Kontaminations- und verschleppungsfreie Handhabung komplexer Flüssigkeiten mit Schmiermitteln

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 14486 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Die Kreuzkontamination biologischer Proben während der Handhabung und Vorbereitung ist ein großes Problem in Laboreinrichtungen und führt zu falsch-positiven oder falsch-negativen Ergebnissen. Probenverschleppungsrückstände in Pipettenspitzen tragen wesentlich zu diesem Problem bei. Die meisten Pipettenspitzen auf dem Markt werden aus hydrophoben Polymeren hergestellt, die Flüssigkeiten mit hoher Oberflächenspannung abstoßen können. Bei Flüssigkeiten mit niedriger Oberflächenspannung und viskosen Flüssigkeiten mangelt es ihnen jedoch an Leistung. Darüber hinaus kann die Hydrophobie von Pipettenspitzen zu einer hydrophoben Adsorption von Biomolekülen führen, was zu Ungenauigkeiten und Präzisionsverlusten beim Pipettieren führt. Hier schlagen wir den Einsatz der Lubricant-Infused-Surface-Technologie (LIS) vor, um omniphobe Eigenschaften in Pipettenspitzen zu erzielen. Mithilfe eines vielseitigen und einfachen Designs wurde das Innenlumen kommerziell erhältlicher Pipettenspitzen mittels chemischer Gasphasenabscheidung (CVD) mit einer Schicht aus Fluorsilan (FS) beschichtet. Das Vorhandensein von FS-Gruppen auf den Spitzen wird durch Tests mit Röntgenphotoelektronenspektroskopie (XPS) und Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (FTIR) bestätigt. Nach der Schmierung der Spitzen mit einem fluorierten Schmiermittel verstärkten sich die Omniphobie und das abweisende Verhalten der Spitzen drastisch, was durch statische und Hysterese-Kontaktwinkelmessungen aufgedeckt wurde. Die Abstoßung der mit Gleitmittel infundierten Pipettenspitzen gegen physikalische Adsorption wird durch Pipettieren eines Lebensmittelfarbstoffs sowie menschlicher Blutproben untersucht und mit den unbehandelten Spitzen verglichen. Die Ergebnisse zeigen deutlich weniger Verschleppungsrückstände, wenn die mit Gleitmittel angereicherten Spitzen im Vergleich zu im Handel erhältlichen Spitzen verwendet werden. Wir zeigen auch, dass die mit Gleitmittel angereicherten Spitzen die Bakterienkontamination des Innenlumens nach dem Auf- und Abpipettieren der Bakterienlösung um 3 bis 6 log (über 99 %, abhängig von der Spitzengröße) reduzieren.

Flüssigkeitsverschleppungen in Liquid-Handling-Geräten können zu Versuchsfehlschlägen, Messungenauigkeiten und Probenverlusten führen. Es ist die Hauptursache für Kreuzkontaminationen bei allgemeinen wissenschaftlichen Verfahren wie bakteriologischen Arbeiten, Polymerasekettenreaktion (PCR) und Radioimmunoassays1,2,3,4. Beispielsweise könnten bei PCR-Amplifikationsreaktionen in einem forensischen Kriminallabor kleine Mengen an DNA-Kontamination dazu führen, dass die DNA amplifiziert wird, was zu falsch positiven Identifizierungen führt5. In solchen Fällen könnte eine zugrunde liegende Kontaminationsursache das Pipettieren von Substanzen mit hoher Viskosität und geringer Oberflächenspannung sein, die an der Kunststoffoberfläche der Pipette haften bleiben und zu einem fehlerhaften Auswurf auf die nächste Testprobe führen können6,7,8. Darüber hinaus kann eine Verschleppungskontamination beim Pipettieren zu fehlerhaften Volumenbestimmungen, der Notwendigkeit, Spitzen zu wechseln, einem CO2-Fußabdruck und Kosten im Zusammenhang mit der Entsorgung von Einwegspitzen führen. Um den Effekt der Verschleppung wesentlich zu minimieren, benötigen Laborarbeitsbereiche separate Sätze an Verbrauchsmaterialien und Geräten, wie z. B. Pipetten, Reagenzglashalter und Zentrifugen9,10,11. Einwegspitzen mit Filtern werden in der Regel als Hauptstrategie zur Verhinderung von Kontaminationen durch Amplikons empfohlen, die sich in der Pipette ansammeln10,12,13,14. Allerdings sind Einwegspitzen nicht auf automatisierte Roboterarbeitsplätze anwendbar, bei denen feste Spitzen verwendet werden15. Derzeit wurden Techniken zur Verhinderung von Kreuzkontaminationen eingeführt, indem der Abstand zwischen den Vertiefungen vergrößert und unbeabsichtigte Z-Achsen-Bewegungen des Robotergreifers während des Plattentransfers verhindert werden10,16. Darüber hinaus legt die aktuelle Literatur nahe, dass feste Spitzen, die mit gründlichen Waschroutinen behandelt werden, als praktikable und wirksame Alternative zu Einwegspitzen dienen können16. Das Problem der Verschleppungskontamination kann auf andere Formen von Laborgeräten ausgeweitet werden, beispielsweise auf Spritzen und Nadeln, die bei der Entfernung von PCR-Produkten am Roboterarm automatisierter Amplifikationssysteme verwendet werden17. Eine mögliche Lösung wären Oberflächenmodifikationen an Laborgeräten, insbesondere Pipettenspitzen, so dass das Problem der Probenverschleppung minimiert werden kann.

Die meisten Pipettenspitzen auf dem Markt werden aus hydrophoben Polymeren hergestellt, die Flüssigkeiten mit hoher Oberflächenspannung wie Wasser abstoßen. Aufgrund seiner Hydrophobie, Kosteneffizienz und Verfügbarkeit ist Polypropylen eines der am häufigsten zum Formen von Pipettenspitzen verwendeten Polymere. Während hydrophobe und superhydrophobe Oberflächen nützlich sind, um Flüssigkeiten mit hoher Oberflächenspannung abzustoßen, mangelt es ihnen an Leistung, wenn Flüssigkeiten mit niedriger Oberflächenspannung oder hoher Viskosität verwendet werden. Auch die hydrophobe Adsorption von Biomolekülen an den Spitzen kann zu Ungenauigkeiten und Probenverlust beim Pipettieren führen18.

Um dieses Problem zu lösen, muss die Oberfläche der Spitze omniphob gemacht werden, um verschiedene Arten von Flüssigkeiten und Bioflüssigkeiten trotz ihrer Stärke der Kohäsionskraft abzustoßen19,20,21. Eine geringe dynamische Winkelhysterese und ein geringer Gleitwinkel sind im Allgemeinen charakteristisch für omniphobe Oberflächen22,23,24,25,26. Omniphobe Oberflächen können mit zwei allgemeinen Techniken hergestellt werden: physikalischen und chemischen Modifikationen19,27,28,29,30,31,32,33. Zur physikalischen Modifikation gehört das Aufrauen der Oberfläche mithilfe von Methoden wie Nanopartikelabscheidung, lithografischem Aufdrucken und Ätzen34,35,36. Die chemische Modifikation beruht auf der Verringerung der freien Energie der interessierenden Oberfläche1,19,20,37,38,39,40,41. Es sind mehrere Techniken zur Oberflächenmodifizierung bekannt, die auf der Veränderung der Oberflächenchemie beruhen. Zu den am weitesten verbreiteten gehört die Verwendung von Fluorkohlenstoffverbindungen oder Organosilanen als Oberflächenbeschichtungen21,34,42,43,44.

Die wachsende Nachfrage nach Pipettenspitzen mit minimaler Haftung an der Probenoberfläche hat zur Entwicklung von Pipettenspitzen mit geringer Retention geführt. Pipettenspitzen mit geringer Retention weisen omniphobe Oberflächeneigenschaften auf, was zu einem minimalen Probenverlust führt. Ein Beispiel hierfür ist der Einsatz einzigartiger Formverfahren, um Fluorpolymermoleküle in die Oberfläche der Pipettenspitzen einzubauen und so hydrophobe Eigenschaften zu erzielen45. Das Texturieren der Pipettenspitzen ist eine weitere von Forschern verwendete Technik, um die Pipettenspitzen hydrophob zu beschichten46,47. Diese Methoden weisen jedoch im Vergleich zur Oberflächenbeschichtung negative Aspekte auf, wie z. B. eine erhöhte Herstellungskomplexität, hohe Kosten und eine geringere Wirksamkeit.

Hier schlagen wir einen einfachen und kostengünstigen Prozess vor, der die Fluorsilanisierung von Pipettenspitzen mittels chemischer Gasphasenabscheidung (CVD) und anschließende Schmierung umfasst, um mit Schmiermittel angereicherte Spitzen mit omniphoben Eigenschaften zu erzeugen. Die Fluorsilanschicht (FS) und die Omniphobie der mit Schmiermittel infundierten Spitzen wurden mittels Röntgenphotoelektronenspektroskopie (XPS), Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (FTIR) sowie statischen und Hysterese-Kontaktwinkelmessungen charakterisiert. Die Wirksamkeit der modifizierten Spitzen bei der Verhinderung von Verschleppungsrückständen wird durch Pipettieren verschiedener Lösungen wie Lebensmittelfarbstoff, menschliches rekalzifiziertes Blut und Bakterienlösungen demonstriert.

Trichlor (1H, 1H, 2H, 2H-Perfluoroctyl) Silan (TPFS), Perfluorperhydrophenanthren (PFPP), tryptische Sojabrühe (TSB) (Sigma, Oakville, Kanada), Pipettenspitzen aus Polypropylen (Diamed Lab Supplies Inc., Mississauga, Kanada), roter Lebensmittelfarbstoff (ein Qualitätsprodukt von Preema, Inhaltsstoffe: Natriumchlorid und E122 Carmosin) und Tween 20 (Sigma, Oakville, Kanada) wurden wie erhalten verwendet. Citratiertes menschliches Blut wurde aus Blutproben gesunder Spender gewonnen. Alle Verfahren wurden vom Forschungsethikausschuss der McMaster University genehmigt. Alle Methoden wurden in Übereinstimmung mit den relevanten Richtlinien und Vorschriften durchgeführt. Von allen Spendern wurde eine Einverständniserklärung eingeholt.

Pipettenspitzen wurden in ein Spitzengestell gegeben und in einen Plasmareiniger (PE-100, Plasma Etch) gegeben. Die Spitzen wurden 2 Minuten lang bei einer Radiofrequenz (RF) von 150 kHz und 25 °C mit Sauerstoffgas plasmabehandelt. Nach der Sauerstoffplasmabehandlung wurden die Pipettenspitzen in einen Exsikkator gelegt, der an eine Vakuumpumpe angeschlossen war. 200 µL TPFS wurden auf einen Glasobjektträger auf einer separaten Petrischale gegenüber dem Pipettenspitzenständer pipettiert. Darüber hinaus wurden 100 µL TPFS auch auf einen Glasobjektträger im Inneren des Racks pipettiert (Abb. 1). Der Exsikkator wurde bei einem Druck von –0,08 MPa vakuumiert, wodurch die CVD-Behandlung eingeleitet wurde. Die Silanisierungsreaktion erfolgte über einen Zeitraum von 2,5 h bei Raumtemperatur. Nach Abschluss der CVD wurden die Pipettenspitzen über Nacht bei 60 °C wärmebehandelt. Um Gleitmittel in die fluorsilanisierten Pipettenspitzen zu infundieren, wurde das PFPP-Gleitmittel einfach hinein- und herauspipettiert. Anschließend wurden die Spitzen gründlich mit entionisiertem (DI) Wasser gewaschen, um die überschüssige Menge Gleitmittel zu entfernen, sodass eine dünne Gleitmittelschicht zurückblieb in die FS-Gruppen über Van-der-Waals-Kräfte.

Schematische Darstellung des Behandlungsverfahrens zusammen mit den chemischen Strukturen der behandelten Spitzen bei jedem Schritt der Modifikation. Pipettenspitzen wurden mit Sauerstoffplasma behandelt, gefolgt von einer CVD-Behandlung mit TPFS und einer Wärmebehandlung bei 60 °C über Nacht. Anschließend wurden die Spitzen durch Ein- und Auspipettieren von PFPP-Gleitmittel geschmiert. Die Gleitmittelschicht kann verschiedene Arten von Biomolekülen und Lösungen abstoßen, während sich bei den im Handel erhältlichen Spitzen (unbehandelten Spitzen) Biomoleküle und Reagenzien am Innenlumen der Spitzen festsetzen können, was zu Ungenauigkeiten bei Volumina und Konzentrationen führt.

FTIR (Bruker, Karlsruhe, Deutschland) wurde verwendet, um die chemische Oberflächenzusammensetzung der Pipettenspitzen vor und nach der Behandlung zu beurteilen. Bei FTIR-Messungen wurde die Luft als Hintergrund betrachtet und die anderen Spektren der fluorsilanisierten und unbehandelten Spitzenoberflächen wurden basierend auf dieser Basislinie normalisiert. Röntgenphotoelektronenspektroskopie (XPS) (PHI Quantera II, Biointerfaces Institute, McMaster University) wurde eingesetzt, um die auf den Pipettenspitzen gebildete FS-Schicht weiter sichtbar zu machen. Erwähnenswert ist, dass der XPS-Test zwei Wochen nach der Vorbereitung der Spitzen durchgeführt wurde, um die Stabilität der FS-Schicht auf den Spitzen sicherzustellen. Zur Messung der Atomkonzentrationen % von C, O, Na, Si, S und F wurde hochauflösendes XPS durchgeführt. Vor FTIR- und XPS-Analysen wurden Pipettenspitzen abgeschnitten, um die Innenfläche für die Tests freizulegen, und gründlich mit Ethanol gewaschen .

Die Kontaktwinkel des fluorsilanisierten und des unbehandelten Materials wurden unter Verwendung von 5 µL Wassertröpfchen, Tween 20 und Isopropanol gemessen. Messungen des Kontaktwinkels wasserfester Tropfen wurden bei Raumtemperatur vor und nach jedem Modifikationsschritt unter Verwendung eines Future Digital Scientific OCA20-Goniometers (Garden City, NY) durchgeführt, das vor jeder Messung kalibriert wurde. Der Hysterese-Kontaktwinkel wurde an den mit Schmiermittel infundierten Spitzen und unbehandelten Spitzen unter Verwendung der Nadelmethode durchgeführt, wobei die Nadel nahe an die Spitze gebracht und die Vorwärts- und Rückzugskontaktwinkel gemessen wurden, während der Tropfen injiziert und von der Oberfläche abgezogen wurde.

Es ist zu beachten, dass alle Charakterisierungstests am Innenlumen von 1-ml-Spitzen durchgeführt wurden, indem diese in kleine Stücke geschnitten und die Innenfläche freigelegt wurden. Für jeden Charakterisierungstest wurden 3 Wiederholungen berücksichtigt.

Die Stabilität des Gleitmittels in den Spitzen wurde durch Messen des Gewichts der Spitzen in P200-Spitzen nach dem Auf- und Abpipettieren von 200 μL Gleitmittel, Waschen zum Entfernen der überschüssigen Gleitmittelmenge sowie drei- und 20-maligem Auf- und Abpipettieren untersucht Geben Sie entionisiertes Wasser hinzu, während die Pipette auf 200 μL eingestellt war.

Bei den Farbstoffexperimenten wurden 10-fache Reihenverdünnungen des roten Farbstoffs in einer Wellplatte durchgeführt, um die Verschleppung behandelter Spitzen zu beurteilen. Die anfängliche Konzentration des Farbstoffs betrug 1 mg mL−1. Der Farbstoff wurde seriell in Wasser verdünnt, das 0,05 % Tween 20 enthielt, wobei zum Vergleich mit Gleitmittel infundierte und unbehandelte Spitzen verwendet wurden. Zum Zweck der Verschleppungsbewertung wurden die Pipettenspitzen während der Reihenverdünnungen nicht gewechselt und bei allen Verdünnungsschritten wurde die gleiche Pipettenspitze verwendet. Die Wellplatte wurde mit einem Plattenlesegerät (Tecan Infinite M1000) analysiert, um die Absorptionswerte zu ermitteln.

Die Wechselwirkung zwischen Blutbestandteilen und mit Gleitmittel infundierten Spitzen wurde mit rekalzifiziertem Blut beurteilt. Mit Citrat versetztes menschliches Blut wurde durch in HEPES verdünntes CaCl2 in einer Konzentration von 12,5 mM rekalzifiziert. Für die rasterelektronenmikroskopische (REM) Bildgebung (JSM-7000 F) wurden die Spitzen nach dem Auf- und Abpipettieren des rekalzifizierten Blutes abgeschnitten und mit 2 % Glutaraldehyd, verdünnt in PBS, fixiert. Die Spitzen wurden dann eine Stunde lang in 1 % Osmiumtetroxid in 0,1 m Natriumcacodylatpuffer inkubiert, gefolgt von einer Dehydratisierung über eine abgestufte Reihe von Ethanol und einer Trocknung am kritischen Punkt mit einem Leica EM CPD300-Trockner (Leica Mikrosysteme GmbH, Wien, Österreich) unter Verwendung von flüssigem CO2 spülen. Vor der Bildgebung wurden die Proben mit Gold zerstäubt (Polaron Model E5100 Sputter Coater, Watford, Hertfordshire). Hochauflösende REM-Bilder der Spitzen nach der Fluorsilanisierung wurden mit JEOL JSM-7000F erstellt. Die Proben wurden geschnitten und mit Kohlenstoffband und Silberpaste auf einem Träger befestigt. Anschließend wurden sie mit einem Sputtercoater (Polaron Modell E1500, Polaron Equipment Ltd., Watford, Hertfordshire) mit 10 nm Platin für REM beschichtet.

Der Bakterienwachstumstest wurde durchgeführt, indem Staphylococcus aureus USA300 JE2 (MRSA)48 aus gefrorenem Zustand auf LB-Agar ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C wachsen gelassen wurde. Die Übernachtkulturen wurden dann in tryptischer Sojabrühe (TSB), ergänzt mit 0,4 % Glucose und 3 % NaCl49, verdünnt. Anschließend wurden konzentrierte MRSA-Bakteriensuspensionen mit einer Konzentration von 107 KBE mL−1 hergestellt. Unbehandelte Spitzen wurden durch Auf- und Abpipettieren der Bakteriensuspension mit MRSA beimpft, während behandelte Spitzen zunächst geschmiert und dann vor der Beimpfung mit der Bakteriensuspension 20 Mal mit entionisiertem Wasser gewaschen wurden. Anschließend wurden die Spitzen unter Schütteln 20 Minuten lang in Röhrchen mit 5 ml TSB bei 37 °C inkubiert. Aus dieser Lösung wurden 100 μl jeder gevortexten Probe entnommen, um einen CFU-Assay durch Ausplattieren serieller Verdünnungen auf TSB-Agar-Petrischalen durchzuführen. Die statistischen Analysen wurden mittels ANOVA-Test durchgeführt.

Um die Innenfläche der Pipettenspitzen aus Polypropylen gleichmäßig mit FS-Gruppen zu beschichten, wurden die Spitzen zunächst 2 Minuten lang mit Sauerstoffplasma behandelt und anschließend 2,5 Stunden lang mit TPFS-Lösung CVD-fluorsilanisiert. Während dieses Prozesses binden hydrophile Enden (Trichlorsilan) von Fluorsilanmolekülen an die plasmainduzierten Hydroxylgruppen auf der Oberfläche der Spitzen, was zu selbstorganisierten Monoschichten (SAMs) von FS mit einer schirmförmigen Struktur führt, ähnlich wie die Fluor-Enden an der Oberfläche freigelegt (Abb. 1).

Um die Veränderungen in der chemischen Zusammensetzung der FS-behandelten Pipettenspitzen zu analysieren, wurde ein XPS-Test an der Innenfläche fluorsilanisierter und unbehandelter Pipettenspitzen durchgeführt (Abb. 2a). Die in den fluorsilanisierten Spektren auftretenden Peaks bei etwa 35 eV, 690 eV und 830 eV werden F2s-, F1s- bzw. F-KLL-Bindungen zugeordnet. Diese Peaks weisen auf die Bildung einer FS-Schicht innerhalb der Spitzen mithilfe unserer entwickelten CVD-Methode hin. Abbildung 2b zeigt die atomaren Konzentrationen der Elemente, die an der Innenoberfläche unbehandelter und fluorsilanisierter Spitzen vorhanden sind, mithilfe hochauflösender XPS. Nach der Fluorsilanisierung stieg die Konzentration von F, Si und O von 0 auf 28,3 %, 1,2 auf 4,7 % bzw. 7,7 auf 13,8. Dies verdeutlicht deutlich die Existenz von Fluorsilan-Schwanzgruppen als Folge der FS-SAM-Bildung während des CVD-Prozesses. Bemerkenswert ist, dass die atomaren Konzentrationen von C und Verunreinigungen wie Na aufgrund des Plasmaätzens der Spitzen und des Aufbrechens der chemischen Bindungen an der Oberfläche verringert wurden.

Charakterisierung der FS-behandelten Spitzen und Schmiermittelstabilität. (a) XPS-Spektren von unbehandelten Spitzen und fluorsilanisierten Spitzen. Das Auftreten von F2s-, F1s- und F KLL-Peaks ist mit der Bildung einer FS-Schicht innerhalb der Spitzen verbunden. (b) Atomkonzentrationen (%) verschiedener Elemente an der Innenoberfläche unbehandelter und fluorsilanisierter Spitzen ergaben sich aus einer hochauflösenden XPS-Analyse. (c) FTIR-Spektren unbehandelter Pipettenspitzen im Vergleich zu fluorsilanisierten Spitzen. Der eingekreiste breite Peak im Bereich von 3700–3200 cm−1 weist auf das Vorhandensein von Si-OH-Bindungen hin. (d) Gleitmittelgewicht in den Spitzen nach dem Gleiten, nach dem Abwaschen der überschüssigen Gleitmittelmenge und nach 3- und 20-maligem Pipettieren von DI-Wasser. Die Menge an Gleitmittel in den Spitzen blieb nach mehrmaligem Pipettieren unverändert. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SD dargestellt

Wir haben auch einen FTIR-Test durchgeführt, um die Bildung einer FS-Schicht innerhalb der Spitzen weiter zu bestätigen (Abb. 2c). Die Spektren sowohl der fluorsilanisierten als auch der unbehandelten Spitzen zeigten eine Reihe von Peaks in der Absorptionsbande zwischen 800 und 1200 cm–1, insbesondere bei Schwingungen von 850 cm–1, 1000 cm–1 und 1200 cm–1, die charakteristische Peaks für isotaktisches Polypropylen sind . Diese Absorptionsbanden können als Schwingungen von C-H-, CH2- und CH3-Gruppen in der Polymerkette interpretiert werden50. In den fluorsilanisierten Spitzen ist jedoch eine breite Absorptionsbande um 3700–3200 cm−1 vorhanden. Dies könnte Alkoholen und Phenolen entsprechen, die als Ergebnis der Plasmabehandlung und Hydrolyse von TPFS-Molekülen entstehen50. Aufgrund der relativ großen Eindringtiefe im FTIR konnten wir die FS SAM-bezogenen Bindungen mit dieser Methode nicht genau nachweisen.

Nach der Fluorsilanisierung der Spitzen wurden diese durch einfaches Ein- und Auspipettieren eines fluorierten Gleitmittels (PFPP) geschmiert. Die überschüssige Menge des Gleitmittels wurde dann durch gründliches Waschen der Spitzen mit entionisiertem Wasser entfernt. Die verbleibende dünne Schicht des Schmiermittels könnte durch Van-der-Waals-Kräfte im FS SAM eingeschlossen werden. Diese Gleitmittelschicht sorgt für omniphobe Eigenschaften und Abwehrwirkung im Innenlumen der mit Gleitmittel infundierten Spitzen. Das Gleitmittel sollte jedoch nach dem Pipettieren von Chemikalien in der Spitze verbleiben, um die Omniphobie zu bewahren. Unter Berücksichtigung mehrerer Studien zur Instabilität der Schmiermittelschicht27,51,52,53 haben wir beschlossen, die Robustheit der mit Schmiermittel infundierten Spitzen mittels eines Wiegetests zu bewerten. Wie in Abb. 2d zu sehen ist, betrug das Gewicht des Schmiermittels nach der Schmierung der Spitzen 6,9 mg. Als die Spitzen gewaschen und das überschüssige Gleitmittel entfernt wurden, reduzierte sich das Gewicht des verbleibenden Gleitmittels in der Spitze auf 4,5 mg. Diese Menge an Gleitmittel war in der Spitze sehr stabil, da nach 20-maligem Pipettieren von DI-Wasser das Gewicht des Gleitmittels in den Spitzen unverändert blieb. Dies beweist auch, dass das Gleitmittel nicht in die Pipettierlösung gelangt, wenn die mit Gleitmittel infundierten Spitzen verwendet werden. Unter Berücksichtigung der geschmierten Oberfläche der Spitze sowie des Gewichts und der Dichte des PFPP-Schmiermittels (2,03 g/ml bei 20 °C) haben wir berechnet, dass die Dicke der Schmiermittelschicht etwa 7 μm beträgt.

Bemerkenswert ist, dass sich PFPP-Schmiermittel laut der Gibbs-Analyse der freien Energie auch ohne die Anwesenheit von FS SAM27 auf natürliche Weise ausbreiten und eine Schmierschicht bilden können. Allerdings stellten wir fest, dass das Schmiermittel an der Oberfläche unbehandelter Spitzen deutlich weniger stabil ist als bei fluorsilanisierten Spitzen. Abbildung 1S zeigt das Gewicht des verbleibenden Gleitmittels in den unbehandelten Spitzen nach 20-maligem Auf- und Abpipettieren von DI-Wasser. Das geringere Schmiermittelgewicht in den unbehandelten Spitzen weist darauf hin, dass das Schmiermittel während des langen Waschvorgangs teilweise von der Spitze abgewaschen wurde. Dies könnte auf das Fehlen einer Fluorschicht und das Fehlen von Van-der-Waals-Kräften zurückzuführen sein, die das Schmiermittel an der Oberfläche der unbehandelten Spitzen festhalten. Das verbleibende Schmiermittel im Innenlumen der unbehandelten Spitzen lässt vermuten, dass die unbehandelten, geschmierten Spitzen möglicherweise die Verschleppungsrückstände in den Spitzen bis zu einem gewissen Grad unterdrücken könnten, wodurch die Notwendigkeit einer Fluorsilanisierung entfällt. Nichtsdestotrotz könnte das Schmiermittel ohne Fluorsilanisierung für einen kurzen Zeitraum stabil sein und für langfristige Anwendungen ist eine FS-Behandlung erforderlich.

Um die relative Hydrophobie/Hydrophilie der behandelten und unbehandelten Pipettenspitzen zu untersuchen, wurden Kontaktwinkelmessungen mit einem 5 µL großen Tropfen entionisiertem Wasser durchgeführt. Die statischen Kontaktwinkelmessungen der unbehandelten Spitzen, fluorsilanisierten Spitzen und mit Schmiermittel infundierten Spitzen sind in Abb. 3a dargestellt. Unbehandelte Spitzen zeigten einen geringeren Kontaktwinkel von 75 ± 11°, was auf ein geringes Maß an Hydrophobie schließen lässt. Es ist erwähnenswert, dass der Standardabweichungswert der unbehandelten Proben aufgrund der Variation in den Oberflächeneigenschaften der im Handel erhältlichen Spitzen relativ hoch ist. Bei der CVD-Behandlung und vor der Zugabe von Schmiermittel erhöhte sich der Kontaktwinkel auf 89 ± 3°. Schließlich wurde nach Zugabe von PFPP-Schmiermittel zu den fluorsilanisierten Spitzen ein Anstieg der Kontaktwinkel von Wasser auf 101,7 ± 7° nachgewiesen.

Kontaktwinkelmessungen. (a) Statische Kontaktwinkelmessung von unbehandelten, fluorsilanisierten und geschmierten Pipettenspitzenproben. (b) Kontaktwinkelhysterese unbehandelter und mit Schmiermittel infundierter Spitzen. (c) Vergleich des statischen Kontaktwinkels zwischen Wasser, Tween 20 und Isopropanol, gemessen unter Verwendung des Kapillardrucks. Alle Ergebnisse werden als Mittelwert ± SD dargestellt

Bei den Kontaktwinkelmessungen wurden die Spitzen aufgeschnitten und die Messung im konkaven Bereich durchgeführt, um die Hydrophobie des inneren Lumens zu beurteilen. Aufgrund der Oberflächenkrümmung der Pipettenspitze ist die Messung des Kontaktwinkels eines Flüssigkeitstropfens auf der Spitze mit einem Tensiometer kompliziert und kann zu geringfügigen Ungenauigkeiten führen. Daher wurde der Kontaktwinkel von Wasser, Tween 20 und Isopropanol als Flüssigkeit mit niedriger Oberflächenspannung an behandelten und Standardpipettenspitzen unter Verwendung der Kapillaranstiegsmethode gemessen. Der Kapillaraufstieg kann genutzt werden, um den Kontaktwinkel der aufsteigenden/tropfenden Flüssigkeit mithilfe hydrostatischer Prinzipien zu berechnen. Aufgrund der großen Ähnlichkeit der Spitzen mit einer Kegelstumpfform wurde die Kapillaranstiegsgleichung geändert, um diese Kapillarform zu berücksichtigen (Gleichung 1):

Dabei ist θ der Kontaktwinkel, ρ die Dichte der Flüssigkeit, g die Gravitationskonstante, h die Steig-/Abfallhöhe, R der Rohrdurchmesser im Dreiphasenbereich und γ die Oberflächenspannung der Flüssigkeit und β ist der konische Spitzenwinkel.

Daher wurden die Kontaktwinkel von Flüssigkeiten mit unterschiedlichen Oberflächenspannungen auf den fluorsilanisierten und unbehandelten Spitzen erfasst, um die Auswirkung der Oberflächenmodifikation auf die omniphoben Eigenschaften der Spitzen zu testen (Abb. 3c). Die Kontaktwinkel aller drei Flüssigkeiten waren auf den fluorsilanisierten Spitzen im Vergleich zu unbehandelten Spitzen höher. Dies ist besonders deutlich bei Flüssigkeiten mit niedrigerer Oberflächenspannung wie Tween 20 und Isopropanol zu erkennen. Die Zunahme der Kontaktwinkel der behandelten Proben verdeutlicht die durch die Behandlung induzierte höhere Oberflächenabweisung. Der Kontaktwinkel von Tween 20 war auf der fluorsilanisierten Oberfläche im Vergleich zum Standard um 30° höher, während der von Isopropanol um 28° höher war. Da die Spitzen aufgrund der Eigenschaften des zur Herstellung der Spitzen verwendeten Materials bereits vor der Oberflächenbehandlung hydrophobe Eigenschaften aufwiesen, gab es einen geringeren Unterschied im Kontaktwinkel des Wassers auf der behandelten Oberfläche mit einem Anstieg von 6,9° bei der Kapillaranstiegsmethode und einem Anstieg von 40° Erhöhung mit dem optischen Tensiometer. Bemerkenswert ist, dass die hydrophobe Natur der intakten Pipettenspitzen in Abb. 3a nicht vollständig erkannt wurde, was daran liegen könnte, dass sich die Oberflächeneigenschaften der Spitzen etwas veränderten, als die Spitzen zum Zweck der Kontaktwinkelmessung geschnitten und abgeflacht wurden.

Die Tropfenhaltekraft auf der Oberfläche der modifizierten Spitzen wurde mittels Hysterese-Kontaktwinkelmessungen bewertet (Abb. 3b). Wir haben die Nadelmethode angewendet, um den dynamischen Kontaktwinkel aufgrund der Krümmung der Spitzen zu bewerten. Während die Kontaktwinkelhysterese von unbehandelten Spitzen etwa 17 ± 2,5° betrug, reichte die Kontaktwinkelhysterese von mit Gleitmittel infundierten Spitzen bis zu 3,5 ± 0,6°, was ein hervorragendes Abstoßungsverhalten der entwickelten Spitzen zeigt.

Da die entwickelten mit Schmiermittel angereicherten Spitzen vielseitig und einfach sein sollen, haben wir die Möglichkeit geprüft, eine Luftplasmabehandlung anstelle einer Sauerstoffplasmabehandlung in den Fluorsilanisierungsprozess zu integrieren. Die Spitzen wurden 5 Minuten lang unter Luft mit Plasma behandelt und anschließend 2,5 Stunden lang FS-CVD-behandelt, gefolgt von einer Wärmebehandlung bei 60 °C über Nacht. Die Kontaktwinkel fluorsilanisierter Spitzen mittels Luftplasmabehandlung werden in Abb. 2S mit der Sauerstoffplasmabehandlung verglichen. Die erhaltenen Kontaktwinkel aus beiden Plasmabehandlungsprotokollen waren identisch, was darauf hindeutet, dass die Luftplasmabehandlung, die in verschiedenen Labors wesentlich zugänglicher ist als die Sauerstoffplasmabehandlung, in unserem Fluorsilanisierungsprotokoll perfekt ersetzt werden kann.

Jüngste Studien haben dokumentiert, dass strukturierte Fluorsilanschichten das Schmiermittel wirksamer zurückhalten54. Wir haben ein REM mit hoher Vergrößerung durchgeführt, um den Effekt der Fluorsilanisierung auf die Oberflächentopographie von Pipettenspitzen zu untersuchen (Abb. 3S). Die Ergebnisse zeigten keinen signifikanten Unterschied in der Textur unbehandelter Spitzen im Vergleich zu fluorsilanisierten Spitzen, die vor der Fluorsilanisierung durch Sauerstoff- oder Luftplasmabehandlung hergestellt wurden. Daher konnte mit unserer vorgeschlagenen Strategie keine strukturierte FS-SAM-Beschichtung erzeugt werden.

Um die Effizienz von mit Gleitmittel infundierten Spitzen bei der Vermeidung von Verschleppungsrückständen und Kreuzkontaminationen beim Pipettieren zu quantifizieren, wurden zehnfache Reihenverdünnungen von 1 mg mL−1 eines Lebensmittelfarbstoffs in Wasser mit 0,05 % Tween 20 unter Verwendung von mit Gleitmittel infundierten und unbehandelten Spitzen durchgeführt Tipps. Zur Durchführung aller Verdünnungsschritte wurde dieselbe Pipettenspitze verwendet, um die Wirkung von Farbstoffrückständen in der Spitze während der Reihenverdünnungen besser zu veranschaulichen. Mithilfe von Absorptionsmessungen (bei einer Wellenlänge von 512 nm) haben wir die Ergebnisse quantifiziert, die wir mit mit Gleitmittel infundierten und unbehandelten Pipettenspitzen in zwei Größen von 10 μl und 200 μl erhalten haben (siehe Abb. 4a bzw. b). Die Ergebnisse der Verdünnungen zeigen, dass die unbehandelten Spitzen deutlich höhere Verschleppungsrückstände aufweisen und die Verdünnungen nicht effizient erfolgten. Daher könnte die größere Farbstoffmenge, die bei niedrigeren Konzentrationen zu sehen ist, auf den Farbstoffrückstand zurückzuführen sein, der von den anfänglich hohen Konzentrationen auf der Spitzenoberfläche verblieben war und zu den niedrigen Konzentrationen transportiert wurde.

Absorption des roten Farbstoffs bei unterschiedlichen Konzentrationen nach Durchführung zehnfacher Reihenverdünnungen mit (a) 10 μL und (b) 200 μL unbehandelten Spitzen im Vergleich zu mit fluorsilanisiertem Gleitmittel infundierten Spitzen. Für jedes Experiment wurde eine einzige Spitze für alle Reihenverdünnungen verwendet. Die gestrichelte Linie in (a) stellt die Absorption des roten Farbstoffs bei einer Konzentration von Null dar. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SD dargestellt. (c) Reihenverdünnungen des roten Farbstoffs in einer Wellplatte unter Verwendung einzelner 10 μL unbehandelter und mit Gleitmittel infundierter Spitzen. Unbehandelte Vertiefungen zeigten eine höhere Farbstoffrückstandsverschleppung, da die Verdünnung nicht effektiv erfolgte. (d) Vergleich der Anhaftung des roten Farbstoffs an unbehandelten 200-μL-Spitzen und mit fluorsilanisiertem Gleitmittel infundierten Spitzen.

Gemäß Abb. 4a, b zeigen die mit Gleitmittel infundierten Spitzen einen steileren Abfall der Absorption pro Verdünnungszahl, gefolgt von einem schnelleren Einpendeln auf den Absorptionswert des Verdünnungsmittels (mit einer Konzentration des Farbstoffs von Null), der durch die gestrichelte Linie in Abb. angezeigt wird. 4a. Andererseits weisen die unbehandelten Spitzen auch bei höheren Verdünnungszahlen höhere Absorptionswerte auf, was darauf zurückzuführen ist, dass die Probe auch nach mehreren Verdünnungen an der Wand der Spitze haftet. Darüber hinaus ist bei unbehandelten Spitzen im Vergleich zu behandelten Spitzen eine deutlich höhere Variation zu beobachten, was durch die großen Fehlerbalken in Abb. 4a, b angezeigt wird. In Abb. 4c konnte der Farbunterschied in der Wellplatte nach Durchführung der Reihenverdünnungen über die mit Gleitmittel infundierten Spitzen und unbehandelten Spitzen beobachtet werden. Wir führten auch einen visuellen Test an den Spitzen durch, nachdem wir den Lebensmittelfarbstoff, verdünnt in Wasser mit 0,05 % Tween 20, in einer Konzentration von 1 mg mL-1 hinein- und herauspipettiert hatten. Wie in Abb. 4d gezeigt, zeigte die unbehandelte 200-μL-Pipettenspitze eine große Menge an Farbstoffadsorption an der Spitze, wohingegen die mit Gleitmittel infundierte Spitze nach dem Herauspipettieren der Farbstofflösung eine deutlich geringere Farbstoffmenge vor allem am unteren Ende der Spitze beibehielt .

Im nächsten Experiment verwendeten wir mit Gleitmittel infundierte Spitzen in verschiedenen Größen von 10 μL (P10), 200 μL (P200) und 1 ml (P1000), um rekalzifiziertes menschliches Citratblut hinein- und herauszupipettieren. Wie in Abb. 5a gezeigt, konnten die mit Gleitmittel infundierten Spitzen in allen Größen im Vergleich zu den unbehandelten Spitzen die Blutanhaftung und Gerinnselbildung innerhalb der Spitze wirksam unterdrücken. Die REM-Bilder in Abb. 5b zeigen auch das Vorhandensein von Blutzellen und Gerinnseln auf der Oberfläche der unbehandelten Spitzen, während die mit Gleitmittel infundierte Modifikation die Zellanhaftung und Gerinnselbildung deutlich reduzierte. Wir haben die Menge des in den Spitzen gebildeten Gerinnsels quantifiziert, indem wir das Gewicht des Gerinnsels gemessen haben. Abbildung 5c zeigt, dass das Gerinnselgewicht bei den mit P1000- und P200-Gleitmittel infundierten Spitzen im Vergleich zu den unbehandelten Spitzen deutlich geringer war. Aufgrund der eingeschränkten Empfindlichkeit der Waage konnten wir das Gerinnselgewicht in 10-µL-Spitzen nicht messen. Insgesamt zeigen die Ergebnisse, dass mit Gleitmittel infundierte Spitzen in der Lage sind, alle im menschlichen Vollblut vorhandenen Blutzellen, Gerinnungsfaktoren und anderen Biospezies abzuwehren.

(a) Vergleich der Blutgerinnungsbindung an unbehandelten Spitzen mit 10 μL (P10), 200 μL (P200) und 1000 μL (P1000) und mit fluorsilanisiertem Gleitmittel infundierten Spitzen nach dem Pipettieren von rekalzifiziertem menschlichem Blut. (b) REM-Bilder eines Gerinnsels, das an der Oberfläche der unbehandelten Spitze haftet, im Vergleich zur Spitze, die mit fluorsilanisiertem Gleitmittel infundiert ist. (c) Gerinnselgewicht in den unbehandelten und mit Gleitmittel infundierten Spitzen in zwei Größen, P200 und P1000. Die Gerinnselmenge in den mit Gleitmittel infundierten Spitzen war deutlich geringer als in den unbehandelten Spitzen (*P < 0,001). Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SD (d) dargestellt. Schematische Darstellung des Bakterientests. Nach dem Auf- und Abpipettieren der MRSA-Bakteriensuspension mit sowohl unbehandelten als auch mit Gleitmittel infundierten Spitzen wurden die Spitzen 20 Minuten lang in TSB-Medium inkubiert. (e) Ergebnisse des Bakterienwachstumstests, die mit den TSB-Medien erzielt wurden, in denen die Spitzen inkubiert wurden. Bei allen drei Größen P10, P200 und P1000 gibt es einen signifikanten Unterschied bei den KBE/ml MRSA zwischen den unbehandelten und den mit Gleitmittel infundierten Spitzen (*P < 0,001). Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SEM dargestellt

Schließlich nutzten wir unsere mit Gleitmittel angereicherten Spitzen, um eine MRSA-Bakterienlösung in einer Konzentration von 107 KBE ml−1 zu pipettieren. Nach dem Auf- und Abpipettieren der Bakteriensuspension mit sowohl mit Gleitmittel infundierten als auch unbehandelten Spitzen wurden die Spitzen in 5 ml TSB getaucht und 20 Minuten lang in einem Schüttelinkubator bei 37 °C inkubiert (Abb. 5d). Darüber hinaus wurde ein CFU-Assay unter Verwendung der TSB-Lösungen durchgeführt, um die Menge an Bakterienanhaftungen an den mit Gleitmittel infundierten Spitzen und unbehandelten Spitzen zu vergleichen. Die Ergebnisse des Wachstumstests (Abb. 5e) zeigten eine Reduzierung der KBE/ml MRSA um etwa 2 Log, 3 Log und 6 Log bei Verwendung von mit Gleitmittel infundierten P10-, P200- bzw. P1000-Spitzen. Die mit Gleitmittel infundierten Spitzen konnten den Großteil der MRSA-Bakterien abwehren, als die Bakterienlösung herauspipettiert wurde und nur wenige Bakterien in der Spitze verblieben (Abb. 5d). Das Ergebnis dieser Studie zeigt, dass sich beim Pipettieren von Bakteriensuspensionen eine große Anzahl von Bakterien physisch an den handelsüblichen Spitzen festsetzt, was zu Schwankungen in der Bakterienkonzentration der pipettierten Lösung und zu Versuchsfehlern führen kann.

Das Anhaften der Probe an der Spitzenwand während des Pipettierens führt zu vielen Problemen, die die experimentelle Genauigkeit beeinträchtigen. Aktuelle Techniken zur Reduzierung dieses Effekts sind teuer und erfordern Modifikationen an den Kunststoffmaterialien, die zur Herstellung der Pipettenspitzen verwendet werden. Diese Arbeit schlägt eine einfache Oberflächenmodifikationstechnik vor, um eine Flüssigkeits-/Proteinabweisung an den Innen- und Außenwänden der Pipettenspitzen zu induzieren. Die vorgeschlagenen, mit Schmiermittel angereicherten Spitzen mit omniphoben Eigenschaften sind in der Lage, Flüssigkeiten mit niedriger und hoher Oberflächenspannung abzustoßen und Probenverschleppungsrückstände in den Spitzen zu reduzieren. Wir beobachteten eine deutlich geringere Menge an Farbstoffen, Blutgerinnseln und Bakterienanhaftungen an der Innenfläche der mit Gleitmittel infundierten Spitzen im Vergleich zu den unbehandelten Spitzen. Diese Technik kann daher verwendet werden, um Kreuzkontaminationen zu minimieren und die Effizienz zu steigern, indem der Probenverlust aufgrund der Verschleppungshaftung verringert wird.

Die im Rahmen der aktuellen Studie generierten und analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Diese Arbeit wurde durch den NSERC Discovery Grant, den Ontario Early Researcher Award und McMaster Start-up Funds an TFD unterstützt. TFD ist Kanadas Forschungslehrstuhl der Stufe II. Die Elektronenmikroskopie wurde am Canadian Centre for Electron Microscopy (CCEM) durchgeführt, einer nationalen Einrichtung, die vom NSERC und McMaster unterstützt wird. Alle Schaltpläne wurden mit BioRender.com erstellt.

Fakultät für Maschinenbau, McMaster University, 1280 Main Street West, Hamilton, ON, L8S 4L7, Kanada

Inmitten von Shakeri, Hanie Yousefi, Samer Kullab, Dalya Al-Mfarej und Tohid F. Didar

Leslie Dan Fakultät für Pharmazie, University of Toronto, 144 College Street, Toronto, ON, M5S 3M2, Kanada

Hanie Yousefi

School of Biomedical Engineering, McMaster University, 1280 Main Street West, Hamilton, ON, L8S 3L8, Kanada

Noor Abu Jarad & Tohid F. Didar

Abteilung für Mikrobiologie und Plattform für innovative Biomarker, GH Université Paris Saclay, Hôpital Raymond Poincaré (APHP), Garches, Frankreich

Martin Rottmann

Labor für Infektion und Entzündung U1173, School of Medicine Simone Veil Versailles Saint-Quentin-en-Yvelines University, Montigny le Bx, Frankreich

Martin Rottmann

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AS und HY haben gleichermaßen zu dieser Arbeit beigetragen. TFD betreute die Forschung. AS und HY führten die Experimente, Datenvalidierung, Datenvisualisierung und Analyse durch und verfassten das Manuskript mit Hilfe von SK und DAM sowie Beiträgen von MR und TD. Alle Autoren haben die endgültige Version des Papiers gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Amid Shakeri oder Tohid F. Didar.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Shakeri, A., Yousefi, H., Jarad, NA et al. Kontaminations- und verschleppungsfreie Handhabung komplexer Flüssigkeiten mithilfe von mit Gleitmittel angereicherten Pipettenspitzen. Sci Rep 12, 14486 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-18756-x

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Eingegangen: 13. Mai 2022

Angenommen: 18. August 2022

Veröffentlicht: 25. August 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-18756-x

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