Ein rekombinanter Aspergillus oryzae-Pilz, der von Larven auf Erwachsene von Anopheles stephensi-Mücken übertragen wird, hemmt die Oozystenentwicklung von Malariaparasiten

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 12177 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die Kontrolle der Übertragung von Malariaparasiten von Mücken auf den Menschen wird durch die abnehmende Wirksamkeit von Insektiziden, die Entwicklung von Arzneimittelresistenzen gegen die letzten Mittel gegen Malaria und das Fehlen wirksamer Impfstoffe erschwert. Hierin wurde die antiplasmodiale Übertragungsblockierungsaktivität eines rekombinanten Pilzstamms von Aspergillus oryzae (A. oryzae-R), der in der menschlichen Lebensmittelindustrie verwendet wird, an im Labor gezüchteten Anopheles stephensi-Mücken untersucht. Der rekombinante Pilzstamm wurde genetisch verändert, um zwei antiplasmodiale Effektorpeptide abzusondern, MP2 (Mitteldarmpeptid 2) und EPIP (Enolase-Plasminogen-Interaktionspeptid). Die transstadiale Übertragung des Pilzes von Larven auf erwachsene Mücken wurde nach der Inokulation von A. oryzae-R in den zur Larvenaufzucht verwendeten Wasserschalen bestätigt. Die Sekretion der antiplasmodialen Effektorpeptide im Mitteldarm der Mücke hemmte die Oozystenbildung von P. berghei-Parasiten. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass A. oryzae als Paratransgenese-Modell verwendet werden kann, das Effektorproteine ​​trägt, um die Entwicklung von Malariaparasiten in An zu hemmen. Stephensi. Weitere Studien sind erforderlich, um festzustellen, ob dieser rekombinante Pilz unter natürlichen Bedingungen und mit minimalen oder keinen Auswirkungen auf die Umwelt angepasst werden kann, um Erreger von durch Mücken übertragenen Infektionskrankheiten in seinen Vektoren anzugreifen.

Plasmodium, das Malaria verursacht, ist die wichtigste durch Vektoren übertragene Krankheit und wird durch den Stich infizierter Anophelinmücken übertragen1. Fast die Hälfte der Weltbevölkerung lebt in malariagefährdeten Gebieten und jedes Jahr sterben mehr als 400.000 Menschen an Malaria, die meisten davon sind kleine Kinder1. Trotz fortgesetzter Managementbemühungen war die Malariabekämpfung nur begrenzt erfolgreich, die Infektionsrate hat ein Plateau erreicht und eine Ausrottung ist weiterhin schwer zu erreichen. Zweifellos hat die aktuelle COVID-19-Pandemie indirekte Auswirkungen auf die Malariabekämpfung. Die schnelle Reaktion auf COVID-19 muss zu Bemühungen zur Verbesserung der Malariakontrolle führen, andernfalls besteht die Gefahr, dass die durch diese Pandemie verursachte Sterblichkeit, insbesondere bei Kindern, zunimmt und eine der wirksamsten Kampagnen im Bereich der öffentlichen Gesundheit zunichte gemacht wird2. Daher besteht ein dringender Bedarf an praktischen Alternativen zur Malariabekämpfung1.

Mücken sind die Endwirte von Malaria und vielen anderen durch Vektoren übertragenen Krankheiten. Anopheles stephensi ist ein Hauptüberträger von Malaria in Asien und hat sich kürzlich am Horn von Afrika ausgebreitet3. Bei der Mücke durchläuft der Parasit Entwicklungs-, Vermehrungs- und Reifungsschritte im Mitteldarm4. Der Mitteldarm kann daher als Hauptziel für Eingriffe angesehen werden, sodass die Konkurrenz zwischen Mikrobiomen im Darm dazu führen kann, dass eine bestimmte Art im Darm die Oberhand gewinnt5,6. Die Mikrobiota der Mücke kann in jedem der verschiedenen Stadien des Lebenszyklus der Mücke aus der Umwelt stammen und hat wichtige Auswirkungen durch Wechselwirkungen mit biologischen Prozessen der Mücke, wie z. B. Wachstum, Immunreaktionen, Verdauung, Fortpflanzung und Resistenz gegen Krankheitserreger7,8. Die Artenzusammensetzung des Mückenmikrobioms ist daher sehr dynamisch und vielfältig9,10,11.

In den letzten Jahren konzentrierte sich ein Großteil der Malariaforschungsagenda auf die Entwicklung von Arzneimitteln oder Impfstoffen. Da die Wirksamkeit von Insektiziden und Malariabehandlungen abnimmt und wirksame Impfstoffe gegen durch Mücken übertragene Krankheiten unzureichend sind, deuten die Ergebnisse des am weitesten fortgeschrittenen Malariaimpfstoffs (RTS, S) darauf hin, dass er nur die Morbidität reduziert und daher als Instrument unzureichend ist um das Ziel der Ausrottung der Malaria zu erreichen1. Die Nachfrage nach dynamischeren vektororientierten Steuerungsansätzen entwickelt sich zunehmend12. Unter den kürzlich vorgeschlagenen Methoden ist die Paratransgenese ein neuartiger und vielschichtiger Signalwegansatz, der als potenzielles Mittel zur Bekämpfung von durch Vektoren übertragenen Krankheiten vorgeschlagen wurde. Bei diesem Ansatz wird versucht, einen Krankheitserreger aus einer Vektorgemeinschaft zu eliminieren, indem symbiotische Organismen des Vektors, wie Bakterien, Viren oder Pilze, genetisch manipuliert werden, indem der Endosymbiont dazu veranlasst wird, antipathogene Effektormoleküle zu produzieren13,14. Mikroorganismen wie Viren15, Pilze13,16 und Bakterien17 wurden als Paratransgenese-Kandidaten in Malaria-Überträgern getestet. Um den Ansatz zu erleichtern, müssen die für die Paratransgenese verwendeten Mikroorganismen mit der Zielvektorpopulation assoziiert sein, in allgemein verfügbaren und kostengünstigen Medien effizient wachsen und im Labor genetisch modifizierbar sein. Nach der Genmanipulation müssen sie dem Wildtyp ähnlich bleiben, sich effizient innerhalb des Vektors ansiedeln und dominieren und schließlich sicher für Menschen, die Umwelt und Nichtzieltiere sein18.

Die meisten Studien im Zusammenhang mit dem Paratransgensis-Ansatz konzentrierten sich auf die Mikrobiota des Mitteldarms von Mücken8,19,20. In dieser Studie haben wir uns auf Aspergillus oryzae (A. oryzae) konzentriert, der zur Herstellung fermentierter Lebensmittel und Getränke wie Sake und Shoyu verwendet wird. Darüber hinaus kann es aus Böden und Pflanzen isoliert werden und ist weder für Mensch noch für Tier schädlich. A. oryzae ist ein Mikroorganismus, der allgemein als sicher gilt. Es kann mit der derzeit verfügbaren Technologie leicht angebaut und in großen Mengen produziert werden21. Tatsächlich wurde kürzlich ein pilzbasiertes genetisches Modifikationssystem eingesetzt, das relativ einfach und einfacher ist als paratransgene Wirkstoffe wie Mitteldarmbakterien von Mücken und bereits zur Bekämpfung anderer Vektoren eingesetzt wurde13. Da sie häufig freilebend, umweltfreundlich und hochwirksam sind und als Sporen monatelang in der Umwelt überleben können22, sind Pilze hervorragende Kandidaten für die Paratransgenese. Sobald sie in das Insekt eindringen, vermehren sie sich im Körper des Insekts und schließlich werden die Pilzsporen aus dem Insekt freigesetzt, wodurch ihr Lebenszyklus abgeschlossen wird13,23.

Es wäre äußerst lohnenswert, transgene Pilzstämme zu erhalten, die die Infektiosität von Mücken deutlich reduzieren, da dies die Krankheitsbekämpfung verbessern könnte, ohne Mücken zu töten24. Auch die effiziente Verbreitung solcher Mikroorganismen ist eine große Herausforderung. In der aktuellen Studie zu A. oryzae haben wir gezeigt, dass diese Pilze für diese Aufgabe nahezu perfekt geeignet sind. A. oryzae wird leicht von Larven auf erwachsene Tiere übertragen. Die Pilze besiedeln auch stabil den Darm der Mücke, wo sich Malariaparasiten entwickeln. Wir haben A. oryzae mit einem Plasmid modifiziert, das ein grün fluoreszierendes Protein und Moleküle exprimiert, die die Parasitenentwicklung im Vektor selektiv blockieren. MP2 und EPIP sind zwei identifizierte Peptide, die die Entwicklung von Plasmodium im Mitteldarm von Anopheles hemmen18,25,26,27. Das Glucoamylase (GLA)-Protein wird als Fusionsprotein eingesetzt, um die Sekretion von GFP und Peptiden in das Medium mit erhöhter Effizienz zu erleichtern. Zwei Effektorgene wurden in zwei verschiedenen Konstrukten in den pyrG-auxotrophen A. oryzae-Stamm eingeführt: A. oryzae-RE; GLA-GFP-EPIP (Glucoamylase-grün fluoreszierendes Protein-Enolase-Plasminogen-Interaktionspeptid-Fusion) und A. oryzae-RM: GLA-GFP-MP2 (Glucoamylase-grün fluoreszierendes Protein-Mitteldarmpeptid-2-Fusion).

EPIP ist ein Peptid, das die Bindung von Plasminogen an die Ookinetenoberfläche während der Parasiteninvasion des Mitteldarmepithels28,29,30 verhindert, und MP2 bindet an die Oberfläche des Mitteldarms der Mücke und hemmt die Plasmodiuminvasion28,31. Diese Effektorproteine ​​hemmen Plasmodium stark, indem sie die Oozystenbildung reduzieren25,26,30,31. Die Kombination von hochwirksamem A. oryzae als Träger und EPIP und MP2 als Effektoren scheint daher vielversprechend für die Reduzierung der Malaria-Infektiosität bei Mücken.

Hier präsentieren wir Daten aus unserer Studie, in der transgene A. oryzae in An eingeführt wurden. Stephensi-Larven im ersten Larvenstadium (L1) 24 Stunden lang über Wasser kultivieren. Die Populationsdynamik GFP-markierter Pilze wurde durch konfokale Mikroskopie bestimmt und zusätzlich durch qPCR, Western Blot und Kultur bestätigt. Die Fähigkeit eines Mikroorganismus, in einer Vektorpopulation transstadial zu übertragen, hängt von der Fähigkeit des Mikroorganismus ab, den Larvendarm zu besiedeln und über einen längeren Zeitraum auf erwachsene Tiere zu übertragen. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass A. oryzae-R transstadial von der Larve auf das erwachsene Tier übertragen wird, was diesen Pilz zu einem geeigneten Kandidaten für die Paratransgenese macht. Rekombinante Pilzstämme wurden auf ihre Fähigkeit getestet, die Entwicklung von Plasmodium berghei im An zu blockieren. Stephensi-Mücke. Die Ergebnisse zeigen, dass rekombinantes A. oryzae als Paratransgenesesystem zur Hemmung der Oozystenbildung in An verwendet werden kann. stephensi im Mitteldarm durch zwei Anti-Plasmodium-Effektormoleküle, MP2 und EPIP, die für die Ausrottung des Parasiten vielversprechend sein könnten. Diese Studie unterstreicht die Möglichkeit, dass A. oryzae verschiedene Effektormoleküle gegen durch Vektoren übertragene Krankheiten und zum Zweck der Krankheitsbekämpfung unter natürlichen Bedingungen liefern kann. Die Optimierung dieser Methode wird uns helfen, in Zukunft neue Strategien zur Behandlung von durch Vektoren übertragenen Krankheiten zu entwickeln.

Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den örtlichen Tierschutzgesetzen, Richtlinien und Richtlinien der Bezmialem Vakıf-Universität, des Beykoz-Instituts für Biowissenschaften und Biotechnologie durchgeführt und das Tierprotokoll wurde vom Tierpflege- und Nutzungsausschuss der Bezmialem Vakıf-Universität genehmigt (Protokoll). Nummer 2021/155) und die genetischen Veränderungsexperimente wurden von der Bezmialem Vakif Universität und TUBITAK (dem Rat für wissenschaftliche und technologische Forschung der Türkei) genehmigt.

Ein. stephensi (WT-Stamm) wurden unter Standard-Insektenbedingungen in klimatisierten Räumen aufgezogen, die bei 27 °C (± 1), 80 % relativer Luftfeuchtigkeit und einer Licht-Dunkel-Photoperiode von 12 Stunden:12 Stunden gehalten wurden. Die Larven wurden mit Tetramin®-Fischfutter (Tetra, Melle, Deutschland) gefüttert, wobei 0,1 mg/Larve für die ersten Larvenstadien und 0,3 mg/Larve für die anderen drei Larvenstadien in Aufzuchtschalen mit einer Größe von 10 × 25 × 8 cm verwendet wurden 1 l Wasser mit einer Dichte von ca. 0,3 Larven/cm2. Puppen wurden gesammelt und in Haltekäfige gegeben und mit einer Ad-libitum-Versorgung mit 10 %iger Saccharoselösung für erwachsene Mücken versorgt32.

Der A. oryzae-Stamm RIB40 (Kat.-Nr.: 42149) wurde von ATCC (American Type Culture Collection) erworben. Für die Pilztransformation wurde ein pyrG (-) A. oryzae RIB40-Stamm verwendet, der in unserem Labor für eine frühere Studie erzeugt wurde33. Escherichia coli Mach TM wurde zur DNA-Klonierung und Plasmidamplifikation eingesetzt. Der rekombinante A. oryzae wurde so modifiziert, dass er GFP und die Antimalaria-Effektorproteine ​​MP2 und EPIP exprimiert und sekretiert, wobei zwei verschiedene Konstrukte getrennt verwendet wurden: A. oryzae-RE: GLA-GFP-EPIP (Glucoamylase-grün fluoreszierendes Protein-Plasmodium-Enolase-Plasminogen-Interaktionspeptid). Fusion) und A. oryzae-RM: GLA-GFP-MP2 (Glucoamylase-grün fluoreszierendes Protein-Mitteldarmpeptid-2-Fusion). Alle Gene wurden in einen maßgeschneiderten Expressionsvektor kloniert, der die Expression mithilfe des TAKA-Amylase-Promotors steuert (Abb. 1). Genetisch veränderte Pilze wurden nach der Inkubation bei 30 °C 4–6 Tage lang auf Czapek-Dox (CD)-Mediumplatten bei 30 °C kultiviert. Einzelne unterschiedliche Pilzkolonien wurden von der Platte isoliert, die Sporenschicht sorgfältig geerntet und in Dextrin-Pepton-Hefe (DPY)-Flüssigmedium inokuliert und 5–7 Tage bei 30 °C und 180 U/min inkubiert. Das Vorhandensein von A. oryzae-R wurde durch konfokale Mikroskopie bestätigt.

Ausdrucksvektor. (i) Expressionsvektor von A. oryzae-RE und (ii) A. oryzae-RM, (a) Lineares Plasmid von A. oryzae-RE, das den Taka-Amylase-Promotor, das Glucoamylase-grün fluoreszierende Protein-Plasmodium-Enolase-Plasminogen-Interaktionspeptid enthält Fusion und Terminator. (b) Lineares Plasmid von A. oryzae-RM, das die Taka-Amylase-Promotor-Glucoamylase-grün fluoreszierendes Protein-Mitteldarm-Peptid-2-Fusion und den Terminator enthält.

Untersuchung der Kolonisierung und Anpassung von A. oryzae-R im Darm von An. Stephensi-Larven und Transfer in den Mitteldarm erwachsener Mücken, etwa 4 × 106 Konidien/ml wurden in 100 ml DPY-Medium inokuliert und dann 5–7 Tage lang bei 30 °C für die GFP-Expression inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Pilze durch verifiziert konfokale Mikroskopie, um das Vorhandensein der rekombinanten Pilze durch GFP-Nachweis zu bestätigen. A. oryzae-R (A. oryzae-RE und A. oryzae-RM in gleichen Verhältnissen gemischt) wurden zu Wasser gegeben, das Larven des ersten Stadiums (L1) von An enthielt. stephensi in einer Endkonzentration von 1:200 kultiviert und 24 Stunden lang inkubiert.

Die eingetauchten Larven wurden nach 24 Stunden gesammelt, zweimal in separaten Bädern mit destilliertem Wasser gewaschen, um Pilze auf der Körperoberfläche der Larven zu entfernen, und dann in Süßwasser überführt, um eine Kontamination mit externen Pilzen zu vermeiden. Das Vorhandensein der veränderten Pilze wurde zu vier Zeitpunkten (Tage 1, 4, 7 und 10) nach der Inokulation mit den Pilzen und erneut zu vier Zeitpunkten (Tage 1, 4, 7 und 10) nach dem Schlüpfen der erwachsenen Tiere überwacht . Einzelne Larven und erwachsene Mücken wurden vor der Sektion durch Waschen in 75 % Ethanol und anschließendes Spülen in sterilem PBS oberflächensterilisiert.

Zu jedem Zeitpunkt wurden mindestens 5 Larven gesammelt, seziert und unter Verwendung eines konfokalen Mikroskops (konfokales Laser-Scanning-Mikroskop Leica DMi8, 20 × Objektive) auf das Vorhandensein von GFP untersucht, um die Lebensfähigkeit und Aktivität der Pilze im Larvendarm zu beurteilen. Um die Kolonisierung von A. oryzae-R im Larvendarm, die Resistenz in der Darmumgebung und die Übertragung auf den Mitteldarm erwachsener Mücken (transstadiale Übertragung) zu untersuchen, wurden mindestens fünf weibliche Mücken gesammelt, oberflächensterilisiert und präpariert, um ihren Mitteldarm zu erhalten zu bestimmten Zeitpunkten aufgenommen und dann mittels konfokaler Mikroskopie auf das Vorhandensein von GFP-exprimierenden Pilzen untersucht. Darüber hinaus hat An. Stephensi-Larven wurden in Schalen ohne A. oryzae-R als Negativkontrolle aufgezogen.

Von den Larven wurden zu vier Zeitpunkten Proben genommen: 1, 4, 7 und 10 Tage nach der Inokulation in die Larve und zu den gleichen Zeitpunkten (Tage 1, 4, 7 und 10) nach dem Auflaufen als Erwachsene. Die Proben wurden mit 75 % Ethanol oberflächensterilisiert und in sterilem PBS35 gespült. Genomische DNA wurde aus Versuchs- und Kontrollgruppen mit einem DNeasy® Blood & Tissue Kit (QIAGEN) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Zu jedem Zeitpunkt wurden Gruppen von 5–10 Larven und 5–10 erwachsenen Mücken getrennt gesammelt. Der Assay ermöglichte den spezifischen Nachweis einer 128 bp langen Sequenz des pyrG-Gens in A. oryzae. Die Sequenzen der Vorwärts- und Rückwärtsprimer waren 5'ATATCCTCTCCGATTTCAGCGAAGA bzw. 5'ATGGTACTGCTTTTGGACTGTGTTT. qPCR wurde mit SYBR Green Master Mix (Bio-Rad, USA) durchgeführt. Das ribosomale 18S-RNA-Gen wurde als Referenzgen für die Normalisierung verwendet. Die Reaktionen wurden in einem Endreaktionsvolumen von 20 μl mit 200 nM Vorwärts- und Rückwärtsprimern und 50 ng/μl der DNA-Matrize36,37,38 durchgeführt. Der Assay wurde auf einem qPCR-Instrument Rotor-Gene Q System (QIAGEN) durchgeführt und die Daten wurden in Echtzeit erfasst. Für qPCR wurden drei experimentelle Replikate verwendet. Die optimierten Zyklusbedingungen bestanden aus 94 °C für 4 Minuten, gefolgt von 40 Zyklen mit 95 °C für 10 Sekunden, 60 °C für 15 Sekunden, 72 °C für 10 Sekunden38. Zur Überprüfung der Primer-Dimer-Bildung wurden Schmelzkurvenanalysen durchgeführt. Für alle PCR-Reaktionen wurden CT-Werte bestimmt und eine vergleichende CT-Methode verwendet, um die Kopienzahl des exprimierten pyrG-Gens zu berechnen. Die relative Menge des exprimierten Gens wurde zu RQ = 2−(∆∆CT)39,40 berechnet.

Um die Expression und Sekretion von GFP-Fusionsproteinspiegeln durch rekombinante A. oryzae in den Larven und im Mitteldarm der erwachsenen Mücke zu bestimmen, wurden Gruppen von 20–50 Larven und erwachsenen Mücken zu zwei Zeitpunkten (Tag 1 und 10) nach der Inokulation untersucht Larvenstadium und nach dem Auflaufen im Erwachsenenstadium an den Tagen 1 und 10. Vor der Sektion wurden einzelne Larven und erwachsene Mücken durch Waschen in 75 % Ethanol und anschließendes Spülen in sterilem PBS oberflächensterilisiert. Als Negativkontrollen dienten die Larven und die adulte Kohorte, die mit A. oryzae-Wildtyp inokuliert worden waren. Die Proteinisolierung aus den präparierten Eingeweiden im Larven- und Erwachsenenstadium wurde gemäß der Methode von41 durchgeführt. Western Blot wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt42,43,44. Proteinproben wurden mittels 8 % SDS-PAGE aufgetrennt und auf eine Nitrozellulosemembran (Amersham Protran Premium 0,45 μm NC, GE Healthcare) übertragen. Die Membran wurde in Blockierungspuffer (0,1 % Tween-20 mit 5 % w/v fettfreier Trockenmilch) inkubiert und mit monoklonalem GFP-Antikörper (GF28R) und HRP (Invitrogen) sondiert. Als Positivkontrolle wurde der Überstand von Kulturen von A. oryzae verwendet, die GFP-Fusionsprotein produzieren. Pilzkulturen wurden 15 Minuten lang bei 4 ° C und 4000 × g zentrifugiert, und ein gleiches Volumen des Kulturüberstands wurde unter Verwendung von Amicon Ultra-15-Zentrifugalfiltereinheiten konzentriert.

Die Proben wurden zu vier Zeitpunkten (Tage 1, 4, 7 und 10) nach der Inokulation im Larvenstadium und an den Tagen 1, 4, 7 und 10 nach dem Schlüpfen der erwachsenen Tiere ausgewählt. Als Negativkontrollen dienten unbehandelte Larven und adulte Tiere. Die Oberflächen von Larven und erwachsenen Mücken wurden vor der Präparation mit 75 % Ethanol sterilisiert, und die präparierten Eingeweide wurden einzeln in 100 μl steriler 1 % PBS homogenisiert (10 Proben zu jedem Zeitpunkt in jedem Stadium). Homogenate wurden auf Czapek-Dox (CD)-Mediumplatten mit 50 μg/ml Kanamycin und 100 μg/ml Ampicillin ausplattiert und 3 Tage bei 30 °C inkubiert. Einzelne unterschiedliche Pilzkolonien wurden von jeder Platte isoliert und in Dextrin-Pepton-Hefe (DPY)-Flüssigmedium inokuliert und dann 5–7 Tage lang bei 30 °C zur GFP-Expression inkubiert45. Anschließend wurde das Vorhandensein von GFP unter dem konfokalen Mikroskop beobachtet.

A. oryzae-R wurde den Larven über Wasser zugeführt. Die 2 Tage alten Larven wurden 24 Stunden lang inkubiert. Eine Kontrollgruppe von Larven wurde in einer Schale ohne Pilze aufgezogen. Das Überleben der Larven und der geschlüpften erwachsenen Tiere wurde täglich überwacht. Insgesamt wurden 150 Larven und erwachsene Mücken pro Gruppe separat untersucht (50 pro Gruppe × 3 Wiederholungen = 150). Fünf Tage nach dem Schlüpfen wurden erwachsene weibliche Mücken acht Stunden lang ausgehungert und durften sich dann eine Stunde lang von einer Blutmahlzeit ernähren. Um den Erfolg der Blutmahlzeit zu berechnen, wurde die Anzahl der mit Blut ernährten und nicht ernährten Frauen in den beiden Gruppen gezählt und die Blutfütterungsanteile der beiden Gruppen mithilfe eines t-Tests von zwei Anteilen statistisch verglichen. Pro Gruppe wurden insgesamt 150 erwachsene Mücken untersucht (50 Mücken pro Gruppe × 3 Wiederholungen = 150 Mücken)25.

Wildtyp- und rekombinante A. oryzae wurden 24 Stunden lang über Wasser in 2 Tage alte Larven eingeführt. Als Kontrollgruppen dienen Pilz-Minusgruppen. Für Fruchtbarkeits- und Fruchtbarkeitstests wurde eine Methode angewendet, um Weibchen wie zuvor beschrieben zur Eiablage anzuregen46. Mit Blut gefütterte Weibchen wurden mit 10 %iger Saccharoselösung gefüttert und 3 Tage lang bei 27 °C (± 1) und 80 % relativer Luftfeuchtigkeit gehalten, um das vollständige Trächtigkeitsstadium zu erreichen. Die weiblichen Mücken wurden dann vorsichtig einzeln in konische 50-ml-Röhrchen mit einem angefeuchteten Filterpapier am Boden des Röhrchens gegeben. Die Röhren waren mit Baumwolle überzogen. Weibchen, die Eier gelegt hatten, wurden vorsichtig aus den Röhren entfernt. Es wurde die Anzahl der gelegten und geschlüpften Eier gezählt. Die Fruchtbarkeit der gefütterten weiblichen Mücken wurde als Anzahl der pro Weibchen gelegten Eier berechnet. Pro Behandlung wurden insgesamt 90 erwachsene Mücken untersucht (30 Mücken pro Gruppe × 3 Wiederholungen = 90 Mücken). Die Fruchtbarkeit (Anteil der aus den Eiern geschlüpften Larven) wurde als Prozentsatz der Larven berechnet, die nach dem Schlüpfen schlüpften46.

Der P. berghei-Stamm ANKA (MRA-868, MR4, ATCC, Manassas, Virginia) wurde durch zyklische Passage durch BALB/c-Mäuse und An aufrechterhalten. Stephensi-Mücken nach einem Standardprotokoll. Mäuse wurden mit Rompun-Vetalar (3:1,5 mg/kg; Bayer und Parke-Davis Veterinary) und anschließend mit Wildtyp-An betäubt. stephensi wurden mit betäubten Mäusen gefüttert. Die Infektiosität jeder Maus wurde durch Messung der Parasitämie in mit Giemsa gefärbten Schwanzblutausstrichen bestimmt. Die Mäuse mit 1–2 Exflagellationen/Feld unter einem 20-fachen Objektiv wurden für Mückeninfektionen verwendet. Mit Blut gefütterte Mücken wurden bei 21 °C (± 1) und 70 % relativer Luftfeuchtigkeit gehalten.

Ungefähr 4 × 106 Konidien/ml als Ausgangspunkt wurden in 100 ml DPY-Medium inokuliert und dann für 5–7 Tage bei 30 °C zur GFP-Expression inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Pilze durch konfokale Mikroskopie überprüft, um das Vorhandensein von GFP zu bestätigen. Die rekombinanten und Wildtyp-Pilze wurden getrennt weiter 1:200 in Wasser verdünnt und Larven im ersten Stadium (L1) von An. stephensi wurden 24 Stunden lang inkubiert. Die L1 wurden nach 24 Stunden gesammelt, dreimal in sterilem PBS gespült, um Pilze von der Larvenkörperoberfläche zu entfernen, und dann in destilliertes Wasser überführt. Zur Exposition der Larven wurden verschiedene Bedingungen vorbereitet: 1 – keine Pilze (Negativkontrolle), 2 – Wildtyp A. oryzae, 3 – A. oryzae. oryzae-RE, 4 – A. oryzae-RM und. 5 – A. oryzae-R (A. oryzae-RE + A. oryzae-RM). Nach dem Schlüpfen zu erwachsenen Mücken wurde 30 Minuten lang eine Blutmahlzeit mit P. berghei ANKA-Gametozyten an weiblichen 8 Wochen alten BALB/c-Mäusen gefüttert. Vollständig gefütterte Weibchen wurden sortiert und in Käfigen bei 21 ± 1 °C, 70 % relativer Luftfeuchtigkeit und 10 %iger Saccharoselösung gehalten. Die Auswirkung der Parasitenentwicklung wurde 10–12 Tage nach der Infektion durch Zählen der Anzahl der Oozysten im Mitteldarm mittels konfokaler Mikroskopie bestimmt. Pro Behandlung wurden insgesamt 90 erwachsene Mücken untersucht (30 pro Behandlung × 3 Wiederholungen = 90).

Die Studie wurde in Übereinstimmung mit den örtlichen Tierschutzgesetzen, -richtlinien und -richtlinien der Bezmialem Vakıf-Universität und des Beykoz-Instituts für Biowissenschaften und Biotechnologie durchgeführt und das Tierprotokoll wurde vom Tierpflege- und Nutzungsausschuss der Bezmialem Vakıf-Universität genehmigt ( Protokollnummer 2021/155).

A. oryzae wurde gentechnisch verändert, um die Anti-Plasmodium-Effektorproteine ​​EPIP und MP2 abzusondern. Ziel der vorliegenden Studie war es, die mögliche Fähigkeit der transgenen Pilze zu untersuchen, sich im Larvendarm von An anzusiedeln und sich anzupassen. stephensi und die Übertragung auf den Erwachsenen als Paratransgenese-Modell sowie die Möglichkeit, die Entwicklung von P. berghei im Mückendarm zu hemmen. Wenn sie dauerhaft im Larvendarm verbleiben, wollten wir wissen, ob die Pilze in den Mitteldarm der erwachsenen Mücke übertragen werden können (transstadiale Übertragung). Die Persistenz von A. oryzae-R im Mitteldarm von An. stephensi wurde überwacht, um die Dynamik und Aufrechterhaltung dieser Pilze während des Übergangs von der Larve zum Erwachsenen zu untersuchen. Um die Kolonisierung und Persistenz von A. oryzae im Larvendarm zu messen, wurde ein fluoreszierendes Protein-Gen, das für ein verstärktes grün fluoreszierendes Protein (GFP) kodiert, in das Genom von A. oryzae eingebaut. Um diese Parameter zu bewerten, wurden GFP-markierte Pilze über Wasser in An geimpft. Stephensi-Larven im ersten Stadium (L1) für 24 Stunden. In der Umgebung, in der Anopheles-Mücken natürlicherweise leben, sind Larven und Mücken nicht steril. Somit müsste A. oryzae auch mit anderen Arten in der Mikrobiota konkurrieren, die diese Parameter beeinflussen könnten. Durch die Verwendung von Labormückenkolonien wurden jedoch mögliche Störungen durch das breite Spektrum an Mikrobiota in Wildbrutstätten, die unsere Daten beeinflussen könnten, eingeschränkt. Die Kolonisierung von A. oryzae-R im Larvendarm wurde zu vier Zeitpunkten untersucht. In beiden Stadien wurde der Mitteldarm präpariert und mittels konfokaler Mikroskopie auf das Vorhandensein von GFP-markierten Pilzen im Mitteldarm analysiert. Während der Mückenmetamorphose wird die Darmmikrobiota im Larvenstadium eliminiert47, A. oryzae-R verblieb jedoch im Mitteldarm der aus diesen Larven hervorgegangenen Erwachsenen (Abb. 2, 3). Am ersten Tag des Larvenstadiums wurde eine hohe Konzentration GFP-exprimierender Pilze beobachtet, zahlreiche Pilze waren aktiv und besetzten den größten Teil des Darmlumens, einschließlich des vorderen Mitteldarms (AMG) und des hinteren Mitteldarms (PMG), wobei eine gewisse Autofluoreszenz zu beobachten ist die Hinterdarmregion (HG). Dies weist darauf hin, dass es beim Verschlucken zu einem Pilzbefall kommt. Am 4. Tag war die GFP-Intensität relativ hoch und es wurden zahlreiche transgene Pilze beobachtet. Am siebten Tag gingen sie jedoch relativ zurück, obwohl viele Pilzzellen immer noch aktiv waren und GFP im Darm exprimierten. Das Vorhandensein von GFP wurde am 10. Tag bestätigt, war jedoch geringer als an den Vortagen (Abb. 2). Wir gehen davon aus, dass die nicht fluoreszierenden Pilze möglicherweise inaktiv oder tot sind oder über den Kot ausgeschieden werden. Die GFP-Expression war im Erwachsenenstadium im Vergleich zum Larvenstadium relativ gering. Trotz einer geringen Anzahl transgener Pilze im Mitteldarm der erwachsenen Mücken war der Gehalt an grün fluoreszierendem Protein im Mitteldarm erwachsener Mücken während des gesamten Untersuchungszeitraums bemerkenswert und konstant (Abb. 3).

Kolonisierung von A. oryzae-R zu verschiedenen Zeitpunkten im Darm von An. stephensi-Larven, nachgewiesen durch Expression des GFP-Gens in besiedelten Pilzen. Die Populationsdynamik von A. oryzae-R wurde durch konfokale Mikroskopie sichtbar gemacht. (i, j) Negativkontrolle, (a, b) der Darm von L1 An. Stephensi-Larve Tag 1 (c–h) 4,7 und 10 Die Experimente wurden dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt.

Kolonisierung von A. oryzae-R im Mitteldarm erwachsener Mücken zu verschiedenen Zeitpunkten, gezeigt durch GFP, das in den transgenen Pilzen exprimiert wird. (a, b) Erwachsener An. Stephensi Mitteldarm Tag 1 (c–h) 4, 7 bzw. 10, (i, j) Negativkontrolle. Die Experimente wurden dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt.

Die Pilze besiedelten An. stephensi sehr gut in verschiedenen Entwicklungsstadien, einschließlich Larvenstadium 1–4 (L1–L4) und erwachsenen Mücken. Transgene A. oryzae wurden in An transstadial übertragen. stephensi trotz mehrerer Häutungsereignisse während der Larvenstadien sowie hydrolytischer Prozesse während der Metamorphose. Eine kurze Kontaktzeit (24 Stunden) zwischen den Pilzen und den L1-Larven reichte aus, damit die Larven die Pilze aus dem Wasser des Larvenlebensraums aufnehmen konnten. Die Untersuchung der unbehandelten Larven und der erwachsenen Mücken mittels konfokaler Mikroskopie bestätigte das Fehlen transgener Pilze in den Negativkontrollen.

Zur Quantifizierung der Kopienzahlen der rekombinanten Pilze wurde quantitative PCR verwendet. Larven und erwachsene Mücken wurden in den oben genannten Abständen untersucht. Die Größe und Qualität der amplifizierten qPCR-Produkte zeigte deutliche spezifische Banden auf dem Agarosegel sowohl für die Larven- als auch für die erwachsenen Mückenproben (Daten nicht gezeigt). Die qPCR-Amplifikation der Proben zeigte das Vorhandensein der Pilze im Darm der Larven und erwachsenen Mücken. Die Quantifizierung erfolgte durch Targeting einer 128-bp-Sequenz des pyrG-Gens (Abb. 4). Die Mittelwerte der Amplifikationseffizienz pro Amplikon in den Larvenproben betrugen 69 % (Tag 1), 64 % (Tag 4), 52 % (Tag 7) und 43 % (Tag 10). Sie nahm am Tag 10 im Vergleich zum Tag 1 ab. Die qPCR-Analyse im Larvenstadium zwischen der Negativkontrolle und den Tagen 1, 4 und 7 zeigte hochsignifikante Unterschiede, p < 0,05 (Abb. 4i). Bei den erwachsenen Mücken betrugen die Verstärkungseffizienzen 41,6 %, 34,0 %, 28,0 % und 19,6 % an den Tagen 1, 4, 7 und 10 (Abb. 4ii). Der Vergleich zwischen der Negativkontrolle und den Tagen 1, 4 und 7 war bei den erwachsenen Proben signifikant. Der Unterschied zwischen der Negativkontrolle und Tag 10 war nicht signifikant (p = 0,082). Daher bestätigten die qPCR-Ergebnisse die transstadiale Übertragung des transgenen A. oryzae. Die Daten zeigten eine Pilzmasse im Larvendarm am ersten Tag (69 %), die im Mitteldarm der erwachsenen Mücke am zehnten Tag auf 20 % zurückging.

Relative Quantifizierung der pyrG-Genamplifikation durch quantitative Echtzeit-PCR. (i) Larven; (ii) Mitteldärme erwachsener Mücken zu vier Zeitpunkten (Tage 1, 4, 7 und 10), Negativkontrolle (N-Kontrolle), Positivkontrolle (P-Kontrolle) (p < 0,05). Die Daten wurden aus drei Replikaten gepoolt. Das erwartete ∆∆CT-Verhältnis = 1, wenn das pyrG-Gen exprimiert wird.

Wir verwendeten Western Blot, um die Expression und Sekretion des Fusionsproteins (GFP) durch rekombinante Pilze zu validieren. Die GFP-Spiegel zu zwei Zeitpunkten, die bei Larven und Erwachsenen untersucht wurden, sind in Abb. 5 dargestellt. Alle Proben zeigten das Vorhandensein von sekretiertem GFP.

Western-Blot-Analyse der Proteinsekretion. Aliquote gleicher Proteinkonzentration wurden mittels Western Blot unter Verwendung des monoklonalen GFP-Antikörpers analysiert. A. oryzae-R wurde in An inokuliert. stephensi L1-Larven über Wasser für 24 Stunden, mit Ausnahme der Negativkontrolle, die mit Wildtyp A. oryzae (NC) inokuliert wurde. Der konzentrierte Überstand von A. oryzae-R diente als Positivkontrolle (PC), am ersten und zehnten Tag im Larvenstadium und am ersten und zehnten Tag im Erwachsenenstadium. Dargestellt sind die Banden für die gespaltenen Formen von GFP (28 kDa).

Um das Vorhandensein einer lebensfähigen A. oryzae-R-Besiedlung von Larven und geschlüpften Erwachsenen zu bestimmen, wurden Mitteldarmhomogenate auf CD/Kanamycin-Ampicillin-Agarplatten ausplattiert (Abb. 6i) und anschließend auf fluoreszierende Kolonien überprüft. Es wurde erwartet, dass einige Kolonien auf den CD-Agarplatten die transgene Pilzpopulation repräsentieren, die sowohl mit den Larven als auch mit dem Mitteldarm erwachsener Mücken assoziiert ist. Die Isolate wurden nach der Inkubation durch konfokale Mikroskopie sichtbar gemacht (Abb. 6ii). Die Ergebnisse der konfokalen Mikroskopie zeigten in allen Proben in beiden Stadien eine GFP-Expression, ein Beweis für die Fähigkeit des Pilzes, sich in An transstadial zu übertragen. Stephensi-Mücken. Diese Tests liefern grundlegende Informationen über die Anpassung dieser Pilze an die Darmumgebung von Larven und erwachsenen Mücken.

Die Isolate mit GFP-Expression wurden durch konfokale Mikroskopie sichtbar gemacht. A. oryzae-R wurde in An eingeführt. Stephensi erstes Stadium. Die Larve und der Mitteldarm der erwachsenen Mücke wurden auf CD-Agarplatten geimpft, die getrennt Ampicillin und Kanamycin enthielten. (i) Tag 1 (a) und 10 (b) im Larvenstadium, c und d Tag 1 und 10 im Erwachsenenstadium. A. oryzae-R, isoliert aus den Larven und dem Mitteldarm der erwachsenen Mücke (ii), (a, b) am ersten Tag und im Zehntel des Larvenstadiums, (c, d) am ersten Tag und im Zehntel des Erwachsenenstadiums. Maßstabsleiste, 100 mm. (Die Experimente wurden dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt).

Als nächstes wollten wir jegliche Auswirkungen rekombinanter Pilze selbst auf die Lebensfähigkeit oder Entwicklung der Mücken ausschließen und den Erfolg der Paratransgenese-Strategie mit minimalen Fitnesskosten zum Überleben im Darm von Larven und erwachsenen Mücken in einem Konkurrenzumfeld gewährleisten. Zwei Tage alte Larven von An. stephensi (L1) wurden getrennt mit den Wildtypen A. oryzae und A. oryzae-R inokuliert. Als Negativkontrollgruppe wurde eine Untergruppe Aspergillus-freier Mücken auf mögliche Kontamination getestet. Das Überleben von Larven und erwachsenen Mücken, die A. oryzae tragen oder nicht, wurde verglichen (Abb. 7i, ii). Es gab keinen signifikanten Unterschied in der Überlebensrate zwischen den Gruppen im Larven- und Erwachsenenstadium, was ein Hinweis darauf ist, dass die Pilzinfektion keinen Einfluss auf die Larven und die Entwicklungsgeschwindigkeit der Mücke hatte.

Einfluss von A. oryzae-R auf das Überleben von Larven und erwachsenen Mücken. (i) Überlebensraten von An. Stephensi-Larven nach der Fütterung mit A. oryzae (ii) Überlebensraten gemischter männlicher und weiblicher An. Stephensi erwachsene Mücken nach dem Schlüpfen. Unterschiede in den Überlebensraten von Larven und erwachsenen Mücken zwischen der mit A. oryzae gefütterten und der negativen Kontrollgruppe wurden mithilfe der Cox-Regression (Cox, 1972) (p < 0,05) in der R-Softwareversion 4.0.3 analysiert. Die Cox-Regression verglich das Überleben der verschiedenen Gruppen und ergab nicht signifikante Unterschiede in der Gesamtüberlebensrate sowohl im Larven- als auch im Erwachsenenstadium. Das Larven- und Erwachsenenüberleben unterschied sich nicht signifikant zwischen der mit A. oryzae gefütterten und der negativen Kontrollgruppe (Larven: Logrank-Test, Res-Cox, df = 1, p = 0,8) und (Erwachsene: Logrank-Test, Res-Cox, df =). 1, p = 0,3). Die Daten stammen von drei biologischen Replikaten mit 50 Mücken pro Gruppe.

Um jegliche Auswirkungen transgener A. oryzae auf die Fruchtbarkeit oder Fruchtbarkeit der Mücken auszuschließen, wurde die Bluternährung von Mücken verglichen, die mit oder ohne A. oryzae (rekombinant und Wildtyp) inkubiert wurden. In beiden Gruppen gab es keinen Einfluss auf das Blutfütterungsverhalten (Abb. 8). Im Durchschnitt betrug der Blutfütterungserfolg 89,3, 90 bzw. 90 % für die mit A. oryzae infizierten (rekombinanten und Wildtyp) und nicht infizierten Mückengruppen. Alle Weibchen wurden erfolgreich gefüttert, ohne Unterbrechungen oder Teilfütterungen. Es gab keine Hinweise auf eine verringerte Blutaufnahme bei mit Aspergillus infizierten oder nicht infizierten Mücken. Mit oder ohne A. oryzae inkubierte Mücken wurden mit Blut gefüttert und die Anzahl der pro Weibchen gelegten Eier (Fruchtbarkeit) sowie der Prozentsatz der geschlüpften Eier (Fruchtbarkeit) wurden bewertet. Die Anzahl der von der Negativkontrollgruppe, die nicht mit den Pilzen inkubiert wurde, gelegten Eier war im Durchschnitt ähnlich der Anzahl der von den mit Pilzen gefütterten Mücken (rekombinante Pilze und Wildtyp) gelegten Eier. Der Mittelwert der von Kontrollmücken gelegten Eier betrug 86,4 pro Weibchen, während dieser Wert bei mit A. oryzae inkubierten Mücken bei 85,6 (Wildtyp) und 84,7 (A. oryzae-R) Eiern pro Weibchen lag. Es gab keinen signifikanten Unterschied in der Fruchtbarkeit weiblicher Mücken zwischen den drei Gruppen (p = 0,98) (Abb. 9i). Die Fruchtbarkeit von Mücken, die A. oryzae beherbergten, und der Kontrollgruppe unterschied sich nicht signifikant (p = 0,72) (Abb. 9ii). Der durchschnittliche Prozentsatz lebensfähiger Eier, die von A. oryzae bebrütet wurden, betrug 75,3 % (Wildtyp) und 73,5 % (A. oryzae-R), wohingegen der Prozentsatz lebensfähiger Eier, die von Kontrollweibchen gelegt wurden, in ihrem ersten gonotrophen Zyklus 75 % betrug. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Fütterung von transgenen A. oryzae an An. Stephensi-Mücken verändern ihre Biologie im Allgemeinen nicht und machen ihre Verwendung als Träger von Molekülen zur Bekämpfung von Krankheitserregern zu einer praktikablen Lösung.

Wirkung von rekombinantem A. oryzae auf das Blutfütterungsverhalten erwachsener Mücken. Rekombinanter A. oryzae hat keinen Einfluss auf das Blutfütterungsverhalten von Mücken. Prozentangaben sind Mittelwerte von drei biologischen Replikaten mit jeweils 50 Mücken (Mittelwert ± SEM). Es gibt keinen signifikanten Unterschied zwischen den Gruppen, die mit A. oryzae-Infizierten (rekombinant und Wildtyp) behandelt wurden, und der Negativkontrolle (zum Testen der Signifikanz wurde der Mehrfachvergleichstest von Tukey verwendet).

Einfluss von Antimalaria-Effektoren, die aus rekombinantem A. oryzae exprimiert werden, auf die Fruchtbarkeit und Fruchtbarkeit von Mücken. (i) Anzahl der pro Weibchen produzierten Eier (Mittelwert ± SEM). Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen den Gruppen. (ii) Prozentsatz der geschlüpften Eier (Mittelwert ± SEM). Die Daten innerhalb der Behandlungen wurden mithilfe des Kruskal-Wallis-Tests verglichen und basierend auf dem Fehlen signifikanter Unterschiede aus drei unabhängigen Experimenten zusammengefasst. Vergleiche zwischen den Proben wurden dann mit dem Kruskal-Wallis-Test analysiert, und statistische Vergleiche der Anzahl der pro Weibchen produzierten Eier und der Anzahl der ausgebrüteten Eier mit denen der Negativkontrollen wurden separat mit dem Mann-Whitney-Test analysiert.

Um festzustellen, ob der rekombinante A. oryzae die Entwicklung von Oozysten im Mitteldarm wirksam beeinträchtigt, wurden Mücken, die rekombinante Pilze trugen, mit Mäusen gefüttert, die mit P. berghei infiziert waren, woraufhin die Anzahl der Oozysten am Tag 10–12 nach der Infektion bestimmt wurde (Abb. 10). Im Vergleich zu den Kontrollgruppen blockierte die Einführung von A. oryzae-R die Oozystenentwicklung dramatisch (79,6–88,5 %), was mit den Beobachtungen von Pumpuni et al. übereinstimmt. und Yoshida et al.48,49. Der rekombinante A. oryzae, der MP2 exprimierte, hatte die niedrigste Infektionsrate (83 %) und eine deutlich geringere mittlere Oozystenintensität (19,2 Oozysten/Mitteldarm). Eine gleiche Mischung von Pilzen, die EPIP exprimierten, reduzierte die mittlere Oozystenintensität um 79,6 % (23 Oozysten/Mitteldarm), wohingegen eine Mischung von Pilzen, die MP2 + EPIP exprimierten, die mittlere Oozystenintensität um 88,5 % (13,5 Oozysten/Mitteldarm) reduzierte (Abb. 10). relativ hohe Infektionsraten.

Hemmung der P. berghei-Infektion von An. stephensi durch rekombinantes A. oryzae, das so modifiziert wurde, dass es Anti-Plasmodium-Effektormoleküle (EPIP und MP2) sezerniert. (i) Kreise stellen die Anzahl der Oozysten pro einzelnem Mitteldarm dar, und die horizontalen Linien zeigen den Median der Oozysten pro Mitteldarm (ebenfalls in der Tabelle aufgeführt). Die Daten innerhalb der Behandlungen aus drei biologischen Replikaten unterschieden sich nicht signifikant (Kruskal-Wallis-Test) und wurden anschließend zusammengefasst. Vergleiche zwischen Behandlungen für die gepoolten Daten wurden auch mit dem Kruskal-Wallis-Test analysiert, die Mediane wurden mit dem Dunn-Test verglichen und statistische Vergleiche der Oozystenzahlen mit denen der Negativkontrollen wurden mit dem Mann-Whitney-Test analysiert. Ein Wert von p < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. (ii) Zusammenfassende Daten aus (i) N, Anzahl der analysierten Mücken; Median, mittlere Anzahl an Oozysten pro Mitteldarm; Mittlere, mittlere Anzahl an Oozysten pro Mitteldarm; Hemmung %, prozentuale Hemmung der Oozystenbildung im Vergleich zur Kontrolle ohne Pilze. (iii) GFP-exprimierende P. berghei-Oozysten 10 Tage nach der Infektion der Mücken. Die Anzahl der Oozysten im Mitteldarm wurde mikroskopisch (40-fach Objektiv) gezählt. (a) Negativkontrolle (keine Pilze), (b) Wildtyp A. oryzae, (c) A. oryzae-RE, (d) A. oryzae-RM, (e, f) A. oryzae-RE + A . oryzae-RM (Pfeile zeigen auf die Oozysten).

Der erste Schritt zur Paratransgenese bei der Bekämpfung von Malaria oder anderen durch Vektoren übertragenen Krankheiten ist die Identifizierung eines anpassungsfähigen Symbionten. Es handelt sich um einen komplexen Prozess und es sollten geeignete Studien durchgeführt werden, um die Beziehung zwischen Vektoren und ihrer Mikrobiota zu verstehen22,26. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Larven von An. stephensi kann A. oryzae-R aus dem Wasser gewinnen, in dem sie aufgezogen werden. Am Tag nach der Beimpfung des Wassers mit Pilzsporen wurden rekombinante Pilze in großer Zahl aus dem Larvendarm isoliert. Die Daten stimmen mit denen von Lindh et al.50 überein, die die Möglichkeit nahelegten, transgene Mikroorganismen über Brutstätten und Zuckerköder in eine Mückenpopulation im Feld einzuführen. Es könnte einfacher und praktischer sein, gentechnisch veränderte Mikroorganismen in Larvenstadien einzuführen als in erwachsene Mückenpopulationen. Die Larvenstadien von Mücken entwickeln sich im Wasser und ernähren sich von organischem Material wie Mikroorganismen und Partikeln aus ihrer Umgebung, sodass alle Mikroorganismen im Wasser von den Larven aufgenommen werden können51,52,53,54. Dieses Verhalten macht es relativ einfacher, Larven den Zielmikroorganismen auszusetzen. Folglich beherbergen die Larven eine vielfältige und veränderliche mikrobielle Gemeinschaft53,55,56, von denen jede als gültige Ziele für die Paratransgenese angesehen werden könnte.

Die hier vorgestellten experimentellen Ergebnisse zeigen das Besiedlungsmuster und die transstadiale Übertragung von A. oryzae-R von den Larven auf die erwachsenen Mücken von An. Stephensi. In verschiedenen Gruppen von Mücken umfasst die transstadiale Übertragung von Mikroorganismen vom Larven- zum Erwachsenenstadium Bakterien bei Anopheles-Mücken26,53,57,58,59,60,61,62,63,64 und das Dengue-Virus bei Aedes aegypti65. La-Crosse-Virus bei Ochlerotatus triseriatus66, Rift-Valley-Fieber-Virus bei Culex pipiens und Ae. Circumluteolus67, Francisella tularensis-Bakterien in Ae. sticticus, Ae. vexans und Ae. punctor68 und CuLCrVvirus in Bemisia tabaci69. In der vorliegenden Untersuchung nahm die Zahl der im Larvendarm lokalisierten transgenen A. oryzae vom Larven- zum Erwachsenenstadium ab. Allerdings blieben sie im Mitteldarm der erwachsenen Mücken mindestens zehn Tage nach dem Schlüpfen auf einem relativ konstanten Niveau. Entgegen der Annahme, dass eine Darmsterilisierung während der Metamorphose von der Puppe zum Erwachsenen erfolgt, gibt es einige Studien, in denen eine transstadiale Übertragung von der Puppe zum Erwachsenen erwähnt wird48,58,70. Unsere Beobachtungen deuten darauf hin, dass die Mikrobiota-Beseitigung nicht vollständig ist und einige der Darmmikroben der Larven im Mitteldarm der erwachsenen Mücke zurückbleiben61,71,72. Einige Bakterien wie Pantoea Stewartii, Stenotrophomonas maltophilia, Sphingobacterium multivorum und Chryseobacterium meningosepticum blieben vor und nach der Metamorphose im Mitteldarm und wurden daher nicht vollständig ausgeschieden17,73. Die 10-tägige Persistenz von A. oryzae –R im Mitteldarm von Erwachsenen in der aktuellen Studie steht im Gegensatz zu Rhiele et al.74, die herausfanden, dass E. coli vollständig aus dem Mitteldarm von An eliminiert wurde. Stephensi nach nur 96 Stunden. A. oryzae-R und E. coli75 sind sehr unterschiedliche Organismen, aber möglicherweise könnten andere Symbiontenfaktoren, einschließlich der unterschiedlichen Immunantworten der Mücken gegen Bakterien und Pilze75,76, zu den Unterschieden zwischen den beiden Studien beitragen. Der Großteil der Mitteldarmbakterien im Mitteldarm der Mückenlarve wird nicht auf die erwachsene Mücke übertragen47, sondern während der Metamorphose entfernt, obwohl es einige Ausnahmen gibt: Serratia odorifera bleibt möglicherweise in Larven erhalten und wird trotz hoher Umgebungstemperaturen transstadial auf erwachsene Mücken übertragen starke proteolytische und hämolytische Eigenschaften im Ae. aegypti Mitteldarm65.

Unseren Ergebnissen zufolge könnte A. oryzae daher einen gewissen Wachstumsvorteil bei Anopheles-Larven und dem erwachsenen Mitteldarm haben. Dieser Pilz hat einen breiten pH-Toleranzbereich von pH 3 bis pH 11 (Daten nicht gezeigt). Ebenso liegt der pH-Wert im Larvendarm zwischen 7,4 und 9 oder höher77,78, und im erwachsenen Darm beträgt der pH-Wert 7,4–7,877,79,80. Da sich A. oryzae-R im Mitteldarm der Larve ansiedeln und überleben kann und durch Metamorphose auf den Mitteldarm des Erwachsenen übertragen wird, ist diese pH-Toleranz von A. oryzae ein potenzieller Faktor, der seine Nachhaltigkeit während des gesamten Lebenszyklus der Mücke erklärt. Eine andere Möglichkeit besteht darin, dass A. oryzae möglicherweise resistenter gegen Immunreaktionen von Mücken ist, die in beiden Stadien ausgelöst werden können. Beide Möglichkeiten sind interessant für die weitere Erforschung der Auswahl von Organismen zur Verfeinerung von Paratransgenese-Studien und -Anwendungen.

A. oryzae wurde verwendet, um zwei wirksame Anti-Plasmodium-Effektormoleküle, MP2 und EPIP, zu bewerten. Die Expression und Sekretion jedes Fusionsproteins durch die rekombinanten Stämme wurde durch konfokale Mikroskopie verifiziert und die funktionelle Expression wurde durch Messung der Hemmung der Oozystenbildung im Mitteldarm der Mücke gezeigt. Beide Moleküle hemmten Malariainfektionen deutlich. stephensi im Oozystenstadium. A. oryzae, der MP2 exprimierte, war wirksamer als der Stamm, der EPIP exprimierte, und reduzierte die Oozystenintensität von P. berghei um 83 % im Vergleich zu 79,6 %. Unsere ersten Experimente zeigten, dass das Mischen der beiden Stämme, die MP2 und EPIP exprimieren, die Oozystendichte auf 11,5 % reduzierte, was größer war als die Reduzierung, die durch MP2 oder EPIP allein erreicht wurde. In einigen Experimenten erzeugten Mücken, die mit Blut gefüttert wurden, das eine hohe Anzahl an P. berghei-Gametozyten enthielt, eine hohe Oozystenintensität (Mittelwert > 200 Oozysten), aber selbst unter diesen Bedingungen war die Hemmung der Parasitenentwicklung hochsignifikant und konsistent.

In einer früheren Studie hemmten Anti-Plasmodium-Effektormoleküle, die von rekombinantem Pantoea agglomerans, einem bakteriellen Symbionten der Mücke, abgesondert wurden, die Oozystenbildung während der Malariaparasitenentwicklung bei mehreren Anopheles-Arten30. Die hier untersuchten transgenen Pilze haben gegenüber diesen früheren Studien einige Vorteile. Sie gelten in der Lebensmittelindustrie als sicher und gelten daher als ungefährlich für Mensch und Tier. A. oryzae ist ein wirksames Labormodell für Paratransgenesestudien zur Bewertung verschiedener Effektorpeptide/-proteine ​​als Antiparasitenwirkstoffe. Mehrere Aspekte unserer Ergebnisse stützen diese Behauptung; Erstens lässt das Lokalisierungsmuster darauf schließen, dass A. oryzae im Mitteldarm lokalisiert ist, einem wichtigen Ort der Parasitenentwicklung. Zweitens wird A. oryzae von Larven auf erwachsene Mücken übertragen, wobei ihre Lebensfähigkeit und Fähigkeit zur Sekretion von Antiparasiten-Effektormolekülen erhalten bleibt17,37. Unseren Ergebnissen zufolge ist A. oryzae möglicherweise besser an die Umgebung des Mitteldarms angepasst als andere Erreger wie Mückenbakterien. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit Vorschlägen zur Auswahl von Paratransgenese-Organismen, die mit der Mitteldarmumgebung kompatibel sind81. Drittens zeigt A. oryzae eine stabile Assoziation mit Larven und erwachsenen Mücken, was sich an der Anwesenheit in allen Stadien von An zeigt. Stephensi durch Analyse mit vier verschiedenen Methoden. Viertens zeigen Besiedlungsexperimente, dass modifizierte A. oryzae, die von Larven durch Verzehr erworben wurden, in der Lage sind, den Darm aller inokulierten Larven zu besiedeln. Fünftens ist die genetische Veränderung von im Labor gezüchteten Pilzen einfacher als paratransgene Wirkstoffe wie Mitteldarmbakterien von Mücken und wurde bereits zur Bekämpfung anderer Vektoren eingesetzt13.

Pilze sind ein praktikables und leistungsstarkes Modell für die Bewertung und Bereitstellung von Proteinen, die die Übertragung blockieren, und könnten zur Expression mehrerer Transgene mit unterschiedlichen Wirkmechanismen verwendet werden, um die Wahrscheinlichkeit einer Resistenzentwicklung zu verringern. Dementsprechend können zahlreiche Effektorpeptide oder -proteine ​​in A. oryzae eingebaut werden, und die Sammlung von Effektorgenen kann modifiziert werden, um die Wirksamkeit bei der Bekämpfung von Malaria oder anderen durch Vektoren übertragenen Krankheiten zu maximieren. Wir kommen zu dem Schluss, dass die transstadiale Übertragung von transgenen A. oryzae vom Larven- zum Erwachsenenstadium von An erfolgt. Stephensi. Daher könnte es bei einem paratransgenen Ansatz möglich sein, die transgenen Pilze an Brutstätten zu verbreiten, an denen Mückenlarven den Pilzsporen ausgesetzt sein können. Rekombinantes A. oryzae, modifiziert mit zwei verschiedenen Peptiden (MP2 und EPIP), hemmt die Oozystenbildung von P. berghei im Mitteldarm von erwachsenen An. stephensi und könnten als Träger zusätzlicher Effektormoleküle verwendet werden, die als Antiparasitenmittel wirken können. Wichtig ist, dass die Paratransgenese mit aktuellen Werkzeugen zur Mückenbekämpfung und sogar mit gentechnisch veränderten Mücken kompatibel ist.

A. oryzae, die natürlicherweise im Boden und in der Umwelt vorkommen, könnten in integrierten Ansätzen zur Vektorbekämpfung eingesetzt werden, und diese Methode erweist sich als umweltfreundlicher Ansatz zur Bekämpfung von Larven in den natürlichen Lebensräumen selbst. Pilzbiopestizide sind in einer Reihe afrikanischer Länder bereits für den landwirtschaftlichen Einsatz zugelassen, ebenso wie chemische Insektizide82. Das enge Wirtsspektrum der transgenen Pilze begrenzt die potenzielle Gefahr für Nichtzielinsekten. Bei Anopheles-Larven in einem aquatischen Lebensraum wären Auswirkungen auf nützliche Insekten wie Bienen unwahrscheinlich. Es liegen nur begrenzte Daten zu den Auswirkungen von Biopestiziden auf Nichtzielarten in Mückenbrutstätten vor. Extrakte von Aspergillus terreus beeinflussten das Schwimmverhalten von Artemia, diese Extrakte waren jedoch neurotoxisch für Mücken und Artemia ist nicht sympatrisch mit Mückenlarven83. In ähnlicher Weise wirkten sich Extrakte von Asperillus flavus auf die Raubmücke Toxorhynchites splendens aus, jedoch in höheren Konzentrationen als auf das Ziel, Ae. aegypti84. Studien zu den Auswirkungen lebender entomopathogener Pilze unter Wasserbedingungen sind begrenzt, was eine große Lücke in diesem Forschungsgebiet darstellt, aber die Kombination von Pilzen und Raubmücken könnte zu einem besseren Bekämpfungsergebnis führen85. Angesichts der Vielfalt und Kurzlebigkeit der Anopheles-Brutstätten wäre die Charakterisierung der Mehrzahl der Brutstätten in einem Kontrollprogramm unnötig und auch unpraktisch86, sodass bei allen Biopestizid-Ansätzen die Wirksamkeit unter verschiedenen Umweltbedingungen berücksichtigt werden muss. Während die Ergebnisse einer einzelnen Fallstudie mit angemessener Vorsicht behandelt werden sollten, um eine Überinterpretation zu vermeiden, glauben wir, dass wir gezeigt haben, dass experimentelle Studien zur Rolle von Pilzen in natürlichen Insektengemeinschaften machbar sind und das Potenzial haben, vielversprechende Erkenntnisse zu liefern.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel und seinen ergänzenden Informationsdateien enthalten.

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Diese Forschung wurde vom 1001-TÜBİTAK-Programm zur Unterstützung wissenschaftlicher und technologischer Forschungsprojekte, Fördernummer 218S724, finanziert. Die APC wurde vom türkischen Rat für wissenschaftliche und technologische Forschung und dem wissenschaftlichen Forschungsprojekt (BAP) der Bezmialem Vakıf-Universität finanziert (Projektnummer: 20211004).

Beykoz-Institut für Biowissenschaften und Biotechnologie, Bezmialem-Vakif-Universität, 34820, Istanbul, Türkei

Leila Kianifard, Ab. Matteen Rafiqi, Osman Akcakir, Ahmed SI Aly und Serdar Uysal

School of Science and Engineering, Al Akhawayn University, Ifrane, 53000, Marokko

Ahmed SI Aly

Sanaria Inc., 9800 Medical Center Dr., Suite A209, Rockville, MD, 20850, USA

Peter F. Billingsley

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OA und SU hatten die ursprüngliche Idee und AA entwickelte die Theorie. LK und AMR führten das Experiment durch. LK führte die Berechnungen durch und AMR und PFB überprüften die Analysemethoden. LK, AMR, SU, AA und PFB trugen zur Interpretation der Ergebnisse bei. LK, AMR und PFB führten die analytischen Berechnungen durch. LK schrieb das Manuskript mit Unterstützung von OA und PFBAA und AMR half bei der Überwachung des Projekts. Alle Autoren gaben kritisches Feedback und halfen bei der Gestaltung der Recherche, Analyse und des Manuskripts.

Korrespondenz mit Serdar Uysal.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Eingegangen: 13. Februar 2023

Angenommen: 12. Juli 2023

Veröffentlicht: 27. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-38654-0

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