirus (HCMV) ist ein Erreger mit hoher medizinischer Relevanz. Subviral Dense Bodies (DB) wurden als Impfstoffkandidat entwickelt, um die schwerwiegenden Folgen einer HCMV-Infektion zu lindern. Die Entwicklung eines solchen Impfstoffkandidaten für die Anwendung beim Menschen erfordert detaillierte Kenntnisse über seine Interaktion mit dem Wirt. Es wurde eine umfassende, auf Massenspektrometrie (MS) basierende Analyse der Veränderungen im Proteom von Zellkulturzellen durchgeführt, die DB ausgesetzt waren.

Das humane Zytomegalievirus (HCMV) ist ein β-Herpesvirus und weltweit die häufigste Ursache angeborener Infektionen, die zu einer Reihe von Folgeerscheinungen wie Hörverlust, Sehstörungen oder kognitiven Störungen führen1. Im Rahmen einer systemischen Immunsuppression kann eine HCMV-Infektion zu erheblicher Morbidität und Mortalität führen1. Mit HCMV infizierte Fibroblasten geben große Mengen nichtinfektiöser Partikel, sogenannte Dense Bodies, in den Zellkulturüberstand ab2,3. Massenspektrometrische Analysen isolierter DB haben zur Aufklärung ihrer Proteinzusammensetzung beigetragen und das Vorhandensein wichtiger Antigene der adaptiven Immunantwort gegen HCMV4,5 gezeigt. Mittlerweile haben In-vitro-Experimente und Tierstudien gezeigt, dass DB besonders immunogen sind und eine robuste Interferon (IFN)-Reaktion auslösen6,7,8,9,10,11. Daher gilt DB als vielversprechender Impfstoff gegen HCMV12,13. Im Hinblick auf die Anwendung eines Impfstoffkandidaten beim Menschen in klinischen Studien und für die endgültige Zulassung ist umfassendes Wissen über die Auswirkungen des Impfstoffs auf Wirtszellen wichtig, um mögliche Nebenwirkungen und Verträglichkeit beurteilen zu können. Mithilfe von Massenspektrometrie (MS) wurden Datensätze zum Einfluss von DB auf Kulturfibroblasten und Endothelzellen erstellt. Diese Datensätze wurden in einer früheren Veröffentlichung verwendet, die sich auf die Untersuchung der Interferon-β-Reaktion und der Induktion der Expression des Interferon-stimulierten Gens (ISG) in Fibroblasten und Endothelzellen bei DB-Exposition konzentrierte11.

Primäre menschliche Vorhautfibroblasten (HFF) wurden 1994 aus der Vorhaut eines Neugeborenen gewonnen und in der Vergangenheit für Forschungszwecke verwendet6,7,14,15,16. Die Genehmigung zur Verwendung dieser Zellen für die Studien wurde von der Ethikkommission der Landesärztekammer Rheinland-Pfalz eingeholt. HFF wurden in essentiellem Minimalmedium (MEM; Gibco-BRL, Glasgow, Schottland) gehalten, ergänzt mit 5 % fötalem Kälberserum (FCS), 100 mg/l L-Glutamin, 0,5 ng/ml basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF, Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland) und Gentamicin (5 mg/l). Für die Experimente wurden HFF-Zellpassagezahlen zwischen 16 und 19 verwendet. HEC-LTT-Zellen wurden von Dagmar Wirth und Mitarbeitern etabliert17. Die Zellen wurden aus menschlichen Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVECs) abgeleitet, die durch Tetracyclin-abhängige Expression des SV40-Large-T-Antigens und der humanen Telomerase-Reverse-Transkriptase (hTERT) bedingt immortalisiert wurden. Zur Kultivierung wurden Kulturgefäße mindestens 30 Minuten lang mit 0,1 % Gelatine (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO;) beschichtet. HEC-LTT-Zellen wurden in Endothelwachstumsmedium (EGM BulletKit; Lonza Sales Ltd., Basel, Schweiz) gehalten, ergänzt mit 2 μg/ml Doxycyclin (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO). Die Proliferation von HEC-LTT-Zellen kann durch Doxycyclin (DOX) kontrolliert werden. Die Zugabe von DOX aktiviert die Expression der immortalisierenden Proteine hTERT und SV40-Large-T-Antigen, was zur Zellproliferation führt. Auf Doxycyclin wurde während der gesamten Versuche verzichtet. Die Erlaubnis zur Nutzung von HEC-LTT-Zellen zu Forschungszwecken wurde durch eine Materialtransfervereinbarung des Helmholtz-Zentrums für Infektionsforschung (HZI) erteilt. Es wurde gezeigt, dass die Zellen eine HCMV-Infektion zulassen18. HEC-LTT wurden uns freundlicherweise von Christian Sinzger (Institut für Virologie, Universitätsklinikum Ulm, Deutschland) zugesandt und für Experimente von Passage 41 bis Passage 55 verwendet.

Virussaatbestände wurden aus Überständen von transfiziertem HFF hergestellt. Kurz gesagt, der Stamm Towne-repΔGFP (im Folgenden als TR-∆GFP bezeichnet) wurde durch Transfektion von bakterieller künstlicher Chromosomen-DNA (BAC), die das Towne-repΔGFP-Genom enthielt, in HFF rekonstituiert. Die Generierung des BAC-Klons wurde von Lehmann et al.7 beschrieben. Transfizierte Zellen wurden vermehrt, bis 100 % der Zellen zytopathische Effekte (CPE) zeigten. Die virushaltigen Überstände dieser Kulturen wurden geerntet und durch 10-minütige Zentrifugation bei 1.475 × g von Zelltrümmern befreit und dann zur weiteren Vermehrung des Virus als Virussamenvorräte bei –80 ° C gelagert.

Virus-Versuchsvorräte wurden aus Überständen von HFF hergestellt, die mit Virus-Saatvorräten infiziert waren. Hierzu wurden HFF in einer Dichte von 1,8 × 106 in fünf 175-cm2-Gewebekulturflaschen ausgesät und mit 5 ml Virusinokulum pro Flasche infiziert. Hierzu wurden 1 ml des TR-∆GFP-Samenstammüberstands und 4 ml 5 %iges MEM-Medium gemischt und 1,5 Stunden lang zu den Zellen gegeben. Dann wurden 15 ml frisches 5 %iges MEM-Medium hinzugefügt und die infizierten Zellen wurden bei 37 °C inkubiert, bis die Kulturen einen vollständigen CPE zeigten. Die Zellkulturüberstände wurden geerntet und kombiniert. Zelltrümmer wurden durch 10-minütige Zentrifugation bei 1.475 × g bei Raumtemperatur entfernt. Abschließend wurden die Überstände in Gefrierröhrchen bei –80 °C gelagert.

Zur Reinigung dichter Körper wurden zwanzig 175-cm2-Gewebekulturflaschen mit 1,8 × 106 HFF mit 1 ml gefrorenem Virusüberstand des HCMV-Stamms TR-ΔGFP, verdünnt in 4 ml 5 % MEM-Medium, infiziert. Nach 1,5-stündiger Virusadsorption wurden 15 ml frisches 5 %iges MEM-Medium, ergänzt mit 50 nM Letermovir (LMV), zugegeben und HFF mindestens 7 Tage lang inkubiert. LMV wurde dem Zellkulturmedium alle 3 Tage nach der Erstinfektion zugesetzt. LMV ist ein hochspezifischer Inhibitor des HCMV-Terminasekomplexes und hemmt nachweislich die HCMV-Replikation in Zellkulturen, indem es die Spaltung/Verpackung von HCMV-Genomen in Kernkapsiden stört19. Überstände von infiziertem HFF, die eine vollständige zytopathogene Wirkung (CPE) zeigten, wurden geerntet und grobe Zelltrümmer wurden durch 10-minütige Zentrifugation bei 1.475 × g entfernt. Anschließend wurden die Viruspartikel durch Ultrazentrifugation bei 95.000 × g für 70 Minuten bei 10 °C unter Verwendung eines 45Ti-Rotors in einer Beckman Optima L-90K-Ultrazentrifuge pelletiert. Zur Fraktionierung der Partikel wurden die Pellets in 2 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) resuspendiert und auf Glycerin-Tartrat-Dichtegradienten geladen. Zur Gradientenvorbereitung wurden 5 ml einer 35 %igen Na-Tartrat-Lösung in 0,04 M Na-Phosphat-Puffer, pH 7,4 und 4 ml einer 15 %igen Na-Tartrat-30 %-Glycerin-Lösung in 0,04 M Na-Phosphat-Puffer, pH 7,4 verwendet in einem Gradientenmischer gemischt und in einem Winkel von 45° in ein Polycarbonat-Zentrifugenröhrchen (14 ml; Beckman Ultra-Clear-Zentrifugenröhrchen) gegeben. Die Gradienten wurden mit 1 ml der konzentrierten Viruspartikelsuspension überschichtet und in einem Beckman SW41Ti-Ausschwingrotor 60 Minuten lang bei 90.000 × g und 10 ° C ohne Verzögerung zentrifugiert. Anschließend wurde die DB-Fraktion durch Lichtstreuung sichtbar gemacht und durch Durchstechen des Röhrchens mit einer Spritze gesammelt. Die aus DB-haltigen Gradienten gesammelten Fraktionen wurden mit 10 ml PBS gewaschen und DB durch Ultrazentrifugation unter Verwendung eines SW41Ti-Ausschwingrotors für 90 Minuten bei 98.000 × g und 10 ° C konzentriert. Abschließend wurde das DB-Pellet in 250 µl PBS resuspendiert. Aliquots von 30 µl wurden hergestellt und bis zur weiteren Verwendung bei –80 °C gelagert. Zur Bestimmung der DB-Proteinkonzentrationen wurde das Pierce™ BCA Protein Assay Kit (23225, ThermoFisher Scientific, Darmstadt, Deutschland) gemäß dem Protokoll des Herstellers verwendet.

DB wurden kurz vor der Anwendung auf Zellen aufgetaut und mit ultraviolettem (UV) Licht bestrahlt. Nach der Resuspension in einem Gesamtvolumen von 120 µl PBS wurden DB auf eine Spotplatte übertragen und 2 Minuten lang bei einer Wellenlänge von 254 nm UV-bestrahlt. Anschließend wurden 100 µl der UV-bestrahlten DB/PBS-Lösung mit 2,9 ml Kulturmedium gemischt und zu den Zellen gegeben.

HFF wurde mit einer Dichte von 0,5 × 106 in zwei 10-cm-Schalen ausgesät. Am nächsten Tag wurden 20 µg TR-∆GFP-abgeleitetes DB UV-bestrahlt und zu jeder Schale gegeben. Das DB-Inokulum wurde 2 Stunden lang inkubiert. Anschließend wurden 7 ml MEM-Medium hinzugefügt und die Zellen weitere 22 Stunden inkubiert. Anschließend wurde das Medium entfernt und die Zellen zweimal mit PBS gewaschen. Die HFF von zwei Schalen wurden gepoolt und die Zellzahl bestimmt. 1 × 106 Fibroblasten wurden in 40 µl 2x Laemmli-Puffer ohne Bromphenolblau-Färbung lysiert und 10 Minuten lang auf 99 °C erhitzt. Nach dem Abkühlen wurden NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) (Life Technologies) und 100 mM DTT hinzugefügt und die Proben weitere 10 Minuten bei 70 °C inkubiert.

Endothelzellen wurden in einer Dichte von 0,6 × 106 in zwei 10-cm-Schalen ohne Doxycyclin ausgesät. ECs wurden 40 µg UV-bestrahltem DB des HCMV-Stammes TR-∆GFP ausgesetzt. Die folgenden Schritte wurden wie für HFF beschrieben durchgeführt.

Die Proteine wurden auf ein 10 % NuPAGE Bis-Tris-Gel geladen und kurz aufgelöst. Anschließend wurde das Gel mit Coomassie-Blau gefärbt und mit einem sauberen Skalpell in kleine Würfel geschnitten. Die Gelentfärbung wurde in 50 % Ethanol/25 mM Ammoniumbicarbonat durchgeführt. Die Proteinreduktion erfolgte in 10 mM DTT bei 56 °C, gefolgt von einer Alkylierung in 50 mM Iodacetamid im Dunkeln bei Raumtemperatur. Trypsin (1 µg pro Probe) wurde verwendet, um die Proteine in 50 mM TEAB-Puffer (Triethylammoniumbicarbonat) über Nacht bei 37 °C zu verdauen. Die Peptidextraktion wurde nacheinander in 30 % und 100 % Acetonitril durchgeführt. Anschließend wurde das Probenvolumen in einem Zentrifugalverdampfer reduziert, um restliches Acetonitril zu entfernen. Anschließend wurde die Probe mit 100 mM TEAB aufgefüllt, um ein endgültiges Probenvolumen von 100 µl zu erreichen.

Gemäß dem experimentellen Designschema20 wurden die verdauten Proben durch Zugabe von 4 µl 4 %iger Formaldehyd-, Formaldehyd-d2- oder Formaldehyd-13C-, d2-Lösung als „Leicht“, „Mittel“ oder „Schwer“ gekennzeichnet. Anschließend wurden 4 µl 0,6 M NaBH3CN (zur „leichten“ oder „mittleren“ Probe) oder NaBD3CN (zur „schweren“ Probe) hinzugefügt. Anschließend wurden die Proben 1 Stunde lang unter orbitalem Schütteln bei Raumtemperatur inkubiert. Die Markierungsreaktion wurde dann durch Zugabe von 19 µl 1 M Ammoniumbicarbonat (Endkonzentration 150 mM) gelöscht und 15 Minuten lang bei Raumtemperatur unter Orbitalschütteln inkubiert. Anschließend wurden die Peptide mit Ameisensäure angesäuert, um einen pH-Wert von ~3 zu erreichen. Die gepaarten markierten Proben wurden dann kombiniert. Die resultierende Peptidlösung wurde durch Festphasenextraktion in C18 StageTips21) gereinigt.

Die Peptide wurden in einer hauseigenen gepackten 30-cm-Analysesäule (Innendurchmesser: 75 μm; ReproSil-Pur 120 C18-AQ 1,9 μm-Perlen, Dr. Maisch GmbH; erhitzt auf 40 °C) durch Online-Umkehrphasenchromatographie aufgetrennt ein 225-minütiger nichtlinearer Gradient von 1,6–32 % Acetonitril mit 0,1 % Ameisensäure bei einer Nanoflussrate von 225 nl/min. Die eluierten Peptide wurden direkt durch Elektrospray-Ionisation in ein Q Exactive Plus Orbitrap-Massenspektrometer (Thermo Scientific) gesprüht. Die datenabhängige Erfassung erfolgte mittels einer Top10-Methode. Nach jedem vollständigen Scan (Massenbereich: 300 bis 1.650 m/z; Auflösung: 70.000, Zielwert: 3 × 106, maximale Injektionszeit: 20 ms) wurden bis zu 10 MS2-Scans mittels Kollisionsdissoziation mit höherer Energie (normalisierte Kollisionsenergie) durchgeführt : 25 %, Auflösung: 17.500, Zielwert: 1 × 105, maximale Injektionszeit: 120 ms, Isolationsfenster: 1,8 m/z). Die Auswahl des Ladungszustands erfolgte durch Zurückweisen von Vorläuferionen mit nicht zugewiesenem oder +1-Ladungszustand. Die dynamische Ausschlusszeit wurde auf 35 s eingestellt.

Rohdatendateien wurden mit dem MaxQuant-Softwarepaket (Version 2.1.3.0)22 unter Verwendung der Andromeda-Suchmaschine23 verarbeitet. Spektraldaten wurden anhand einer Ziel-Köder-Datenbank durchsucht, die aus den Vorwärts- und Rückwärtssequenzen von UniProt-Proteomen bestand, die am 10. August 2022 heruntergeladen wurden und für die spezifischen Taxon-IDs aufgeführt sind (ID 9606, H. sapiens, 79759 Einträge; ID 10359, HCMV, 17993 Einträge; ID 10363, HCMV Town-Stamm, 304 Einträge) und eine Liste von 246 häufigen Kontaminanten. Entsprechende Dimethylmarkierungen wurden gemäß dem Markierungsschema als „Leicht“ (DimethLys0 und DimethNter0), „Mittel“ (DimethLys4 und DimethNter4) und „Schwer“ (DimethLys8 und DimethNter8) zugewiesen. Für jedes Peptid waren bis zu 3 markierte Aminosäuren zulässig. Trypsin/P wurde wegen der Enzymspezifität ausgewählt. Als feste Modifikation wurde die Carbamidomethylierung von Cystein ausgewählt. Die Protein-N-Terminus-Acetylierung und die Oxidation von Methionin wurden in variablen Modifikationen zugeordnet. Bis zu 2 fehlende Spaltungen wurden toleriert. Eine Mindestpeptidlänge von 7 Aminosäuren war erforderlich. Sowohl für die Peptid- als auch für die Proteinidentifizierung wurde eine Falscherkennungsrate (FDR) von 1 % gewählt.

Für die Proteinquantifizierung wurde die Mindestverhältniszahl auf eins festgelegt. Zur Quantifizierung wurden sowohl die Unique- als auch die Razor-Peptide verwendet. Die Funktion „Requantifizieren“ wurde eingeschaltet. Auch die Option „Erweiterte Verhältnisschätzung“ wurde gewählt. Rückwärtstreffer und potenzielle Verunreinigungen wurden herausgefiltert. Proteingruppen mit mindestens einem einzigartigen Peptid blieben erhalten. Die Verhältnisse der mit Etiketten ausgetauschten Proben wurden invertiert, um die Behandlung dichter Körper (DB) gegenüber der Kontrolle für alle technischen und biologischen Replikate darzustellen. Die normalisierten Verhältnisse wurden dann log2-transformiert und medianzentriert. Anschließend wurden die Verhältnisse der technischen Replikate, die zu demselben biologischen Replikat gehörten, gemittelt, wobei der fehlende Wert, falls vorhanden, ignoriert wurde.

Im Anschluss an die oben genannten Schritte wurde eine statistische Analyse zur Identifizierung unterschiedlich regulierter Proteine mit dem Limma-Softwarepaket in R24 durchgeführt. Bei Fibroblasten wurden Proteine mit Verhältnissen in mindestens drei von fünf biologischen Replikaten beibehalten. Für Endothelzellen wurden Proteine mit Verhältnissen in mindestens zwei biologischen Replikaten beibehalten. Anschließend wurde ein lineares Modell angepasst, um die Verhältnisse für jedes Protein ohne weitere Anpassung für mehrere Tests zu ermitteln. Die log2-fache Änderung und die Signifikanz der Differenz wurden in einem Vulkandiagramm dargestellt. Nur Proteine mit einer minimalen log2-fachen Änderung von 1 und einem ap-Wert von weniger als 0,05 wurden als differenziell reguliert angesehen.

In unserer Proteomics-Studie untersuchten wir die Auswirkungen der Inkubation von HCMV Dense Bodies (DB) auf zwei verschiedene Zelltypen. Die Veränderungen im zellulären Proteom von Fibroblasten- oder Endothelzellen bei DB-Anwendung wurden mit scheinbehandelten Referenzproben verglichen.

Anhand von fünf biologischen Replikaten wurden nach mehreren Schritten der Stringenzfilterung und Limma-Analyse insgesamt 3757 Proteingruppen in Fibroblasten identifiziert. Bei einem zweifachen Cut-off blieben 153 Proteine übrig, von denen 68 einen ap-Wert von weniger als 0,05 aufwiesen. Diese 68 Proteine wurden 24 Stunden nach der DB-Anwendung auf Fibroblasten als unterschiedlich exprimiert angesehen und sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die Ergebnisse sind in einem Vulkandiagramm in Abb. 1a dargestellt. Im Vergleich zu scheinbehandelten Zellen waren in DB-behandelten Zellen 33 Proteine hochreguliert, während 35 herunterreguliert waren. Um die Beziehungen zwischen den 68 unterschiedlich exprimierten Proteinen zu charakterisieren, wurde das Online-Tool STRING (http://string-db.org/, abgerufen am 16.05.2023) zur Analyse der interagierenden Partner eingesetzt. Die in Abb. 1b dargestellte Netzwerkanalyse der Protein-Protein-Interaktion (PPI) zeigt einen Hauptcluster, der aus Proteinen besteht, die in biologischen Prozessen der Typ-I-Interferon-Reaktion, der Abwehrreaktion auf Viren, der Reaktion auf Viren und Zytokin-vermittelten Signalwegen eine Rolle spielen (Abb . 1b). Das Balkendiagramm in Abb. 1c zeigt die angereicherten biologischen Prozesse, geordnet nach steigenden False Discovery Rates (FDR). Bemerkenswerterweise wurde bei der Übermittlung der 68 veränderten Proteine an das Online-Tool der Interferome-Datenbank (v2.01, abgerufen am 20. November 202225) die Mehrheit (66 %) als Interferon-stimulierte Gene (ISGs) identifiziert (Abb. 1d). .

Proteomanalyse DB-regulierter Proteine in HFF. HFF wurden scheinbehandelt oder mit 20 µg UV-inaktiviertem DB, abgeleitet von TR-∆GFP, inkubiert. Zelllysate wurden 24 Stunden nach der DB-Anwendung einer Gesamtproteom-MS/MS-Analyse unterzogen. (a) Vulkandiagramm, das die log2-fache Änderung (x-Achse) gegenüber der Signifikanz (y-Achse) der insgesamt 3757 Proteine zeigt, die in fünf biologischen Replikaten nachgewiesen wurden. Die gepunkteten Linien in Orange zeigen die Cut-off-Fold-Änderung von ±1,0 und einen p-Wert von 0,05. Die Signifikanz (nicht angepasster p-Wert) und die Faltungsänderung werden in −log10 (p-Wert) bzw. log2-Faltungsänderung umgewandelt. Es gab 33 Proteine, die mit einem p-Wert < 0,05 um das > 1,0-fache erhöht waren (grüne Punkte), und 35 Proteine, die mit einem p-Wert < 0,05 um das < − 1,0-fache verringert waren (rote Punkte). Das HCMV-Tegumentprotein pp65 (UL83) ist orange hervorgehoben und sein Nachweis wurde als Positivkontrolle verwendet, was auf die DB-Internalisierung in HFF hinweist. Das Vulkandiagramm wurde mit der R-Software erstellt. (b + c) Analyse der Protein-Protein-Interaktion (PPI) und funktionelle Klassifizierung der regulierten Proteine in HFF nach DB-Stimulation. (b) Anzeige des STRING-PPI-Netzwerks, das bei der Eingabe der 68 regulierten Proteine in die STRING-Datenbank generiert wurde. Die Netzwerkknoten repräsentieren alle Proteine, die von einem einzelnen proteinkodierenden Genort produziert werden. Knoten sind entsprechend ihrer Funktion in den in c angegebenen biologischen Prozessen gefärbt. Graue Knoten zeigen Proteine an, die mit den Input-Proteinen verbunden sind, aber keinen Zusammenhang mit den biologischen Prozessen haben. Die Verbindungen spiegeln die Proteininteraktion wider und die Linienstärke gibt die Stärke der Datenunterstützung an, wobei ein hoher Konfidenzgrenzwert mit einem Wert von 0,7 verwendet wird. Proteine ohne Interaktion mit anderen Proteinen im Netzwerk wurden entfernt. (c) Balkendiagramm der biologischen Prozesse, verbunden mit den Proteinen, die nach DB-Stimulation in HFF reguliert wurden. Die Anordnung erfolgte nach steigenden False Discovery Rates (FDR). Die y-Achse stellt biologische Prozesskategorien dar, während die x-Achse die Anzahl der an jeder Kategorie beteiligten Gene angibt. (d) Heatmap der 45 veränderten ISGs. Die Expressionsmuster wurden hierarchisch angeordnet, basierend auf dem Mittelwert des log2-umgerechneten normalisierten Verhältnisses von 5 biologischen Replikaten. Der log2FC wird mit einem Farbverlauf dargestellt. IFN, Interferon; ISG, Interferon-stimuliertes Gen; STRING, Suchtool zum Auffinden interagierender Gene.

Zelluläre Proteine, die durch die Exposition von Dense Bodies gegenüber Endothelzellen reguliert werden, wurden anhand von mindestens zwei biologischen Replikaten analysiert. Auf der Grundlage der zuvor verwendeten Filterkriterien wurde festgestellt, dass 83 veränderte Proteine (in Tabelle 2 aufgeführt) unterschiedlich reguliert sind und im Vulkandiagramm in Abb. 2a dargestellt sind. Um die Auswirkungen der DB-Behandlung auf zelluläre Signalwege zu identifizieren, wurde die STRING-Datenbank (https://string-db.org, abgerufen am 20.10.2022) verwendet. Das PPI-Netzwerk in Abb. 2b zeigt die Wechselwirkungen zwischen den 83 regulierten Proteinen unter Verwendung des Interaktionswerts mit hoher Konfidenz von 0,7. Jedes der unterschiedlich exprimierten Proteine wurde drei oder vier großen funktionellen Netzwerken zugeordnet, die durch die Hub-Proteine CDK1 oder TP53 verbunden waren. Ein Cluster besteht aus den Proteinen MX1, ISG15, BST2 und IRF3, von denen bekannt ist, dass sie im Typ-I-Interferon-Signalweg funktionieren. Die anderen beiden stark verbundenen Netzwerke umfassen CDKs und KIF-Proteine, die beide mit dem Zellzyklus assoziiert sind. Die zehn wichtigsten Kategorien biologischer Prozesse, die durch DB-Anwendung in Endothelzellen angereichert wurden, sind im Balkendiagramm in Abb. 2c dargestellt und nach steigenden False Discovery Rates (FDR) geordnet. Die 83 Proteine wurden an die Interferome-Datenbank übermittelt (v2.01, abgerufen im November 2022)25. 60 Proteine wurden als Interferon-stimulierte Gene identifiziert, von denen die meisten herunterreguliert waren (Abb. 2d).

Quantitative proteomische Analyse unterschiedlich regulierter Proteine in DB-behandelten ECs. Endothelzellen wurden mit 40 µg UV-inaktiviertem DB (Stamm TR-∆GFP) inkubiert oder unbehandelt gelassen. Zelllysate wurden 24 Stunden nach der Anwendung hergestellt und einer Proteomanalyse unterzogen. (a) Die 2719 durch MS aus drei biologischen Replikaten identifizierten Proteine werden in einem Vulkandiagramm entsprechend ihrem statistischen p-Wert (y-Achse) und ihrem relativen Häufigkeitsverhältnis (log2-fache Änderung) zwischen DB- und scheinbehandelten Zellen angezeigt ( x-Achse). Rote Punkte zeigen unterschiedlich exprimierte Proteine an, die nach der DB-Behandlung signifikant herunterreguliert wurden (Fachveränderung > 1,0; p < 0,05). Blaue Punkte zeigen unterschiedlich exprimierte Proteine an, die signifikant hochreguliert waren (Fachänderung < 1,0; p < 0,05). Das virale Tegumentprotein pp65 (UL83) ist orange hervorgehoben und wurde als Kontrolle für die DB-Internalisierung in ECs verwendet. Das Vulkandiagramm wurde mit der R-Software erstellt. (b) STRING-Protein-Protein-Interaktionsnetzwerk der 83 Proteine, die bei DB-Behandlung unterschiedlich in ECs exprimiert wurden. Proteine ohne Assoziationen zu anderen Proteinen im Netzwerk wurden entfernt. Netzwerkknoten repräsentieren alle Proteine, die von einem einzelnen proteinkodierenden Genort produziert werden. Die Linien stellen die Proteininteraktion dar und die Linienstärke gibt die Stärke der Datenunterstützung mit einem Mindestkonfidenzwert von 0,7 (hohes Konfidenzniveau) an. (c) Balkendiagramm der angereicherten biologischen Prozesse, die mit unterschiedlich exprimierten Proteinen verbunden sind. Die zehn am häufigsten angereicherten biologischen Prozesse sind nach steigenden False Discovery Rates (FDR) geordnet. Die y-Achse stellt biologische Prozesskategorien dar, während die x-Achse die Anzahl der an jeder Kategorie beteiligten Gene angibt. (d) 60 unterschiedlich regulierte Proteine wurden als IRGs bezeichnet. Der log2FC wird mit einem Farbverlauf dargestellt. Die 20 hochregulierten ISGs sind in Blau und die 40 herunterregulierten ISGs in Rot dargestellt. STRING, Suchtool zum Auffinden interagierender Gene.

Die Validierung der hier bereitgestellten MS-Analysen wurde an anderer Stelle veröffentlicht11. In dieser Studie haben wir die Expression der ausgewählten Proteine MX1, IFIT3 und ISG15 in Fibroblasten und Endothelzellen mithilfe von Western-Blot-Analysen untersucht. Die Western-Blot-Ergebnisse stimmten mit den aus den MS-Daten erhaltenen Ergebnissen überein. Es konnte ein starker Anstieg der Expressionsniveaus aller drei Proteine nach der DB-Behandlung bestätigt werden. Obwohl die Faltungsänderungen in den Immunblot-Analysen im Vergleich zu den MS-Daten bei 24 hpa nicht identisch waren, waren die Tendenzen ähnlich. Zusammengenommen zeigen diese experimentellen Ergebnisse, dass unsere Proteomikdaten zuverlässig sind.

Alle Massenspektrometrie-Rohdaten, Fasta-Dateien und Direktausgabetextdateien aus der MaxQuant-Analyse sind im Partner-Repository Proteomics Identifications (PRIDE) verfügbar20 (http://www.ebi.ac.uk/pride/archive/projects/PXD039032)26.

Um die Konsistenz zwischen den verschiedenen DB-Präparaten zu gewährleisten, wurden HFF derselben Passage mit derselben Charge des HCMV TR-∆GFP-Überstandsstamms infiziert.

Nach jeder Präparation wurden gereinigte Dense Bodies auf ihre Fähigkeit getestet, in Zellen einzudringen. Hierzu wurde eine Kernfärbung des viralen Haupttegumentproteins pp65 als Beweis für den Eintritt in Zellen herangezogen26,27. 2 × 105 HFF oder ECs wurden auf Deckgläsern gezüchtet und mit 5 µg (HFF) oder 10 µg (ECs) DB von TR-∆GFP inkubiert und einen Tag nach der Anwendung mittels Immunfluoreszenzmikroskopie analysiert. Die Zellen wurden mit 90 % Aceton fixiert. Die nukleare Lokalisierung von DB-abgeleitetem pp65 wurde mithilfe eines pp65-spezifischen monoklonalen Antikörpers und eines Anti-Maus-Alexa Fluor® 546-Konjugat-Sekundärantikörpers nachgewiesen. Zellkerne wurden mit DAPI (Sigma-Aldrich) gegengefärbt. Die Visualisierung erfolgte durch Fluoreszenzmikroskopie mit einem Axiophot-Mikroskop, das mit einer SPOT Flex-Kamera FX1520 (Zeiss, Jena, Deutschland) ausgestattet war.

Um mögliche technische und biologische Variationen zu berücksichtigen, wurde die Studie sowohl mit technischen Replikaten als auch mit mehreren biologischen Replikaten (5 für Fibroblasten; 2 für Endothelzellen) durchgeführt. Die durch die HCMV-DB-Behandlung induzierte Regulierung der Proteinhäufigkeit war in allen biologischen Replikaten in beiden Zelltypen im Allgemeinen konsistent, insbesondere im Hinblick auf die Induktion der Repression einzelner Proteine (Abb. 3, 4 und 5). Wie im Abschnitt „Methoden“ beschrieben, haben wir mehrere Schritte der Stringenzfilterung der Daten durchgeführt. Um Proteine zu identifizieren, die über biologische Replikate hinweg konsistent reguliert wurden, verwendeten wir die lineare Modellierung, um die Bedeutung der Regulierung zu quantifizieren. Aufgrund des Batch-Effekts beobachteten wir bei den Replikaten 4 und 5 im Vergleich zu den ersten drei Replikaten weniger Quantifizierungsereignisse und geringere Intensitäten. Trotzdem machte der Isotopenmarkierungsansatz mittels Dimethylmarkierung den Vergleich zwischen den Bedingungen innerhalb jedes Replikats robust (Abb. 3). Dennoch haben wir die Anforderungen an die Stringenzfilterung von der Erkennung in zwei von fünf Replikaten auf mindestens drei im Fibroblastendatensatz weiter erhöht.

Reproduzierbarkeit der nachgewiesenen Protein-Log2-Verhältnisse von DB-behandelten gegenüber der Kontrolle in fünf Replikaten von Fibroblasten. Die Diagonale zeigt eine perfekte Ausrichtung an. Das virale Protein UL83 wird wie erwartet hochreguliert. Beachten Sie, dass in Replikat 3 zwei verschiedene Isoformen des UL83-Proteins nachgewiesen wurden.

Erkannte Proteinintensitäten von DB-behandelten im Vergleich zur Kontrolle in den fünf Replikaten von Fibroblasten. Jedes Kästchen stellt den Medianwert und den Interquartilbereich dar.

Reproduzierbarkeit der nachgewiesenen Protein-Log2-Verhältnisse von DB-behandelten gegenüber der Kontrolle in drei Replikaten von Endothelzellen. Die Diagonale zeigt eine perfekte Ausrichtung an. Es wurde bestätigt, dass das virale Protein UL83 wie erwartet hochreguliert ist.

Datenanalyseverfahren wurden im Abschnitt „Methoden“ ausführlich beschrieben. Code für die in R durchgeführte statistische Analyse ist als Ergänzungsdatei verfügbar.

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Diese Arbeit wurde durch Stipendien der Wilhelm-Sander-Stiftung, Fördernummern 2016.115.1 und 2020.003.1, unterstützt.

Open-Access-Förderung ermöglicht und organisiert durch Projekt DEAL.

Institut für Virologie, Universitätsmedizin der Johannes Gutenberg-Universität Mainz, Deutschland

Inessa Penner & Bodo Plachter

Institut für Molekularbiologie, Johannes Gutenberg-Universität, Mainz, Deutschland

Mario Dejung, Anja Freiwald, Falk Butter & Jia-Xuan Chen

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Konzeptualisierung, IP und BP; Datenkuration, IP, MD und JXC; Formale Analyse, IP, FB und BP; Finanzierungsakquise, BP; Untersuchung, IP und BP; Methodik, IP, MD und JXC; Aufsicht, BP; Validierung, IP, MD, AF, JXC; FB und BP; Schreiben – Originalentwurf, IP und BP; Schreiben, Begutachtung und Bearbeitung, JXC Alle Autoren haben die veröffentlichte Version des Manuskripts gelesen und ihr zugestimmt.

Korrespondenz mit Bodo Plachter.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Penner, I., Dejung, M., Freiwald, A. et al. Proteomveränderungen von Fibroblasten und Endothelzellen nach Inkubation mit subviralen Dense Bodies des humanen Cytomegalievirus. Sci Data 10, 517 (2023). https://doi.org/10.1038/s41597-023-02418-2

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Eingegangen: 19. Januar 2023

Angenommen: 25. Juli 2023

Veröffentlicht: 04. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41597-023-02418-2

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