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Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 11687 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Candida albicans, ein häufiger Pilz der menschlichen Flora, kann zu einem opportunistischen Krankheitserreger werden und bei immungeschwächten Personen eine invasive Candidiasis verursachen. Die Bildung von Biofilmen ist die Hauptursache für Antibiotikaresistenzen bei Infektionen mit C. albicans, und die Behandlung biofilmbildender Zellen ist aufgrund ihrer hartnäckigen und persistenten Natur eine Herausforderung. Ziel der Studie ist es, das therapeutische Potenzial natürlich produzierter Verbindungen durch konkurrierende Meeresbakterien, die in marinen Biofilmen leben, gegen den C. albicans-Biofilm zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurde festgestellt, dass 3-Hydroxycumarin (3HC), eine Verbindung, die aus dem zellfreien Kulturüberstand des Meeresbakteriums Brevundimonas abyssalis identifiziert wurde, eine Anti-Biofilm- und Anti-Hyphen-Aktivität sowohl gegenüber Referenz- als auch klinischen Isolaten von C. Albicaner. Bei der minimalen Biofilm-Hemmkonzentration (MBIC) von 250 µg mL-1 zeigte die Verbindung erhebliche hemmende Wirkungen auf Biofilme und beeinträchtigte den Übergang von der Hefe zur Hyphe, die Faltenbildung und die Filamentmorphologie. Interessanterweise ergab die quantitative PCR-Analyse des mit 3HC behandelten C. albicans-Biofilms eine signifikante Herunterregulierung der Virulenzgene (hst7, ume6, efg1, cph1, ras1, als1), die mit Adhäsion und Morphogenese verbunden sind. Darüber hinaus zeigte 3HC nicht fungizide und nicht toxische Eigenschaften gegenüber menschlichen Erythrozyten und Wangenzellen. Zusammenfassend zeigte diese Studie, dass marine Biofilme eine versteckte Quelle verschiedener therapeutischer Medikamente sind und 3HC ein wirksames Medikament zur Behandlung von C. albicans-Infektionen sein könnte.

Candida albicans ist ein kommensaler polymorpher Pilz, der im Allgemeinen die menschliche Haut und die Oberfläche von Schleimhäuten besiedelt. Unter bestimmten Bedingungen wie einem Versagen des Immunsystems und einem Ungleichgewicht der Mikrobiota kann diese Pilzart jedoch pathogen werden und oberflächliche orale und vaginale Candidiasis sowie invasive Candidiasis verursachen1,2. Studien haben jährlich fast 50.000 Todesfälle aufgrund invasiver Candidiasis verzeichnet, wobei C. albicans die am häufigsten gemeldete Art ist und 40–50 % der Fälle ausmacht3,4. Der wichtigste Faktor, der die Pathogenese von C. albicans begünstigt, ist seine Fähigkeit, sowohl auf biotischen als auch auf abiotischen Oberflächen einen Biofilm zu bilden, gefolgt von anderen wichtigen Virulenzmerkmalen, wie Übergängen von Hefe zu Hyphe, filamentöser Morphologie, Faltenmorphologie und Sekretion von proteolytischen und lipolytischen Enzymen5. Darüber hinaus ermöglichen Virulenzmerkmale wie Adhäsion, Hyphen- und Biofilmbildung C. albicans den Zugang zu tieferen Geweben für systemische Infektionen. Der Kampf gegen die Virulenzmerkmale von C. albicans umfasst vier Hauptklassen von Antimykotika, darunter Polyene, Echinocandine, Nukleosidanaloga und Azole6,7. Es wurde jedoch festgestellt, dass die Bildung von Biofilmen durch C. albicans zu einer genetischen Resistenz gegen die meisten derzeit verwendeten Antimykotika führt. Daher besteht ein dringender Bedarf an alternativen Therapeutika zur Bekämpfung von Biofilm-vermittelten Infektionen und zur Überwindung der Grenzen aktueller Antimykotika-Therapien. In diesem Umfeld ist die Suche nach neuartigen Anti-Candida-Verbindungen unerlässlich, insbesondere aus natürlichen Umgebungen wie der Meeresumwelt.

Die Nutzung natürlicher Produkte, beispielsweise aus Meeresbakterien gewonnener Verbindungen, bietet neue Perspektiven für die Entwicklung neuartiger Arzneimittelwirkstoffe. Unter natürlichen Umweltbedingungen bestehen marine Biofilme aus eng beieinander liegenden multispeziesischen Bakteriengemeinschaften mit großem Metaboliten- und Proteinaustausch sowie koordinierten Lebensstilen. Diese komplexen Wechselwirkungen können den interagierenden Bakteriengruppen nützen oder schaden und den Bakterienkonsortien dabei helfen, das ökologische Gleichgewicht aufrechtzuerhalten. Beispielsweise entwickeln ansässige Bakteriengemeinschaften entweder kooperative (nützliche) oder konkurrierende (schädliche) Interaktionen, die sich auf die Biofilmfolge, die Biomasse und die Stressresistenz auswirken. Mehrere unabhängige Studien haben gezeigt, dass oberflächenassoziierte Bakterien bioaktive Verbindungen mit klinischer Bedeutung produzieren, darunter Antibiotika und Anti-Biofilm-Wirkstoffe8,9,10. Diese bioaktiven Wirkstoffe ermöglichen es, die Konkurrenz um die Oberflächenbesiedlung zu überwinden. Wir stellten die Hypothese auf, dass einige dieser bioaktiven Verbindungen vorteilhaft zur Hemmung menschlicher Krankheitserreger eingesetzt werden können.

In zahlreichen Studien wurden aus der Meeresumwelt stammende Verbindungen als potenzielle Inhibitoren der Biofilmbildung bei bakteriellen11,12,13 und Pilzpathogenen14,15,16,17,18,19,20,21 identifiziert. Allerdings sind diese Verbindungen typischerweise mit Meerwasser oder Sedimenten verbunden, wo die lebende Bakteriengemeinschaft weniger Konkurrenz erfährt. Verbindungen, die aus natürlich konkurrierenden Umgebungen wie marinen Biofilmen stammen, besitzen mit größerer Wahrscheinlichkeit ein größeres Potenzial, die Virulenz anderer Organismen zu hemmen.

In dieser Untersuchung haben wir wirksame biofilmbildende Bakterienisolate aus dem Biofilm im Frühstadium erhalten, der sich auf drei verschiedenen künstlichen Oberflächen (Edelstahl, hochdichtes Polyethylen und Titan) im Einzugsbereich eines an der Küste gelegenen Kraftwerks gebildet hat22. Der zellfreie Kulturüberstand (CFCS) der Bakterienisolate wurde auf seine starke Anti-Biofilm-Wirksamkeit gegen C. albicans untersucht und die aktiven Verbindungen wurden mittels HR-LCMS-Analyse aus dem ausgewählten CFCS identifiziert. Anschließend untersuchten wir die Anti-Biofilm-Aktivität der bioaktiven Leitverbindung gegen C. albicans und erforschten die zugrunde liegenden Mechanismen. Das Hauptziel dieser Forschungsarbeit besteht darin, die Vielzelligkeit des C. albicans-Biofilms zu zerstören, damit die Wirksamkeit des Wirtsabwehrmechanismus wiederhergestellt werden kann.

In der vorliegenden Studie haben wir menschliche bukkale Epithelzellen (HBECs) und menschliche Erythrozyten gesammelt, indem wir vorsichtig beide Seiten des Mundes mit sterilen Wattestäbchen bzw. durch Venenpunktion abgetupft haben. Beide Proben wurden von gesunden Personen entnommen und eine schriftliche Einwilligung eingeholt, nachdem der Zweck der Probenentnahme und Forschung in ihrer Muttersprache erläutert wurde. Das Versuchsprotokoll zur Beschaffung von HBECs und Blut wurde von der Institutionellen Ethikkommission der Alagappa-Universität, Karaikudi genehmigt (IEC-Ref.-Nr.: IEC/AU/2018/5). Alle Methoden wurden in Übereinstimmung mit den relevanten Richtlinien und Vorschriften durchgeführt und die Einverständniserklärung aller Probanden und/oder ihrer Erziehungsberechtigten eingeholt.

Alle Experimente in der vorliegenden Studie wurden mit einem Referenzstamm von C. albicans (C. albicans 90028) vom ATCC und drei klinischen Isolaten (bezeichnet als CI 1, CI 2 und CI 3) durchgeführt, die ursprünglich vom Candida-Stamm gesammelt wurden. infizierte Patienten in einem Regierungskrankenhaus in Coimbatore, Tamil Nadu, Indien. Die drei klinischen Isolate wurden in unserer vorherigen Studie23 auf Artenebene anhand der Sequenzierung des internen transkribierten Spacer-Gens (ITS) identifiziert (GenBank-Zugangsnummern: MF423465–MF423467). Der Referenzstamm C. albicans 90028 und andere klinische Isolate wurden in Hefeextrakt-Pepton-Dextrose-Agarplatten (YEPD; 1 % Hefeextrakt, 2 % Pepton und 2 % Dextrose) bei 4 °C gehalten. Außerdem wurde ein 30-prozentiger Glycerinvorrat aufrechterhalten und zur weiteren Verwendung in einem Ultratiefkühlschrank bei −80 °C gelagert. Für Routinekultivierungen und In-vitro-Planktonzelltests wurde YEPD-Brühe verwendet und die Kultur bei 37 °C unter konstantem Schütteln bei 160 U/min gezüchtet. Zur Durchführung von Biofilmexperimenten wurde ein spezielles Spider-Medium verwendet, das 1 % Mannitol, 0,2 % Dikaliumhydrogenphosphat und 1 % Nährbrühe enthielt. Darüber hinaus wurden RPMI-Medium (HiMedia Ltd., Indien) und Spider-Medium, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), für alle Hefe-zu-Hyphen- und Hyphen-zu-Hefe-Übergangsexperimente verwendet13,24. Um die orale Umgebung zu simulieren und die potenziellen Anti-Biofilm-Eigenschaften zu untersuchen, wurde in der Studie künstlicher Speichel verwendet und die Zusammensetzung wurde nach der in früheren Literaturstellen beschriebenen Methodik hergestellt25,26.

Die in dieser Studie verwendeten Bakterienisolate wurden ursprünglich aus marinen Biofilmen im Frühstadium isoliert, die sich auf verschiedenen künstlichen Oberflächen wie Edelstahl, hochdichtem Polyethylen und Titan im Einlaufbereich eines an der Küste gelegenen Kernkraftwerks entwickelten die Südküste Indiens22. Kurz gesagt, die auf den künstlichen Oberflächen entwickelten Biofilme wurden mit sterilen Zahnbürsten abgekratzt und in sterilem Meerwasser suspendiert. Die suspendierten Biofilme wurden unter eiskalten Bedingungen ins Labor transportiert und sofort auf verschiedenen Wachstumsmedien ausgebreitet, darunter Zobell Marine Agar 2216 (ZMA, HiMedia Ltd., Indien), Luria Bertani Agar und künstlicher Meersalzagar (HiMedia Ltd.). ., Indien), um eine breite Palette kultivierbarer Bakterienisolate zu erhalten. Alle Platten wurden sieben Tage lang bei 30 °C inkubiert und das Wachstum der Bakterienisolate alle 24 Stunden überprüft. Jeder neu gewachsene Bakterienmorphotyp wurde mit sterilen Zahnstochern gepflückt und auf ZMA subkultiviert. Axenische Kulturen der ausgewählten Morphotypen wurden außerdem mittels Quadrantenstreifenbildung erhalten und als Glycerinvorräte bei –80 °C konserviert.

Eine Sammlung von 60 Bakterienisolaten, die aus dem natürlichen Meeresbiofilm gewonnen wurden, wurde auf ihre Fähigkeit untersucht, die Biofilmbildung durch C. albicans zu hemmen, wie bereits beschrieben23. Kurz gesagt, Bakterienisolate wurden über Nacht in Zobell-Meeresbrühe (ZMB, HiMedia Ltd., Indien) gezüchtet und die zellfreien Kulturüberstände (CFCS) wurden durch Zentrifugation gesammelt. Die gesammelten CFCS wurden einzeln mit 0,22-µm-Spritzenfiltern gefiltert. Das gesamte Screening wurde in experimentellen Dreifachversuchen unter Verwendung von 96-Well-Mikrotiterplatten (MTP) durchgeführt. Gefilterte CFCS wurden (10 % v/v) dem Spider-Medium zugesetzt, das eine ausreichende Dichte an C. albicans-Stamm 90028-Zellen (106 KBE/ml) enthielt. Die kultivierten Platten wurden dann 48 Stunden lang bei 37 °C inkubiert, um die Biofilmbildung zu erleichtern. Neben dieser Versuchsgruppe wurden auch geeignete Kontrollmaßnahmen, einschließlich einer geeigneten Kontrolle, Vehikelkontrolle und Negativkontrolle, implementiert.

Nach der Inkubationszeit wurde die planktonische Zellfraktion verworfen und die MTP vorsichtig mit steriler Kochsalzlösung gewaschen, um alle lose anhaftenden Zellen zu entfernen. Anschließend wurden die Platten an der Luft getrocknet und 0,4 % Kristallviolettlösung (CV) zugegeben, um den auf der Innenfläche der Vertiefungen gebildeten Biofilm zu färben. Der an biofilmbildende Zellen gebundene CV wurde in 200 µL 30 %iger Essigsäurelösung resuspendiert, die optische Dichte (OD) wurde bei 570 nm gemessen und als Biofilm-Biomasse ausgedrückt27. Hier wurden Vertiefungen mit C. albicans-Zellen, aber ohne bakterielle CFCS-Behandlung, als Kontrolle zur Bestimmung der Biofilm-Biomasse-Reduktion betrachtet. Basierend auf den Screening-Ergebnissen zeigte ein marines Bakterienisolat, 6HZ5 (das fünfte identifizierte Isolat aus einem 6 Tage alten Biofilm, der auf einem Coupon aus hochdichtem Polyethylen gebildet und auf Zobell-Marinagar gezüchtet wurde), eine vielversprechende Anti-Biofilm-Aktivität und wurde daher ausgewählt zur weiteren Untersuchung.

Genomische DNA wurde aus dem ausgewählten Bakterienisolat mit dem DNeasy PowerLyzer Microbial Kit (Qiagen, Kat.-Nr.: 12255-50) extrahiert und eine Polymerasekettenreaktion (PCR) wurde durchgeführt, um das 16S-rRNA-Gen unter Verwendung universeller Bakterienprimer zu amplifizieren: 27F (5 ′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3′) und 1390R (5′-GACGGGCGGTGTGTACAA-3′), wie in unseren früheren Studien beschrieben27. Die Amplikons wurden mit dem BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Thermo Fisher Scientific, Indien) auf einem Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA) sequenziert. Zugeschnittene und bearbeitete Sequenzen, die aus der Sanger-Sequenzierung erhalten wurden, wurden im CAP3 Contig Assembly Program zusammengestellt und die verkettete Sequenz wurde mit verfügbaren 16S-rRNA-Gensequenzen in der GenBank-Datenbank (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) verglichen. unter Verwendung des BLAST-Algorithmus27,28. Schließlich wurde der NCBI-GenBank eine nahezu vollständige 16S-rRNA-Gensequenz unter dem Zugangscode MZ357100 vorgelegt. Darüber hinaus wurde ein phylogenetischer Baum basierend auf der in dieser Studie erhaltenen 16S-rRNA-Gensequenz und anderen Referenzsequenzen wie zuvor beschrieben erstellt29 unter Verwendung der Maximum-Likelihood-Methode (1000 Bootstrap-Replikate) in der MEGA-Software (Version 11)30.

Das ausgewählte Bakterienisolat (6HZ5), das eine starke Anti-Biofilm-Aktivität gegen C. albicans zeigte, wurde 48 Stunden lang in Zobell-Meeresbrühe (ZMB, HiMedia Ltd., Indien) bei 30 °C unter Schüttelbedingungen (120 U/min) gezüchtet. Nach der Inkubation wurde die Bakteriensuspension zentrifugiert, um CFCS zu sammeln, und die Verbindungen wurden mit dem doppelten Volumen Ethylacetat extrahiert. Der resultierende Extrakt wurde bei 55 °C getrocknet und in sterilem destilliertem Wasser gelöst. Hier wurde die Anti-Biofilm-Aktivität des Rohextrakts gegen C. albicans bestätigt und zur weiteren Analyse bei 30 °C gehalten. Anschließend wurde der teilweise gereinigte Extrakt einer LC-MS-Analyse unter Verwendung des Agilent Orbitrap-Massenanalysators HRLC-MS-System mit einem dualen Agilent Jet Stream Electron Ionization Source (AJS ESI)-Ionenquellenmodus31 unterzogen. Nach jeder Probe wurde eine Leerprobe durchgeführt. Es wurde eine mobile Phase bestehend aus 0,1 % v/v Ameisensäure in Wasser (A) und 10 % Wasser mit 90 % Acetonitril und 0,1 % Ameisensäure (B) verwendet. Das Gradientenelutionsprogramm war wie folgt: 5 % B isokratisch für 5 Minuten, von 5 bis 95 % B für 20 Minuten und 95 % B isokratisch für 5 Minuten. Die Durchflussrate und die maximale Druckgrenze wurden auf 300 µL min−1 bzw. 12.000 psig eingestellt. Die Probe (Volumen 3 µL) wurde nach dem Waschen der Nadel injiziert. Die Quadrupol-Flugzeitbedingungen (Q-TOF) waren wie folgt: Gasfluss –11 ml min–1 bei 300 °C, Zerstäuberdruck – 35 psig, Düsenspannung – 1 kV und Fragmentorspannung – 175 V. Der Aufnahmemodus war eingestellt zwischen 60 und 1000 m/z-Bereich bei einer Scanrate von 1 Spektren s−1.

Die LCMS-Analyse bestätigte das Vorhandensein von insgesamt 80 Verbindungen im ausgewählten bakteriellen CFCS. Die zahlreichen im Handel erhältlichen Verbindungen wurden beschafft und auf ihre Fähigkeit getestet, den Biofilm von C. albicans zu hemmen. Die sieben in unserer Studie getesteten Verbindungen waren wie folgt: 11-Aminoundecansäure, Salfredin 6,8-Docosandion, 7-Acetoxy-4-methylcumarin, Sulfadimidin, Moracin D und 3-Hydroxycumarin (3HC). Alle Verbindungen wurden von Tokyo Chemical Industry (TCI), Japan, bezogen und hatten alle eine Reinheit von > 98,0 %. Um ihre Anti-Biofilm-Wirksamkeit zu testen, wurden Stammlösungen der beschafften Verbindungen im Hinblick auf ihre Löslichkeit in verschiedenen Lösungsmitteln (Methanol, Ethanol und Wasser) hergestellt. Diese Verbindungen wurden gegen C. albicans in einem MTP mit 24 Vertiefungen unter Verwendung von YEPD- und Spider-Medium für Plankton- bzw. Biofilmzellen getestet, wie zuvor beschrieben32. Jede Vertiefung wurde mit 1 ml geeignetem Wachstumsmedium, 106 KBE/ml C. albicans 90028-Zellen und ausgewählten Verbindungen in einer Konzentration von 500 µg mL-1 beladen. Die MTPs wurden für planktonische bzw. biofilmbildende Zellen 24 Stunden und 48 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Um die Planktonzelldichte zu bestimmen, wurden die 24 Stunden inkubierten Platten bei 600 nm gemessen. Andererseits wurden biofilmbildende Zellen einem ähnlichen experimentellen Verfahren wie dem oben erwähnten Bakterienscreening unterzogen. Unter den getesteten Verbindungen zeigte 3HC eine potenzielle Anti-Biofilm-Aktivität gegen alle C. albicans-Stämme, ohne irgendeinen Einfluss auf Planktonzellen auszuüben, und wurde daher für weitere Untersuchungen ausgewählt.

Eine Stammlösung (20 mg mL−1) der Verbindung wurde in Ethanol hergestellt und zur weiteren Verwendung bei 30 °C gelagert. Um die Wirkung des Lösungsmittels zu berücksichtigen, wurde in allen Experimenten eine geeignete Vehikelkontrolle beibehalten. Die Anti-Biofilm-Aktivität von 3HC gegen C. albicans-Stämme wurde unter Verwendung der vom Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2022; Dokument M100) vorgeschlagenen Standard-Mikrobrühen-Verdünnungsmethode und wie in früheren, zuvor beschriebenen Studien23 detailliert beschrieben, bewertet. Um es kurz zu beschreiben: 1 % Inokulum von über Nacht gewachsenen C. albicans-Stämmen mit 106 KBE/ml Zellen wurde in 1 ml YEPD-Brühe mit unterschiedlichen 3HC-Konzentrationen (im Bereich von 62,5 bis 2000 µg mL−1) inokuliert und 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert ℃. Hier dienten Vertiefungen ohne 3HC-Behandlung als Kontrolle und Vertiefungen, die nur YEPD-Medium enthielten, als Negativkontrolle. Nach der Inkubation wurde die Zelldichte durch Messung der Absorption bei 600 nm mit einem Spektrophotometer (Spectra Max 3, Molecular Devices, USA) quantifiziert. Darüber hinaus wurden 5 µL Zellen aus jeder Vertiefung auch auf YEPD-Agar-Petriplatten getupft, um Wachstumseffekte zu beobachten. Die Platten wurden nach 24-stündiger Inkubation bei 37 °C belichtet.

Die metabolische Lebensfähigkeit von Kontrollzellen und behandelten C. albicans-Zellen wurde mit der Alamar-Blau-Methode [Resazurin (7-Hydroxy-3H-phenoxazin-3-on-10-oxid)] gemessen33. Kurz gesagt, nach 24-stündiger Behandlung der Zellen mit 3HC wurden die behandelten Zellen und die Kontrollzellen 10 Minuten lang bei 8000 g zentrifugiert und dreimal sanft mit Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) gewaschen. Die gewaschenen Zellen wurden in 1 ml PBS resuspendiert und dann wurden 10 µL Alamar-Blau (10 mg/ml Stammlösung) hinzugefügt und 18–24 Stunden lang bei 37 °C im Dunkeln inkubiert, um die Fluoreszenz zu entwickeln. Als Negativkontrolle diente Alamarblau in PBS ohne die Zellen. Nach der Inkubationszeit wurden die Zellen zentrifugiert und die Fluoreszenzintensität des Überstands bei 560 nm (Anregung) und 590 nm (Emission) gemessen.

Zur Bestimmung des MBIC von C. albicans-Stämmen wurde die Standard-CV-Quantifizierungsmethode (0,4 %) (wie beim Anti-Biofilm-Screening angewendet) verwendet32. Kurz gesagt, 106 Zellen von C. albicans wurden in 1 ml Spider-Medium und künstlichem Speichel mit unterschiedlichen 3HC-Konzentrationen (62,5 bis 2000 µg mL−1) in MTP mit 24 Vertiefungen inokuliert. Das MTP wurde 48 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Planktonzellen verworfen und die Vertiefungen sorgfältig gewaschen, um lose anhaftende Zellen zu entfernen. Anschließend wurden die Platten 10 Minuten lang mit CV (0,4 %) gefärbt. Der überschüssige Fleck wurde ausgewaschen und der biofilmgebundene Fleck wurde in 1 ml 30 %iger Essigsäure gelöst. Die Biofilmhemmung wurde bei 570 nm gemessen und eine Hemmung von mindestens 80 % wurde als MBIC angesehen. Der Prozentsatz der Biofilmhemmung wurde anhand der folgenden Formel ermittelt:

Der Färbefarbstoff Fluoresceindiacetat (FDA) wurde zur Bewertung und Quantifizierung der lebensfähigen Biofilm-Biomasse von C. albicans-Stämmen34,35 verwendet. Kurz gesagt durften 106 Zellen von C. albicans-Stämmen 48 Stunden lang in 24-Well-MTP in Gegenwart und Abwesenheit von 3HC einen Biofilm bilden. Nach der Inkubation wurden die Planktonzellen verworfen und 0,2 mg mL-1 FDA- und RPMI-Medium im Verhältnis 1:1 (v/v) frisch gemischt und in die Vertiefungen von 24 MTP überführt. Die Platten wurden 1 Stunde lang im Dunkeln bei 37 °C inkubiert. Die Fluoreszenzintensität wurde bei einer Anregung von 488 nm und einer Emission von 530 nm gemessen. Darüber hinaus wurde die Platte vorsichtig mit PBS gespült, um überschüssige Flecken zu entfernen, und unter einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet.

Um die Wirksamkeit von 3HC auf die Biofilm- und Hyphenreduktion weiter zu bewerten, wurden die Kontroll- und 3HC-behandelten C. albicans-Zellen (in verschiedenen Konzentrationen) gemäß unserer früheren Studie einer FESEM-Analyse unterzogen22. Kurz gesagt durften die 106 Zellen von C. albicans 90028 48 Stunden lang in Gegenwart und Abwesenheit von 3HC Biofilme auf einem Objektträger bilden. Nach der Inkubation wurden die Objektträger vorsichtig mit PBS gewaschen, um lose anhaftende Zellen zu entfernen, und mit frisch zubereitetem 2 % Glutaraldehyd 3 Stunden lang bei 4 °C fixiert. Die Proben wurden dann dehydriert, indem sie nacheinander jeweils 10 Minuten lang steigenden Konzentrationen an Ethanol (20 %, 40 %, 60 %, 80 % und 100 %) ausgesetzt wurden. Abschließend wurden die Zellen luftgetrocknet und unter FESEM (SUPRA 55VP; Carl Zeiss, Deutschland) sichtbar gemacht.

Die Wirkung verschiedener 3HC-Konzentrationen auf das Filamentwachstum von C. albicans wurde auf YEPD-Agar, ergänzt mit 10 % FBS23,24,32, bewertet. Kurz gesagt, wurden die erforderlichen Konzentrationen von 3HC zu autoklaviertem YEPD-Agar gegeben und erstarren gelassen. Eine Kultursuspension (5 μl mit ca. 106 Zellen von C. albicans) wurde auf die Mitte des verfestigten Agars getüpfelt. Als Kontrolle diente YEPD-Agar ohne 3HC. Man ließ die Flecken trocknen und die Platten wurden 5 Tage lang bei 37 °C inkubiert, damit die Filamentmorphologie sichtbar wurde. Die beobachteten hyphenartigen Vorsprünge (Filament) wurden dann mit einer hochauflösenden CCD-Kamera (GelDoc XR+, Bio-Rad) dokumentiert.

Die Koloniemorphologie von C. albicans wurde auf ähnliche Weise wie die filamentöse Morphologie bewertet. Als Behandlungsgruppe wurde YEPD-Agar mit verschiedenen Konzentrationen an 3HC betrachtet, während YEPD-Agar ohne 3HC als Kontrolle diente. Eine Kultur von C. albicans (5 µL) wurde in die Mitte der Agarplatte getupft und 72 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Die Veränderungen der Morphologie wurden mit einem Geldokumentationssystem dokumentiert.

Um die Wirkung von 3HC auf den Phasenübergang von Hefe zu Hyphen zu untersuchen, wurde 1 % von 106 Zellen von C. albicans in YEPD-Medium, ergänzt mit 10 % FBS, inokuliert36,37,38. Die Behandlungsgruppen erhielten 3HC in unterschiedlichen Konzentrationen, während die Kontrollgruppe die gleiche Zusammensetzung, jedoch ohne 3HC, aufwies. Die beimpften Röhrchen wurden bei 37 °C unter ständigem Schütteln mit 160 U/min inkubiert. Nach 4 h Inkubation wurde der Phasenübergang lichtmikroskopisch dokumentiert.

In ähnlicher Weise wurde auch die Umkehrung von Hyphen-zu-Hefe-Zellen untersucht, indem die Bildung von Hyphen aus Hefezellen von C. albicans durch 4-stündige Inkubation in RPMI-Medium bei 37 °C induziert wurde38. Nach der Inkubation wurde 3HC in unterschiedlichen Konzentrationen zur Behandlung verwendet und der umgekehrte Übergang wurde unter einem Lichtmikroskop nach 2, 4 und 6 Stunden Inkubation beobachtet.

Um die Wirksamkeit von 3HC bei der Auflösung des reifen Biofilms zu testen, ließ man C. albicans 48 Stunden lang in Spider-Medium einen Biofilm bilden. Nach der Inkubation wurde das verbrauchte Medium mit frischem Spider-Medium, ergänzt mit unterschiedlichen 3HC-Konzentrationen, aufgefrischt. Als Kontrollen wurden Vertiefungen ohne 3HC-Behandlung betrachtet. Das MTP wurde weitere 3 Stunden lang inkubiert, um die 3HC-Wirkung auf den reifen C. albicans-Biofilm zu erleichtern. Die Entfernung des Biofilms wurde mit der standardmäßigen 0,4 % CV-Färbemethode und Lichtmikroskopie aufgezeichnet.

Die Wirkung von 3HC auf das Genexpressionsprofil des Referenzstamms C. albicans 90028 wurde mithilfe quantitativer Echtzeit-PCR (qRT-PCR) nach der zuvor beschriebenen Methode analysiert23,32. Kurz gesagt, RNA wurde sowohl aus Kontrollzellen als auch aus 3HC-behandelten Zellen (bei MBIC) unter Verwendung der TRIzol-Methode (TRI-Reagenz, Sigma-Aldrich, Indien) isoliert. Die isolierte RNA wurde mittels Agarosegelelektrophorese bzw. NanoDrop-Spektrophotometer (NanoDrop Technologies, USA) qualitätsgeprüft und quantifiziert und dann sofort mit einem Hochleistungs-cDNA-Reverse-Transcription-Kit (Applied Biosystems, USA) in cDNA umgewandelt. Nach diesem Schritt wurde die qRT-PCR unter Verwendung des SYBR Green-Mastermixes (Applied Biosystems, USA) durchgeführt. Primer verschiedener Gene wurden einzeln mit dem SYBR Green-Mastermix in einem vordefinierten Verhältnis hinzugefügt, um ein Gesamtreaktionsvolumen von bis zu 10 µL zu erreichen. Die in dieser Studie verwendeten Gene gelten als entscheidend für die Pathogenität von C. albicans und sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Das Expressionsprofil der Gene, die an der Biofilmbildung und Virulenz von C. albicans beteiligt sind, wurde mit dem Applied Biosystems® 7500 Real-Time PCR-System untersucht. Das Housekeeping-ITS-Gen mit einer Größe von ~540 bp wurde als interne Kontrolle verwendet und die relative Genexpression von Kontroll- und behandelten Zellen wurde mithilfe der ΔΔCT-Methode bestimmt39.

Es wurden gesunde Freiwillige rekrutiert und HBECs durch sanftes Reiben beider Seiten der Innenseite der Wangen mit einem sterilen Wattestäbchen gesammelt. Der Tupfer wurde in sterilem PBS suspendiert und gevortext. Alle gesammelten Zellen wurden gepoolt und 10 Minuten lang bei 3000 g zentrifugiert. Das Pellet wurde dreimal mit PBS gewaschen und in PBS resuspendiert. Die Zellen wurden mit einem automatischen Zellzähler (Countess II FL, Invitrogen, USA) auf ~ 105 Zellen/ml eingestellt und mit unterschiedlichen 3HC-Konzentrationen inkubiert. Als Positivkontrolle diente Wasserstoffperoxid und als Kontrolle dienten die Zellen ohne Behandlung. Nach 20-minütiger Inkubation bei 37 °C wurden die Zellen mit CV angefärbt und die toxische Wirkung unter einem Lichtmikroskop beobachtet32.

Ähnlich wie HBECs wurden auch HECs von gesunden Freiwilligen gesammelt. Hierbei wurden 2 ml Blut durch Venenpunktion entnommen und in ein Röhrchen mit einem Antikoagulans (eine Prise EDTA) gegeben. HECs wurden durch Zentrifugation (2000 g bei 10 Minuten) geerntet und dreimal mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden dann gleichmäßig verdünnt und mit verschiedenen Konzentrationen von 3HC behandelt. In diesem Experiment wurde 1 % Triton X-100 als Positivkontrolle zum Aufbrechen von HECs verwendet. Die behandelten Röhrchen wurden 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert. Die Röhrchen wurden nach der Inkubation erneut zentrifugiert und der Überstand in ein MTP40 mit 96 Vertiefungen überführt.

Alle Experimente wurden in mindestens drei biologischen Replikaten mit jeweils mindestens drei experimentellen Replikaten durchgeführt. Die angezeigten Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dargestellt. Es wurde eine Varianzanalyse (ANOVA) durchgeführt, gefolgt von Duncans Post-hoc-Test, bei dem R verwendet wurde, um die Signifikanz innerhalb und zwischen Gruppen zu bestimmen.

Um einen wirksamen Biofilminhibitor zu erhalten, wurden CFCS von 60 marinen Bakterienisolaten, die aus marinen Biofilmen im Frühstadium gewonnen wurden, auf ihre Fähigkeit untersucht, die Biofilmbildung durch C. albicans zu hemmen (ergänzende Abbildung S1a – d). Von den gescreenten Bakterienisolaten zeigten 20 Isolate eine mäßige Anti-Biofilm-Aktivität, wobei ein Isolat (bezeichnet als Stamm 6HZ5) die stärkste Fähigkeit zur Biofilm-Hemmung (> 95 %) gegen C. albicans aufwies (ergänzende Abbildung S1b). Darüber hinaus zeigten die Ergebnisse, dass das CFCS des Bakterienstamms 6HZ5 keinen Einfluss auf das Wachstum von C. albicans-Zellen hatte.

Interessanterweise zeigten Screening-Ergebnisse, dass nur wenige Bakterienisolate auch das Potenzial hatten, die Biofilmbildung zu fördern. Beispielsweise wurde festgestellt, dass die als 9SZ1, 9SZ2 und 9SA3 bezeichneten Bakterienisolate das Biofilmbildungspotenzial von C. albicans im Vergleich zu ihren entsprechenden Kontrollen um 40 % steigern. Nach sorgfältiger Auswertung der gesamten Screening-Ergebnisse kamen wir zu dem Schluss, dass das CFCS eines Meeresbakterienstamms 6HZ5 die stärkste Anti-Biofilm-Aktivität gegen C. albicans aufweist, weshalb dieses Isolat in unserer Studie weiter ausgewählt wurde. Basierend auf der 16S-rRNA-Gensequenzanalyse wurde das ausgewählte Bakterienisolat mit starker Anti-Biofilm-Aktivität als Brevundimonas abyssalis-Stamm 6HZ5 identifiziert. Darüber hinaus wurde ein phylogenetischer Baum unter Verwendung von 32 Referenz-16S-rRNA-Gensequenzen von Brevundimonas spp. erstellt. (Ergänzende Abbildung S2). Das ausgewählte Bakterium B. abyssalis Stamm 6HZ5 zeigte eine große phylogenetische Ähnlichkeit mit B. canariensis. Diese beiden Bakterien bildeten auch eine von den anderen Arten der Gattung Brevundimonas getrennte Gruppe.

Zur Identifizierung der im CFCS vorhandenen aktiven Verbindungen wurde eine HR-LCMS-Analyse verwendet. Die identifizierten Verbindungen sind in der Ergänzungstabelle S1 aufgeführt. Um weiter voranzuschreiten, wurden die vorherrschenden Verbindungen wie 11-Aminoundecansäure, 6,8-Docosandion, 7-Acetoxy-4-methylcumarin, 3-Hydroxycumarin, Sulfadimidin, Moracin D und Salfredin kommerziell erworben und auf ihre Anti-Antikörper untersucht -Biofilmpotential gegen C. albicans.

Die Wirkung der ausgewählten Verbindungen wurde auf ihr Wachstums- und Biofilm-hemmendes Potenzial gegen C. albicans analysiert (Abb. 1). Von den sieben untersuchten Verbindungen zeigten sechs Verbindungen, nämlich 6–8-Docosandion, 7-Acetoxy-4-methylcumarin, Sulfadimidin, Moracin D und Salfredin, eine stärkere fungizide Aktivität als Anti-Biofilm und wurden daher im primären Screening eliminiert. Es wurde festgestellt, dass nur zwei Verbindungen, nämlich 11-Amino-Undeconsäure und 3HC, den C. albicans-Biofilm hemmen, ohne das Wachstum wesentlich zu beeinträchtigen. Unter diesen beiden wirksamen Biofilminhibitoren erwies sich 3HC als signifikanter (p < 0,05) und wurde daher ausgewählt, um seine Wirksamkeit bei der Biofilmhemmung und seinen Einfluss auf die Virulenzfaktoren von C. albicans zu untersuchen.

Screening kommerziell erhältlicher Verbindungen, die durch HR-LCMS-Analyse im zellfreien Kulturüberstand (CFCS) eines marinen Bakterienisolats Brevundimonas abyssalis auf ihr Anti-Biofilm-Potenzial gegen C. albicans identifiziert wurden. Das Balkendiagramm zeigt die Biofilmhemmung (%) und das Liniendiagramm zeigt die Absorption planktonischer Zellen bei 600 nm. Zwei Verbindungen, nämlich 3-Hydroxycumarin (3HC) und 11-Aminoundeconsäure, zeigten eine starke Anti-Biofilm-Aktivität gegen C. albicans. Fehlerbalken stellen Standardabweichungen vom Mittelwert experimenteller Dreifachversuche dar.

Zunächst wurde die nichtfungizide Wirkung von 3HC durch die Bestimmung der MHK bestätigt. Unter den vier getesteten Pilzstämmen waren die Planktonzellen des Referenzstamms C. albicans ATCC am anfälligsten für 3HC, gefolgt von den anderen drei klinischen Isolaten. Es wurde jedoch beobachtet, dass die Anfälligkeit unbedeutend war, und daher wurde angenommen, dass die MHK aller untersuchten Stämme 1000 µg mL-1 betrug. Wir beobachteten einen sichtbaren Zelltod von fast 50 % bei 1000 µg mL−1 und weitere Ergebnisse zeigten, dass das Wachstum von C. albicans bei niedrigeren Konzentrationen nicht signifikant (p > 0,05) gehemmt wurde (Abb. 2a). Dies wurde weiter untermauert, indem die metabolische Lebensfähigkeit der Zellen in Gegenwart und Abwesenheit von 3HC mit Alamar-Blau getestet wurde (Abb. 2b).

Bestimmung der minimalen Biofilm-Hemmkonzentration (MBIC) und der nicht-fungiziden Konzentration von 3-Hydroxycumarin (3HC). MBIC bezeichnet maximale Biofilmhemmung bei vernachlässigbarem Verlust an Planktonzellen. (a) Bei der Behandlung mit 3HC wurde eine dosisabhängige Reduktion des Biofilms beobachtet. Die Konzentration von 250 µg mL-1 wurde als MBIC gewählt, da die Biofilmbildung zu > 95 % verhindert wurde, ohne dass es zu einem Verlust des Planktonwachstums kam. (b) Messung der metabolischen Lebensfähigkeit von C. albicans nach 24-stündigem Wachstum in Gegenwart und Abwesenheit von 3HC unter Verwendung von Alamar-Blau. Das Bild zeigt eine signifikante Verringerung der Zelllebensfähigkeit bei 1000 µg mL−1 (MIC) und keine Verringerung der Lebensfähigkeit bei Sub-MICs. Fehlerbalken geben die Mittelwerte von drei experimentellen Dreifachversuchen an. (c) Repräsentative 96-Well-Mikrotiterplatte, gefärbt mit Alamar-Blau, die den wahren Stoffwechselzustand von 3HC-behandelten C. albicans-Zellen zeigt.

Die metabolische Lebensfähigkeit ist ein visueller Beobachtungstest, bei dem Alamar-Blau, ein Resazurin-Farbstoff (nicht fluoreszierender blauer Farbstoff), durch metabolisch aktive Zellen zu Resorufin (rosa fluoreszierender Farbstoff) reduziert wird. Daher werden die lebensfähigen Zellen rosa und die nicht lebensfähigen Zellen bleiben blau. Die Ergebnisse zeigten eine signifikante (p < 0,05) Verringerung der Zelllebensfähigkeit nur bei MIC (1000 µg mL−1), während die Fluoreszenzintensität bei Sub-MICs unverändert blieb. Die Fluoreszenzintensität der mit 500 µg mL-1 behandelten Zellen blieb nahezu gleich wie die der Kontrolle, und bei einer Konzentration von 250 µg mL-1 blieben die Zellen vollständig lebensfähig (Abb. 2b, c). Alle erzielten Ergebnisse bestätigten, dass 3HC unterhalb der Sub-MHK-Werte keinen fatalen Einfluss auf das Wachstum und die metabolische Lebensfähigkeit von C. albicans hat. Daher wurden die Konzentrationen unterhalb der Sub-MHK (62,5 bis 500 µg mL−1) weiter herangezogen, um das Antibiofilmpotenzial zu bewerten.

Nach Bestätigung der nicht-fungiziden Aktivität von 3HC wurde die Anti-Biofilm-Aktivität untersucht. Die vier C. albicans-Stämme wurden auf ihre Fähigkeit zur Biofilmproduktion getestet. Nach 48-stündiger Inkubation im Spider-Medium hatten alle anderen drei untersuchten Stämme mit Ausnahme von C. albicans C1 ein starkes Potenzial zur Biofilmbildung. Ebenso zeigte die gemischte Kombination eine robuste Fähigkeit zur Bildung von Biofilmen. Die CV-Färbung zeigte das Potenzial von 3HC, die Fähigkeit von C. albicans zur Biofilmbildung abzuschwächen (Abb. 3a und ergänzende Abb. S3). Die 3HC-Konzentrationen von 125 µg mL-1, 250 µg mL-1 und 500 µg mL-1 hemmten maximal 72 %, 98 % bzw. 100 % der C. albicans-Biofilme. Allerdings zeigte 3HC bei einer Konzentration von 500 µg mL-1 eine leichte (8 %) antimykotische Aktivität, wohingegen es bei 250 µg mL-1 keinen Einfluss auf das Wachstum aller getesteten C. albicans-Stämme hatte und daher Wachstumskurven waren Es wurde festgestellt, dass sie denen der entsprechenden Kontrollen ähnlich sind (ergänzende Abbildung S4). Daher wurden nach sorgfältiger Auswertung der insgesamt erhaltenen Ergebnisse 250 µg mL-1 als MBIC festgelegt und zur Untersuchung seiner Wirksamkeit auf die Virulenzmerkmale von C. albicans herangezogen. Im Fall von künstlichem Speichel wurde beobachtet, dass selbst die minimale Konzentration von 3HC die Biofilmbildung des C. albicans-Stammes 90028 vollständig hemmte (ergänzende Abbildung S5).

Anti-Biofilm-Wirksamkeit verschiedener 3-Hydroxy-Cumarin (3HC)-Konzentrationen gegenüber Referenz- und klinischen Isolaten von C. albicans. (a) Wirkung von 3HC auf die Biofilmhemmung von C. albicans-Stämmen. Die Biofilmbildung aller vier getesteten C. albicans-Isolate wurde bei einem MBIC (blauer Balken) von 3HC um > 90 % gehemmt. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung vom Mittelwert dar (n = 9). (b) Einfluss verschiedener Konzentrationen von 3HC auf die metabolische Lebensfähigkeit von Biofilmen, die von verschiedenen C. albicans-Stämmen gebildet werden (200-fache Vergrößerung). Bei allen vier Isolaten von C. albicans wurde eine dosisabhängige Verringerung der Lebensfähigkeit des Biofilms beobachtet. Die Behandlung am MBIC führte zu einer erheblichen Verringerung der Lebensfähigkeit der Biofilm-Biomasse. (c) Repräsentative FESEM-Bilder von unbehandeltem C. albicans 90028 und solchen, die 3HC bei 2 MBIC, MBIC, ½ MBIC und ¼ MBIC ausgesetzt waren, zeigen eine vollständige dosisabhängige Biofilmreduktion und eine vollständige Hemmung der Hyphenbildung.

Darüber hinaus wurde die FDA-Methode verwendet, um die Stoffwechselaktivität der Biofilme zu erfassen. Wie in Abb. 3b gezeigt, reduzierte der MBIC die Zellaktivität von 48-Stunden-Biofilmen aller C. albicans-Stämme signifikant. Die Kontrolle und die Vehikelkontrolle zeigten dichte Populationen mit länglichen Hyphenzellen, wohingegen die behandelten Gruppen kaum Zellen aufwiesen. Darüber hinaus konnten wir in keiner der beobachteten Zellen einen Hyphenvorsprung beobachten. Es wurde festgestellt, dass die mit 62,5 µg mL-1 behandelten Zellen das Wachstum der Hyphenverlängerungen verlangsamten (Abb. 3b). Diese Beobachtungen wurden durch die FESEM-Analyse (Abb. 3c) weiter bestätigt, die die vollständige Hemmung der Hyphenverlängerungen und eine konzentrationsabhängige Verringerung der Biofilmbildung von C. albicans 90028 bestätigte.

Virulenzmerkmale wie filamentöse Morphologie, Faltenmorphologie, Übergang von Hefe zu Hyphe und Übergang von Hyphe zu Hefe wurden sowohl an Kontrollzellen als auch an behandelten Zellen untersucht. Wenn die Kolonie von C. albicans auf mit FBS ergänzten Spider-Medien gezüchtet wird, weist sie tendenziell eine raue Oberfläche mit faltiger Morphologie auf und bildet nach 3–4 Tagen Inkubation Filamente (Hyphenwachstum) (Abb. 4a, b). Es wurde jedoch festgestellt, dass die 3HC-behandelten Kolonien bei MBIC Kolonien mit glatten Kanten aufwiesen und keine Falten (Abb. 4a und ergänzende Abb. S6) und kein filamentöses Wachstum aufwiesen (Abb. 4b). Bei niedrigeren 3HC-Dosen (125 µg mL-1 und 62,5 µg mL-1) wurde auch eine Verringerung sowohl des Falten- als auch des Fadenwachstums beobachtet. Obwohl das Auftreten von Filamenten bei niedrigeren Konzentrationen beobachtet wurde, förderte ihre Inkubation über einen längeren Zeitraum kein weiteres Wachstum und/oder eine Verlängerung der Filamente.

Hemmung primärer Virulenzfaktoren (Filamentwachstum und Faltenmorphologie) durch die Behandlung von 3HC. Repräsentative Bilder von Spider-Medium-Agarplatten zeigen die Koloniemorphologie, die 2 MBIC, MBIC, ½ MBIC und ¼ MBIC 3HC ausgesetzt war. Nach der Behandlung schien die Kolonie (a) eine glatte Oberfläche und (b) ein geringeres Filamentwachstum im Vergleich zu ihrer jeweiligen Kontrolle aufzuweisen. Auf die Bilder (b) wurden Falschfarben angewendet, um die Ergebnisse klar darzustellen.

Auch die Voraussetzung für die Bildung des C. albicans-Biofilms, der Hyphenübergang, reagierte ähnlich. Bei den Kontrollzellen wurde ein komplexes und stark verflochtenes Hyphennetzwerk beobachtet, wohingegen mit 3HC behandelte Zellen (bei MBIC) dispergierte Hefezellen ohne Hyphenvorsprünge aufwiesen. Lichtmikroskopische Bilder von Kontroll- und 3HC-behandelten Zellen zeigten deutlich eine Verringerung der Oberflächenhaftung und Hyphenentwicklung von C. albicans (Abb. 5a). Die Dicke und Intensität des Biofilms sowie die Fähigkeit der Zellen, vom Hefe- in den Hyphenmodus zu wechseln, wurden deutlich verringert. Die Verringerung des Hyphenübergangs wurde bereits bei der Mindestkonzentration (62,5 µg mL−1) von 3HC festgestellt. Es wurde festgestellt, dass Kontrollzellen strukturell stabil waren und komplexe Hyphenvorsprünge aufwiesen.

Wirksamkeit von 3-Hydroxycumarin (3HC) auf den morphologischen Übergang und den reifen Biofilmzerfall von C. albicans-Zellen. Mikroskopische Bilder, die (a) die Hemmung der Hyphenbildung und (b) die Umwandlung vorgeformter Hyphen in Hefezellen bei 2 MBIC, MBIC, ½ MBIC und ¼ MBIC zeigen. (c) Zerfall des reifen Biofilms durch 3HC in verschiedenen Konzentrationen. Die maximale Ablösung des vorgebildeten Biofilms wurde bei 2 MBIC beobachtet. Jedes Experiment wurde mindestens dreimal wiederholt und hier werden repräsentative Bilder präsentiert.

Darüber hinaus ist die Fähigkeit, den Hyphen-zu-Hefe-Übergang umzukehren, eine dringend benötigte Eigenschaft einer wirksamen Anti-Biofilm-Verbindung. Daher wurde die Fähigkeit von 3HC, die vorgebildeten Hyphenzellen umzukehren, getestet, indem Zellen im RPMI-Medium gezüchtet wurden, was das Hyphenwachstum erleichtert. Die kontinuierliche Überwachung der mit 3HC behandelten Zellen in 4-Stunden-Intervallen ergab, dass die Umwandlung von Hyphe in Hefe nach 4 Stunden 3HC-Behandlung eingeleitet wurde (Abb. 5b). Darüber hinaus zeigte 3HC sowohl eine dosisabhängige als auch eine zeitabhängige Reversibilität. Beispielsweise führte die Behandlung mit MBIC zu einer Umkehrung des Hyphen-zu-Hefe-Übergangs nach 8 Stunden (~ 90 %), während bei 62,5 µg mL−1 die maximale Umkehrung nach 12 Stunden beobachtet wurde.

Die Effizienz beim Aufbrechen bereits gebildeten Biofilms ist ein entscheidendes Merkmal eines wirksamen Anti-Biofilm-Kandidaten. Um diese Fähigkeit zu testen, ließ man C. albicans 90028 48 Stunden lang einen Biofilm bilden. Wir beobachteten, dass 3HC sowohl bei MBIC als auch bei 2 × MBIC die Fähigkeit hatte, oberflächengebundene Zellen nach 24-stündiger Inkubation zu lösen (Abb. 5C).

Da alle Tests zur Physiologie eine signifikante Verringerung der Adhäsion und des phänotypischen Wechsels zeigten, wurden in erster Linie die Gene, die an der Biofilmbildung, der Hyphenmorphogenese und dem Übergang von Hefe zu Hyphe beteiligt sind, ins Visier genommen, um ihre unterschiedliche Expression durch qPCR-Analyse zu ermitteln, um die Fähigkeit von zu validieren 3HC auf Genomebene (Ergänzende Abbildung S7).

Wie erwartet zeigten die Ergebnisse, dass für die Adhäsion verantwortliche Gene wie als1 und eap1 mit einer 6- bzw. 4-fachen Änderung signifikant herunterreguliert wurden (p < 0,05). Die Expression von Genen, die für die Hyphen- und Filamententwicklung verantwortlich sind, wie hst7 und ume6, war am signifikantesten (p < 0,005) herunterreguliert (> 10-fach). Darüber hinaus bestätigt die Herunterregulierung anderer Adhäsions- und Filamentierungsgene, einschließlich efg1, cph1, eap1, ras1, als1 und ece1, die In-vitro-Wirksamkeit von 3HC bei der Anti-Biofilm-, Anti-Hyphen- und phänotypischen Schalterkontrolle (ergänzende Abb . S7).

Die ungiftige Natur von 3HC wurde gegenüber Epithelzellen der Mundhöhle (Abb. 6a) und Erythrozyten (Abb. 6b) bewertet. In beiden Zellen übte die jeweilige Positivkontrolle einen negativen Effekt auf die Zellen aus. Beispielsweise verursachte Triton X-100 eine vollständige Lyse der Erythrozyten, was zu einer rot gefärbten Lösung führte. In ähnlicher Weise löste Wasserstoffperoxid die Struktur von HBECs vollständig auf. Allerdings hatte die Behandlung mit 3HC in beiden Fällen keinen negativen Einfluss, was darauf hindeutet, dass es nicht toxisch ist und die Zellstruktur oder -integrität nicht beeinträchtigt wird.

Ungiftige Wirkung von 3HC auf (a) menschliche bukkale Epithelzellen (HBECs) und (b) menschliche Erythrozyten. Wasserstoffperoxid und Triton X-100 wurden als Positivkontrollen für HBECs bzw. Erythrozyten verwendet. Beide mit unterschiedlichen Konzentrationen von 3HC (62,5 bis 500 µg mL−1) behandelten Zellen zeigten bis auf die Positivkontrolle keine toxische Wirkung. VC bezeichnet Fahrzeugkontrolle (Ethanol).

Weltweit ist C. albicans die häufigste Ursache für invasive Candidiasis. Mehrere epidemiologische Studien haben gezeigt, dass die Bildung von Biofilm die Mortalität invasiver Candidiasis erhöht41,42. C. albicans bildet mit größerer Wahrscheinlichkeit Biofilme als andere Candida-Arten wie C. Tropicalis und C. Glabrata43. Im Allgemeinen besteht ein von C. albicans gebildeter Biofilm aus einem Netzwerk dreidimensionaler Hyphen und einer extrazellulären Matrix, die hochdynamisch und äußerst strukturiert ist. Im Vergleich zu ihren planktonischen Gegenstücken reagieren C. albicans-Zellen im Biofilm weniger auf häufig verwendete Antimykotika wie Azole und herkömmliches Amphotericin B44,45. Aufgrund der Infektiosität häufig verwendeter Antimykotika gegen den Biofilm-Lebensstil von C. albicans ist ihr übermäßiger Gebrauch weit verbreitet, was wiederum die Entwicklung von Multiresistenzen begünstigt46. Darüber hinaus erhöht die Resistenz gegen mehrere Arzneimittel auch das Wiederauftreten von Behandlungsfehlern aufgrund des selektiven Drucks, der von herkömmlichen Antimykotika ausgeübt wird47,48. Angesichts der Schwere biofilmbedingter Erkrankungen ist es unerlässlich, alternative Antimykotika zu finden, die Biofilme wirksam bekämpfen können, ohne das Wachstum planktonischer Zellen zu beeinträchtigen.

Um dem entgegenzuwirken, wurden in dieser Studie Metaboliten verwendet, die von natürlichen biofilmbildenden Bakterienkonsortien produziert wurden. Aus marinen Bakteriengemeinschaften gewonnene Verbindungen sind äußerst wertvoll für die Förderung des Überlebens von Bakterien, insbesondere in Konkurrenzumgebungen wie marinen Biofilmen. Das Screening verschiedener Bakterienextrakte auf Anti-Biofilm-Verbindungen ergab die Wirksamkeit der meisten Extrakte. Interessanterweise wurde die Fähigkeit zur Verbesserung des Biofilms auch bei wenigen Bakterienisolaten beobachtet. Diese Fähigkeit bezeichnet die Beschaffenheit der Bakterien und ihrer Umgebung, also des natürlichen Biofilms. Im Allgemeinen zeigen Bakteriengemeinschaften, die in marinen Biofilmen leben, sowohl synergistisches als auch konkurrierendes Verhalten49. Synergistisches Verhalten fördert das Wachstum peripherer Wohngemeinschaften, während Konkurrenzverhalten den gegenteiligen Effekt hat. Bakterienisolate, die die Fähigkeit zur Verbesserung des Biofilms zeigten, könnten ein kooperatives Verhalten mit anderen Bakterienmitgliedern zeigen. Um die Virulenz potenter Krankheitserreger zu reduzieren, spielen jedoch kompetitive Bakterienisolate eine wichtige Rolle. Von diesen kompetitiven Bakterienisolaten produzierte Verbindungen werden umfassend auf ihre Anti-Biofilm-, antimikrobiellen und Anti-Quorum-Sensing-Eigenschaften gegenüber grampositiven und -negativen Bakterien untersucht50,51,52,53. Allerdings wird die Wirksamkeit von aus Meeresbakterien stammenden Metaboliten (insbesondere aus marinen Biofilmen) gegen den menschlichen Pilzpathogen, insbesondere C. albicans, selten untersucht. Vor diesem Hintergrund untersuchte die vorliegende Studie die in vitro-Hemmwirkung von 3HC, das von einem Meeresbakterium B. abyssalis produziert wird, gegen den Biofilm und die Virulenzfaktoren von C. albicans.

Cumarin und seine Derivate sind natürliche polyphenolische, kristalline, sauerstoffhaltige heterozyklische Verbindungen, die überwiegend in Pflanzen als Heterosiden oder in freier Form vorkommen54. Obwohl sie größtenteils pflanzenassoziiert sind, wurde festgestellt, dass einige Derivate wie Novobiocin, Coumermycin und Aflatoxin auch von Mikroben produziert werden55,56. Die in unserer Studie interessante Verbindung (3HC) ist ein einfaches Cumarin, das wenig Beachtung gefunden hat. Kürzlich wurde 3HC aufgrund seiner Fähigkeit, rekombinante menschliche Tyrosinase zu hemmen, identifiziert und effektiv für topische pharmazeutische Anwendungen entwickelt57. Dennoch wurde 3HC noch nicht gegen menschliche Krankheitserreger untersucht. Daher ist diese Studie die erste, die 3HC aus einem Meeresbakterium identifiziert und seine Anti-Biofilm-Wirksamkeit gegen C. albicans bestimmt.

Die gesamte Biofilmentwicklung von C. albicans umfasst drei Hauptphasen, nämlich das Frühstadium, das Entwicklungsstadium und das Reifestadium58. In der vorliegenden Studie wurde eine signifikante Hemmwirkung von 3HC gegen den Biofilm von C. albicans beobachtet. Wichtig ist, dass 3HC etwa 72 % der Biofilmbildung bei einer Konzentration von 125 µg mL-1 unterdrückte und die Biofilmbildung bei einer Konzentration von 250 µg mL-1 vollständig inhibierte (~ 98 %). Veränderungen in der Intensität der CV-Färbung sowohl in spektroskopischen als auch in lichtmikroskopischen Untersuchungen bestätigten diese Beobachtung. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die Anti-Biofilm-Wirkung von 3HC dosisabhängig ist. Im Gegensatz zu Planktonzellen weisen biofilmbildende Zellen einzigartige Eigenschaften auf und sind von einer schützenden extrazellulären Matrix umgeben. Der MBIC stellt die Konzentration von 3HC dar, die erforderlich ist, um die Bildung und das Wachstum von Biofilmen zu hemmen, anstatt die gesamte Mikrobenpopulation innerhalb des Biofilms auszurotten. Es dient als Indikator für die Wirksamkeit des Wirkstoffs bei der Bewältigung biofilmbedingter Komplikationen durch Hemmung der Biofilmentwicklung. Dieser Ansatz erkennt die einzigartigen Eigenschaften von Biofilmen an und zielt darauf ab, ihre schädlichen Auswirkungen, wie z. B. eine verringerte Anfälligkeit für Antibiotika und eine erhöhte Pathogenität, abzumildern, anstatt sich ausschließlich auf die Abtötung von Mikroben zu konzentrieren. Die hohe Hydrophobie von 3HC hätte verhindert, dass die Zellen an der Oberfläche haften konnten57. Darüber hinaus sollte ein ideales Anti-Biofilm-Mittel auch nicht fungizid sein, um das Risiko einer Resistenzentwicklung zu verhindern59. Basierend auf den Ergebnissen des Lebensfähigkeitstests wurde gezeigt, dass 3HC nicht tödliche Wirkungen hat, was seine Wirksamkeit als wirksames Anti-Biofilm-Mittel weiter stärkt. Darüber hinaus könnte die vollständige Hemmung der Biofilmbildung bei künstlichem Speichel auf dessen sauren Charakter zurückgeführt werden. Künstliche Speichelformulierungen streben typischerweise danach, den leicht sauren pH-Wert (im Bereich von 6,2 bis 7,6) des natürlichen Speichels zu reproduzieren. Dieser Säuregehalt spielt eine entscheidende Rolle bei der Schaffung einer Umgebung, die für das Wachstum von C. albicans ungünstiger ist. Darüber hinaus könnte die Einführung von 3HC die Hemmung der Biofilmbildung weiter verstärkt haben, was zu einer wirksameren Hemmung geführt hätte.

Das Anhaften von Candida-Zellen an einer beliebigen Oberfläche ist der primäre Schritt in der Kaskade der Biofilmbildung. Nach der Adhäsion auf einer Oberfläche entwickeln sich die Hefezellen allmählich zu Hyphenformen, was sowohl für die Bildung als auch für die Verbreitung von Biofilmen als äußerst wichtig angesehen wird60. Darüber hinaus sind Zelladhäsion und Hefe-zu-Hyphen-Übergang die entscheidenden pathogenen Elemente in C. albicans, von denen bekannt ist, dass sie aktiv die Invasion der Candida-Zellen in den Wirt auslösen60. Dies wurde in einer Studie von Saville et al.61 entdeckt, bei der einer Gruppe von Mäusen ein modifizierter C. albicans-Stamm injiziert wurde, der extern für den Übergang der Hefe-zu-Hyphen-Morphologie moduliert werden konnte. Dies erreichten sie, indem sie den negativen Regulator des Filamentierungsgens platzierten; nrg1 unter der Kontrolle eines durch Tetracyclin regulierbaren Promotors und stellte fest, dass Mäuse, denen dieser Stamm injiziert worden war, einer Infektion erlagen, während dies bei der Kontrolle nicht der Fall war62. Daher führt die Hemmung dieser pathogenen Elemente zu einem Defekt bei der Biofilmbildung, der ein Hauptziel bei biofilmspezifischen Behandlungen ist63,64.

Der Filamentierungstest zeigte, dass 3HC offensichtlich den morphologischen Übergang von Candida albicans-Zellen hemmte. Ab 62,5 µg mL-1 3HC war eine große Anzahl von Zellen in der Hefeform eingeschlossen und bei höheren Konzentrationen hemmte 3HC das filamentöse Wachstum vollständig. In ähnlicher Weise vergrößern die Oberflächenfalten der Kolonie nach der Zelladhäsion und dem Wachstum ihre Oberfläche, um sowohl Nährstoffe aufzunehmen als auch für die weitere Hyphenentwicklung und Adhäsinproduktion65. Der Wirkstoff 3HC schränkte selbst in seiner niedrigsten Konzentration (62,5 µg mL−1) die Faltenbildung auf der Kolonieoberfläche ein. Die Verhinderung dieser virulenten Faktoren, die für die Invasion, Anheftung und Biofilmbildung äußerst notwendig sind, bestätigt, dass 3HC die Infektionen von C. albicans offensichtlich behindern könnte.

Es wurde festgestellt, dass 3HC nicht nur gegen die Virulenzfaktoren für die frühe Biofilminitiierung wirkt, sondern auch wirksam gegen reife Biofilm- und Virulenzfaktoren wirkt. Beispielsweise induzierte 3HC möglicherweise den Übergang von Hyphen- zu Hefezellen und störte den reifen Biofilm erheblich. Ein solcher Übergang ist in Fällen einer ausgereiften Infektion von Vorteil, wo die Hemmung der Virulenzfaktoren die Anfälligkeit der Candida-Zellen gegenüber der Immunantwort des Wirts und Therapeutika erhöhen kann.

Um den plausiblen Anti-Biofilm-Mechanismus von 3HC aufzuklären, wurde außerdem eine qPCR durchgeführt und Änderungen auf Transkriptionsebene bestimmt. Die Gene wurden auf der Grundlage der positiven Regulation anfänglicher Virulenzfaktoren wie Adhäsion und Morphogenese ausgewählt. Die Ergebnisse zeigten die negative Regulation der an der Virulenz beteiligten Gene, darunter als3, cph1, eap1, efg1, hst1, hwp1, ras1 und ume6. Die als-Genfamilie, einschließlich als3, spielt eine entscheidende Rolle bei der Adhäsion von Hefezellen und ist ein wesentlicher Bestandteil der Biofilmbildung. Andere Transkriptionsfaktoren wie efg1 und cph1 sind die ersten identifizierten Regulatoren der Hyphenentwicklung und regulieren synergistisch Virulenzgene66. Der Hyphen-spezifische Transkriptionsfaktor hwp1 reguliert die Entwicklung der Hyphen, die Paarungseffizienz und die Integrität des Biofilms. Die in dieser Studie beobachtete Herunterregulierung von hwp1 und als3 weist auf eine Verringerung der Zelladhäsions- und Virulenzfähigkeit hin, was weiter zur Ablösung von Biofilmen von abiotischen Substraten führen könnte66,67. Die Herunterregulierung von Genen wie ume6 und ras1, die für den morphologischen Wechsel (Hefe-zu-Hyphe) bzw. polarisierte Filamente verantwortlich sind, nach der 3HC-Behandlung bestätigt dessen Anti-Biofilm-Potenzial68. Insgesamt kamen unsere qPCR-Ergebnisse zu dem Schluss, dass 3HC die wichtigsten primären Virulenzfaktoren behindert, einschließlich Adhäsion und Morphogenese, die für die Biofilmbildung durch C. albicans-Zellen erforderlich sind.

Trotz aller oben genannten Diskussionen muss eine Verbindung für klinische Anwendungen für menschliche Zellen ungiftig sein. Hierbei werden menschliche Erythrozyten und HBECs sowohl im Hinblick auf intestinale als auch orale Candidiasis gezielt eingesetzt. Die Ergebnisse zeigten keine toxische Wirkung des Wirkstoffs 3HC, was seine Wirksamkeit für klinische Anwendungen bestätigte. Darüber hinaus wurde in einer früheren Studie auch über die nicht-zytotoxische Wirkung von 3HC auf B16F10-Melanomzellen berichtet57.

Zusammenfassend zeigte diese Studie zum ersten Mal die Anti-Biofilm- und Anti-Virulenz-Wirksamkeit von 3HC, einer aus Meeresbakterien gewonnenen Verbindung, auf C. albicans. Diese Verbindung beeinträchtigte deutlich die anfängliche Adhärenz von C. albicans und hemmte den morphologischen Übergang von Hefezellen. Die Verbindung 3HC hemmte nicht nur spezifisch die Biofilmbildung und Hyphenentwicklung, sondern behindert auch die Expression von Genen, die positiv an der anfänglichen Adhäsion, Morphogenese und Biofilmbildung in C. albicans beteiligt sind. Die Ergebnisse von Toxizitätsexperimenten an menschlichen Erythrozyten und HBECs bestätigten die Unbedenklichkeit von 3HC. Aufgrund seiner herausragenden Anti-Biofilm- und Anti-Virulenz-Wirkung gegen C. albicans mit nicht tödlicher und ungiftiger Natur kann 3HC als vielversprechende Verbindung angesehen werden, um dem Auftreten von Biofilm-vermittelten Infektionen durch C. albicans vorzubeugen. Insgesamt liefert die vorliegende Studie neue Erkenntnisse für die Identifizierung neuartiger Bioaktivstoffe aus einem hart umkämpften Umfeld wie dem marinen Biofilm. In zukünftigen Studien wäre die Entschlüsselung detaillierter molekularer Mechanismen von 3HC mithilfe von Transkriptomik- und Proteomik-Ansätzen ein bedeutender wissenschaftlicher Beitrag.

Die Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind im Manuskript enthalten. Die während der aktuellen Studie generierte bakterielle 16S-rRNA-Gensequenzierung ist in der GenBank des NCBI unter der Zugangsnummer MZ357100 verfügbar.

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Die Forschungsarbeit wurde finanziell vom Department of Atomic Energy-Board of Research in Nuclear Sciences (DAE-BRNS) der indischen Regierung unterstützt (Grant No.: 51/14/06/2019-BRNS).

Meora Rajeev

Aktuelle Adresse: Department of Biological Sciences and Bioengineering, Inha University, Inharo 100, Incheon, 22212, Republik Korea

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: TJ Sushmitha und Meora Rajeev.

Abteilung für Biotechnologie, Alagappa University, Science Campus, Karaikudi, Tamil Nadu, 630 003, Indien

TJ Sushmitha, Meora Rajeev, Vellaisamy Kathirkaman, Singh Shivam und Shunmugiah Karutha Pandian

School of Arts and Sciences, Sai University, OMR, Paiyanur, Tamil Nadu, 603105, Indien

Toleti Subba Rao

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TJS: Konzeptualisierung, formale Analyse, Untersuchung, Methodik, Schreiben – Originalentwurf, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung. MR: Konzeptualisierung, Schreiben, Überprüfen und Bearbeiten. VK und SS: Experimente und formale Analyse. TSR und SKP: Finanzierungsakquise, Projektverwaltung, Supervision, Schreiben, Begutachtung und Redaktion.

Korrespondenz mit Shunmugiah Karutha Pandian.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Sushmitha, TJ, Rajeev, M., Kathirkaman, V. et al. 3-Hydroxycumarin zeigt eine Anti-Biofilm- und Anti-Hyphen-Wirksamkeit gegen Candida albicans durch Hemmung der Zelladhäsion, Morphogenese und Regulierung virulenter Gene. Sci Rep 13, 11687 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-37851-1

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Eingegangen: 3. April 2023

Angenommen: 28. Juni 2023

Veröffentlicht: 19. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-37851-1

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