Selektive Anreicherung von Plasmazellen

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 885 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Extrazelluläre Vesikel (EVs) haben sich als Schlüsselmediatoren des extrazellulären kleinen RNA-Transports erwiesen. Allerdings sind Träger zellfreier Boten-RNA (cf-mRNA) in menschlichen Bioflüssigkeiten und ihr Zusammenhang mit Krebs nach wie vor kaum verstanden. Hier führten wir eine transkriptomische Analyse von größenfraktioniertem Plasma von Lungenkrebs, Leberkrebs, multiplem Myelom und gesunden Spendern durch. Die Analyse der Morphologie und Größenverteilung zeigte die erfolgreiche Trennung großer und mittlerer Partikel von anderen löslichen Plasmaproteinfraktionen. Wir haben eine Strategie entwickelt, um extrem geringe Mengen an cf-mRNA aus mit Partikeln und Proteinen angereicherten Subpopulationen zu reinigen und zu sequenzieren. Dabei wurden RNA-Spike-Ins implementiert, um die technische Variabilität zu kontrollieren und intrinsische drastische Unterschiede in der jeweils enthaltenen cf-mRNA-Menge zu normalisieren Plasmafraktion. Wir fanden heraus, dass der Großteil der cf-mRNA in EVs mit bemerkenswerter Stabilität in RNase-reichen Umgebungen angereichert und geschützt war. Wir beobachteten spezifische Anreicherungsmuster von krebsassoziierter cf-mRNA in jeder mit Partikeln und Proteinen angereicherten Subpopulation. Die mit EV angereicherten differenzierenden Gene waren mit spezifischen biologischen Signalwegen wie dem Immunsystem, der Leberfunktion und der Regulierung toxischer Substanzen bei Lungenkrebs, Leberkrebs und multiplem Myelom verbunden. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass die Analyse der Komplexität von EV-Subpopulationen deren biologische Bedeutung beleuchtet und einen vielversprechenden Ansatz für die Flüssigbiopsie bietet.

Zellfreie RNA (cfRNA), auch als extrazelluläre RNA (exRNA) bekannt, ist in vielen Körperflüssigkeiten vorhanden, einschließlich Liquor (CSF), Speichel, Serum, Urin und Plasma1,2,3. Die am häufigsten gemeldeten cfRNA-Biotypen sind kleine nichtkodierende RNAs (ncRNAs), zu denen microRNAs (miRNAs), Transfer-RNA-Fragmente (tRNA) und piwi-interagierende RNAs (piRNAs) gehören4. Studien haben auch Messenger-RNAs (mRNAs) und lange nichtkodierende RNAs (lncRNAs) in Bioflüssigkeiten gefunden5,6,7,8,9. Während cfRNA aufgrund der hohen RNase-Werte im Blut als fragiler und weniger häufig vorkommend gilt als zellfreie DNA10, haben mehrere Studien gezeigt, dass im Blut vorhandene miRNAs bemerkenswert stabil sind11,12. Viele cfRNA-Studien konzentrierten sich auf die Charakterisierung von cf-miRNA aufgrund ihrer Stabilität in Körperflüssigkeiten11,12. Allerdings haben wir und andere kürzlich gezeigt, dass cf-mRNAs auch stabile und krankheitsspezifische Signaturen tragen können, die als nicht-invasive Biomarker genutzt werden können8,13,14,15,16,17,18.

cfRNAs sind mit mehreren Unterklassen von Trägern assoziiert, darunter extrazelluläre Vesikel (EVs), Ribonukleoproteine ​​und auch Lipoproteine ​​wie Chylomikronen, Lipoprotein sehr niedriger Dichte (VLDL), Lipoprotein niedriger Dichte (LDL) und Lipoprotein hoher Dichte (HDL). Die Arten und Anteile der in verschiedenen Trägern verpackten RNA-Ladungen können von der Art der Bioflüssigkeit, präanalytischen Faktoren und physiologischen oder pathologischen Bedingungen abhängen. Das NIH Extrazelluläre RNA (exRNA) Kommunikationskonsortium hat eine exRNA-Atlas-Ressource erstellt, die die wichtigsten Träger von miRNA durch rechnerische Entfaltung in 19 Studien ausführlich verglich2,19. Diese vergleichenden statistischen Studien identifizierten fünf der miRNA-Frachttypen, die mit bekannten vesikulären und nicht-vesikulären Trägern assoziiert sind2. Während diese Studien EVs als Schlüsselmediator des RNA-Transports vermuteten, haben andere gezeigt, dass RNA-bindende Proteinkomplexe miRNA unabhängig von Vesikeln im menschlichen Plasma transportieren können12,13,20. Die Identifizierung von cf-mRNA-Trägern, die für Stabilität in RNase-reichem Plasma sorgen, könnte grundlegende Biologie und Funktion sowie eine potenziell unterschiedliche Form trägerspezifischer Biomarker für klinische Anwendungen aufdecken. In konditionierten Zellkulturmedien wurde gezeigt, dass cf-mRNA mit EVs assoziiert ist13,20. Welche Träger mit cf-mRNA in menschlicher Bioflüssigkeit assoziieren, ist jedoch nach wie vor nur unzureichend geklärt1,21.

Einer der potenziellen cf-mRNA-Träger, die in früheren Studien unter Verwendung von Zellkulturmodellen und extrazellulärer Lang-RNA-Sequenzierung vorgeschlagen wurden, ist EVs13,20,21, ein Sammelbegriff für verschiedene Vesikel, die sich anhand ihrer Größe und Biogenese22 unterscheiden. Die Entdeckung von EVs, die cfRNA enthalten, hat großes Interesse am Verständnis der Rolle dieser Vesikel bei der interzellulären Kommunikation und möglichen klinischen Anwendungen geweckt13,23,24. Elektrofahrzeuge mit einem Durchmesser von mehr als 100 nm werden als mittlere Elektrofahrzeuge kategorisiert, während Elektrofahrzeuge mit einem Durchmesser von weniger als 100 nm als kleine Elektrofahrzeuge kategorisiert werden25. Frühere Untersuchungen zeigen, dass Elektrofahrzeuge verschiedene molekulare Ladungen enthalten, darunter Nukleinsäuren und Proteine, die mit ihren Ursprungszellen assoziiert sind, was das Potenzial sowohl für die Diagnostik als auch für die Prognose bietet9,26,27,28. Insbesondere variierte der miRNA-Gehalt von Elektrofahrzeugen im Plasma in klinischen menschlichen Proben erheblich29,30. Es ist jedoch wenig darüber bekannt, ob EVs oder Proteinkomplexe die Hauptträger von cf-mRNA in komplexen Bioflüssigkeiten wie Plasma sind und ob zirkulierende cf-mRNA, die mit EVs assoziiert ist, Krebspatienten von gesunden Kontrollpersonen unterscheiden kann.

Zellkulturstudien haben damit begonnen, zu bestimmen, wie onkogene Signale extrazelluläre miRNA in EVs lenken13,31,32. Spezifische Onkogene erhöhen die Häufigkeit von miRNA und verändern die EV-miRNA-Zusammensetzung31. Diese exosomalen miRNAs können die Phänotypen der Empfängerzellen beeinflussen, indem sie die Genexpression und Zellfunktionen verändern28. Aktuelle Forschungsergebnisse zeigen, dass von Tumoren abgeleitete Elektrofahrzeuge miRNA-Inhalte selektiv verpacken können28,32,33. Im Zusammenhang mit der Krebsprogression beeinflussen Mutationen auf Onkogenen wie KRAS die selektive Verpackung von genetischem Material in Vesikel in Zellkulturmedien28. Mutiertes KRAS verringerte die Assoziation von Argonaut 2 (Ago2) mit verschiedenen miRNAs, die selektiv in EVs sortiert wurden. Trotz Belegen für eine selektive miRNA-Verpackung in Zellsystemen von Krebsmodellen sind Studien zu den Auswirkungen von Krankheiten und genetischen Aberrationen auf den mRNA-Gehalt von Elektrofahrzeugen aus menschlichem Plasma noch unzureichend erforscht.

In dieser Studie wollten wir cf-mRNA-Träger im menschlichen Plasma identifizieren und feststellen, ob die Häufigkeit oder Identität von cf-mRNA bei verschiedenen Krebsarten verändert ist. Wir haben ein Protokoll entwickelt, um extrazelluläre Träger im Plasma mithilfe der Größenausschlusschromatographie (SEC) aus anderen löslichen Plasmaproteinfraktionen in große und mittlere Partikel zu fraktionieren. Wir haben die biophysikalischen Eigenschaften extrazellulärer Fraktionen mithilfe der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und der Technologie der abstimmbaren Widerstandsimpulsmessung als orthogonale Ansätze charakterisiert. Anschließend sequenzierten wir cf-mRNA aus größenfraktioniertem Plasma. Wir haben synthetische RNA-Spike-Ins eingebaut, um technische Variabilität und intrinsische Unterschiede in der Menge der in jeder Plasmafraktion enthaltenen cf-mRNA zu kontrollieren. Mit diesem Ansatz führten wir eine transkriptomische Analyse von 120 größenfraktionierten Plasmaproben von gesunden Teilnehmern und solchen mit Lungenkrebs, Leberkrebs und multiplem Myelom durch. Wir führten auch eine Immunpräzipitation gefolgt von Western Blot und qRT-PCR durch, um weiter zu bestätigen, dass EVs die Hauptträger von cf-mRNA im Plasma sind. Darüber hinaus zeigten RNase-Behandlungstests, dass cf-mRNA in EVs geschützt ist. Darüber hinaus beobachteten wir spezifische Anreicherungsmuster von cf-mRNA mit zugehörigen biologischen Signalwegen in vesikulären und nicht-vesikulären Subpopulationen aus verschiedenen Krebsproben.

Wir untersuchten potenzielle vesikuläre und nicht-vesikuläre Träger von cf-mRNA im Plasma durch Größenfraktionierung mittels Größenausschlusschromatographie (SEC). Wir fraktionierten das Plasma mittels SEC und sammelten eine Reihe von 2-ml-Fraktionen: 0–2 ml (FR2), 2–4 ml (FR4), 4–6 ml (FR6) usw. (Abb. 1a). Fraktionen zwischen 2 und 12 ml enthielten überwiegend Partikel mit einem Durchmesser von etwa 50–300 nm, gemessen mit der abstimmbaren Widerstandspulserkennungstechnologie (qNano) (Abb. 1b). Fraktionen, die aus dem Elutionsvolumen von 14 ml und darüber hinaus gesammelt wurden, lagen unterhalb der Partikelgrößen-Nachweisgrenze (< 50 nm) von qNano. Die Absorption bei 280 nm zeigte, dass der Großteil der Plasmaproteine ​​über das Elutionsvolumen von 12 ml hinaus eluiert wurde (Abb. 1b). Um die Verteilung heterogener Partikelgrößen genau zu charakterisieren, analysierten wir ihre Morphologie in einzelnen Fraktionen, die von 2 ml bis 12 ml gesammelt wurden, mithilfe der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) (Abb. 1c und ergänzende Abb. 1). Das mittels TEM gemessene Größenhistogramm der zwischen 2 und 12 ml eluierten Partikel zeigte drei Hauptverteilungsbereiche: größer als 100 nm, zwischen 50 und 100 nm und weniger als 50 nm mit dem dominanten Peak um 30 nm (ergänzende Abbildung 2). . Der Großteil der Partikel größer als 100 nm wurde in der ersten 4-ml-Fraktion (FR4) eluiert, während Partikel zwischen 50 und 100 nm in den nächsten 4–8 ml (FR6 und FR8) angereichert wurden (Abb. 1d und ergänzende Daten 1). Fraktionen von 8 bis 12 ml (FR10 und FR12) wurden von Partikeln mit einer Größe von weniger als 50 nm dominiert (Abb. 1d und ergänzende Daten 1). Daher haben wir fraktioniertes Plasma in 4-ml-Fraktionen mit ähnlichen Partikelgrößen aufgeteilt, die möglicherweise sowohl EVs als auch andere Lipoproteinpartikel enthalten. Wir haben einzelne Fraktionen als große Partikel (FR14: eluiert von 0 bis 4 ml), mittlere Partikel (FR58: eluiert von 4 bis 8 ml) und kleine Partikel (FR912: eluiert von 8 bis 12 ml) bezeichnet, um ihre cf-mRNA zu analysieren Inhalt (Abb. 1e). Wir haben auch mit Proteinen angereicherte Plasmafraktionen in früh eluierende Proteinfraktionen (FR1619: eluiert von 15 bis 19 ml), mitteleluierende Proteinfraktionen (FR2326: eluiert von 22 bis 26 ml) und spät eluierende Proteinfraktionen ( FR3033: eluiert von 29 bis 33 ml) für weitere Analysen (Abb. 1e).

a Schematische Darstellung der Plasmafraktionierung mittels Größenausschlusschromatographie mit 2 ml Eingangsplasma und 2 ml eluierten Volumina pro Fraktion (FR). b Balkendiagramme der Partikelkonzentration (in Schwarz), gemessen durch abstimmbare Widerstandsimpulsmessung, auf der linken Y-Achse und der Proteinhäufigkeit (in Rot), gemessen durch Absorption bei 280 nm, auf der rechten Y-Achse. Die X-Achse zeigt jede Fraktion aus der Größenausschlusschromatographie mit Farbflächen für FR14 (rot), FR58 (blau), FR912 (grün), FR1619 (lila), FR2326 (orange) bzw. FR3033 (gelb). Die Daten werden mit RStudio (v2023.06.1 + 524) analysiert und als Mittelwert ± SD von drei biologischen Replikaten angegeben. c Repräsentative Transmissionselektronenmikroskopbilder von Partikeln in einzelnen Fraktionen; Maßstabsleiste: 100 nm. d Kreisdiagramm der prozentualen Verteilung der Partikel mit entsprechenden Größenbereichen: ≥ 100 nm (rot), ≥ 50 nm und < 100 nm (blau) und < 50 nm (grün), identifiziert in jeder durch TEM gemessenen Fraktion. e Schematische Darstellung von Plasmafraktionen mit Farbschemata für die transkriptomische Analyse.

Um die mit verschiedenen Fraktionen assoziierte cf-mRNA zu charakterisieren, haben wir RNA aus dem größenfraktionierten Plasma von fünf gesunden Kontrollpersonen (HD), fünf Lungenkrebs-Kontrollen (LG), fünf multiplen Myelomen (MM) und fünf Leberkrebs-Kontrollen (LV) gereinigt und sequenziert. Patienten (Ergänzende Daten 2, Abb. 2a). Zur Kontrolle der technischen Variabilität und zur Normalisierung haben wir jeder Fraktionsprobe die gleiche Menge ERCC-Beimischung zugesetzt. Aus Plasma gereinigte RNA sind kurze Fragmente mit einem vorherrschenden Peak von weniger als 200 nt, der durch Bioanalysatoranalyse gezeigt wird (ergänzende Abbildung 3a). Um die Verteilung der Länge plasmazellfreier RNA zu bestätigen, haben wir PCR-Primer entwickelt, die auf ein langes RNA-Amplikon von 898 bp und kurze Amplikons von 80 bp am 5'-Ende, 3'-Ende und in der Mitte des Transkripts des gewebespezifischen Gens abzielen ALB (Ergänzende Abbildung 3b). Alle kurzen Amplikons an drei Stellen im Transkript wurden amplifiziert, während die langen Amplikons in zellfreier RNA nicht nachgewiesen wurden. Daher haben wir die Stranded SMART-Seq-Methode anstelle der Oligo-dT-basierten Methode verwendet, um die Bibliotheken so vorzubereiten, dass fragmentierte zellfreie RNA für die Sequenzierung effizient erfasst wird. Mit dieser Methode sequenzierten wir Bibliotheken bis zu einer Tiefe von 25,9 M bis 102,9 M Lesevorgängen (Abb. 2b, d) und erhielten einen Mittelwert von 4,0 M eindeutig kartierten Lesevorgängen im Bereich von 70.152–34,2 M für jede Probe (Abb. 2b). . mRNA-kodierende Contigs wurden mit Sequenzierungsablesungen abgedeckt (ergänzende Abbildung 4). Der Prozentsatz der eindeutig zugeordneten Lesevorgänge nahm mit steigender Fraktionszahl ab: 17,8 % (FR14), 9,9 % (FR58), 4,2 % (FR912), 5,2 % (FR1619), 5,5 % (FR2326) und 1,8 % (FR3033) ( Ergänzende Abbildung 5a). Der Anteil der Lesevorgänge, die Exons zugeordnet sind (Exon-Fraktion), verringerte sich ebenfalls: 94,4 % (FR14), 84,5 % (FR58), 55,3 % (FR912), 32,6 % (FR1619), 25,5 % (FR2326) und 36,3 % (FR3033). (Ergänzende Abbildung 5b). Während sowohl der Prozentsatz der eindeutig kartierten Lesevorgänge als auch der Exon-Fraktionen mit zunehmender Fraktionszahl abnahm, nahmen die Intron-Fraktionen in denselben Proben zu (ergänzende Abbildung 5c). Unter den ca. 12.000 cfRNA-Transkripten, die in fraktioniertem Plasma gefunden wurden, stellte cf-mRNA 93,6 ± 0,9 % (Mittelwert ± SD) der identifizierten zellfreien RNA-Biotypen dar, die über verschiedene klinische Probentypen und Fraktionen hinweg konsistent blieben (Abb. 2c, e). .

a Schematische Darstellung des Arbeitsablaufs zur Plasmafraktionierung aus dem Probensatz. Zur Größenfraktionierung und RNA-Isolierung wurden Plasmaproben von jeweils fünf gesunden Kontrollpersonen (HD) und Krebspatienten (LV, LG, MM) gesammelt. Jede Plasmaprobe wurde in große Partikel (FR14), mittlere Partikel (FR58), kleine Partikel (FR912) sowie früh, mittel und spät eluierende Proteinfraktionen (FR1619, FR2326 bzw. FR3033) fraktioniert. Zur Kontrolle der Verarbeitung und Normalisierung wurde den Plasmafraktionen eine gleichmäßige Menge ERCC-RNA-Kontrollmischung zugesetzt. Repräsentative Bilder wurden mit der Illustrationssoftware BioRender und PowerPoint erstellt. b Tabelle mit Beschreibungen globaler Lesevorgänge, eindeutiger Lesevorgänge, Exon-Fraktion und Intron-Fraktion über 120 Sequenzierungsproben aus dem RNA-seq-Qualitätskontrollpaket (RSeQc). Es werden der Mittelwert, der Minimalwert (Min) und der Maximalwert (Max) angezeigt. c Tabelle der Biotypkategorien, einschließlich Proteinkodierung, transkribiertes unverarbeitetes Pseudogen, verarbeitetes Transkript, verarbeitetes Pseudogen, lincRNA, Antisense und andere. Es werden der Mittelwert, der Minimalwert (Min) und der Maximalwert (Max) angezeigt. d Balkendiagramm der Anzahl der Eingabeablesungen über 120 Sequenzierungsproben, gefärbt nach Bedingungen. e Eine Stapelspalte, die den Anteil jedes Biotyps in 120 Proben darstellt.

Um einen Einblick in die relative Häufigkeit von cf-mRNA in Plasmafraktionen zu erhalten, haben wir nur nach proteinkodierenden Transkripten gefiltert und diese zur weiteren Analyse durch ERCC normalisiert (Abb. 3a). Insgesamt 11.609 normalisierte proteinkodierende Transkripte überschritten diesen Schwellenwert und wurden für die nachgelagerte Analyse verwendet. Die mittlere log2-normalisierte Expression aller nachgewiesenen proteinkodierenden Transkripte war in FR14 und FR58 sechsmal höher als in RNA, die in FR912 und proteinangereicherten Fraktionen enthalten war (Abb. 3b). Die unbeaufsichtigte Hauptkomponentenanalyse (PCA) unter Verwendung der 500 wichtigsten Gene mit der größten Varianz trennte große und mittlere Partikel klar von anderen Plasmafraktionen und zeigte einen allmählichen Übergang von großen und mittleren Partikeln zu kleinen Partikeln und Proteinfraktionen (Abb. 3c). Interessanterweise zeigte die kleine Partikelfraktion (FR912) einen höheren Grad an Ähnlichkeit mit proteinangereicherten Fraktionen als mit großen oder mittleren Partikeln angereicherte Fraktionen. Eine hierarchische Clusteranalyse unter Verwendung aller erkannten Gene (n = 11.609) ergab, dass der Großteil der cf-mRNA in großen und mittleren Partikelfraktionen angereichert war (Abb. 3d). Diese relativ hohe Expression von cf-mRNA in großen und mittleren Partikeln ist kein technisches Artefakt, da synthetische ERCC-RNA der Kontrolle, die über alle Fraktionen hinweg mit der gleichen Menge versetzt wurde, nach einheitlicher Probenverarbeitung in allen Fraktionen konsistent war (ergänzende Abbildung 6).

ein Schema des RNA-Sequenzierungs- und Analyse-Workflows. Die Gesamtzahl der cfRNAs wurde mithilfe der Annotation des menschlichen Genomensembles nach Proteinkodierung gefiltert. v94 (hg38; v94), die dann unter Verwendung von ERCC als Kontrollgenen durch DESeq2 normalisiert wurden. b Balkendiagramm der mittleren Expression in log2 (Anzahl + 1) für alle erkannten Gene in den Plasmafraktionen: FR14 (rot), FR58 (blau), FR912 (grün), FR1619 (lila), FR2326 (orange) und FR3033 (gelb). ) jeweils. c Hauptkomponentenanalyse unter Verwendung aller 11.609 nachweisbaren Gene in einzelnen Fraktionen: FR14 (rot), FR58 (blau), FR912 (grün), FR1619 (lila), FR2326 (orange) bzw. FR3033 (gelb). d Heatmap, die die relative Expression aller Gene (n = 11.609) aus allen Bedingungen in allen 118 Proben darstellt und zeigt, dass der Großteil der zellfreien mRNA mit FR14 und FR58 angereichert ist. e Heatmap, die das relative Expressionsniveau der Top-10-Gene darstellt, die aus 12 verschiedenen Clustern unter Verwendung von degPatterns über 118 Proben abgeleitet wurden. Die Top-10-Gene wurden nach der False Discovery Rate (FDR) des einfaktoriellen ANOVA-Tests eingestuft. Cluster mit weniger als 10 Genen wurden mit der tatsächlichen Anzahl an Genen dargestellt.

Um Muster von cf-mRNA zu bestimmen, die in mit Partikeln und Proteinen angereicherten Fraktionen nachgewiesen wurden, verwendeten wir das DegPatterns-Paket, um 11.577 differenziell exprimierte Gene zu analysieren, die durch einen Einweg-ANOVA-Test über alle Fraktionen hinweg ermittelt wurden. Mithilfe von DegPatterns haben wir 12 unterschiedliche Trends identifiziert, deren Variabilität zwischen den Clustern größer ist als die Unterschiede zwischen den Clustern (ergänzende Abbildung 7). Wir haben die zehn wichtigsten Gene, die für jedes identifizierte Muster repräsentativ sind, zur Visualisierung in einer Heatmap ausgewählt. Wir beobachteten vier Hauptanreicherungsmuster über Plasmafraktionen hinweg: (1) 99,13 % der Gene (11.476/11.577) waren sowohl in FR14 als auch in FR58 (Cluster 1–4) angereichert, (2) 0,38 % der Gene (44/11.577) waren angereichert speziell in FR14 (Cluster 5), (3) 0,04 % der Gene (5/11.577) waren spezifisch in FR58 (Cluster 8) angereichert und (4) 0,45 % der Gene (52/11.577) waren in Proteinfraktionen angereichert (Cluster). 6-7, 9–12) (Abb. 3e und ergänzende Abb. 7).

Als nächstes untersuchten wir molekulare Marker potenzieller RNA-Träger wie EVs, Lipoproteine ​​und RNA-bindende Proteinkomplexe über SEC-Fraktionen hinweg. Wir führten eine Immunpräzipitation an Plasmafraktionen unter Verwendung von Antikörpern gegen einen kanonischen EV-Marker (CD9), Lipoproteinmarkern (ApoA1 für HDL und ApoB für Chylomikron, VLDL und LDL) und einem der RNA-bindenden Proteinkomplexe, Argonaut 2 (Ago2) durch. Abb. 4a und ergänzende Abb. 8). Die Immunpräzipitationsanalyse zeigte, dass der kanonische EV-Marker CD9 bevorzugt an FR14 und FR58 angereichert war. Im Gegensatz dazu waren ApoA1 und Ago2 in Proteinfraktionen angereichert (FR1619, FR2326 und FR3033). Darüber hinaus wurde unter Verwendung von ApoB ein relativ großer Lipoproteinbeitrag bestimmt (Abb. 4a und ergänzende Abb. 8). Basierend auf ihren physikalischen Größeneigenschaften können EVs und ähnliche Größenbereiche von Lipoproteinpartikeln gemeinsam eluiert werden34. Die Western-Blot-Analyse bestätigte die höchsten ApoB-Werte in der Fraktion kleiner Partikel (FR912) und der frühen Proteinfraktion (FR1619), während relativ niedrige bzw. mäßige ApoB-Werte auch in FR14 bzw. FR58 nachgewiesen wurden. Die kleine Partikelfraktion (FR912) zeigte nur eine ApoB-Expression, CD9, ApoA1 und Ago2 waren jedoch nicht nachweisbar. Um den relativen Beitrag von cf-mRNA aus EVs und Lipoproteinen weiter zu untersuchen, führten wir eine quantitative Analyse der Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) an cf-mRNA nach Immunpräzipitation mit dem kanonischen EV-Marker CD9 und dem Lipoprotein-Marker ApoB aus EV-assoziierten Fraktionen durch (FR14 und FR58). Wir haben 4 Gene ausgewählt, die unterschiedliche cfRNA-Ursprünge umfassen, wie z. B. das gewebespezifische Gen (ALB), Housekeeping-Gene (B2M), eine Back-Splicing-Verbindung (CORO1C) und das ribosomale Protein-Gen (RSP6). Die qRT-PCR-Analyse ergab, dass die Mehrzahl der getesteten Gene im Vergleich zur IgG-Kontrolle signifikant an CD9-Immunpräzipitaten angereichert war (Abb. 4b). Es wurde jedoch keine signifikante Anreicherung der getesteten RNAs in ApoB-Immunpräzipitaten im Vergleich zur IgG-Kontrolle festgestellt (Abb. 4b). Insgesamt bestätigten diese Daten weiter, dass der Hauptbeitrag der cf-mRNA in FR14 und FR58 von Elektrofahrzeugen getragen wird.

a Expression von Proteinmarkern (CD9, ApoA1, Ago2 und ApoB) mittels Immunpräzipitation über Plasmafraktionen hinweg. Die Leiter wurde aus Vollgel abgeschnitten, um die Größenangabe zu zeigen. b RT-qPCR-Analyse ausgewählter Gene unter Verwendung von Überständen, die aus CD9-, ApoB- oder IgG-Immunocaptures von FR14 und FR58 eluiert wurden. Der P-Wert wird aus dem Tukey-Test (ns = nicht signifikant, P > 0,05; *P < 0,05, **P < 0,01 und ****P < 0,0001) mit drei gepoolten technischen Replikaten von FR14 und FR58 von Plasma abgeleitet von drei gesunden Personen. c Ein Boxplot des negativen Rohzyklusschwellenwerts (- Roh-CT) einzelner Gene mit RNase- und/oder Detergensbehandlung mittels qRT-PCR. RNA, die aus kombiniertem FR14 und FR58 unter Verwendung von drei gesunden Personen und drei technischen Replikaten der Kontroll-RNA isoliert wurde, wurde mit RNase und/oder Detergens behandelt. Die Daten werden mit RStudio analysiert und als Mittelwert ± SD von drei unabhängigen Proben angegeben.

Um weiter zu testen, ob cf-mRNA in EVs vor endogener RNase im menschlichen Plasma geschützt ist, haben wir gepoolte FR14- und FR58-Fraktionen einer RNase- und Detergensbehandlung unterzogen, gefolgt von einer Reinigung der RNA und einer Quantifizierung durch qRT-PCR (Abb. 4c). Wir verwendeten aus Gewebe isolierte (ungeschützte) RNA als Kontrolle und kombinierten FR14 und FR58 mit Puffer allein, Detergens Triton . Der vollständige Verdau von cf-mRNA aus großen und mittleren Partikelfraktionen erfolgte erst nach der Behandlung sowohl mit RNase A als auch mit Detergens, was damit übereinstimmt, dass cf-mRNA in Vesikeln eingeschlossen war (Abb. 4c). Im Gegensatz dazu blieb die relative Genexpression für RNase A allein dieselbe wie für Detergens allein. Kontroll-RNA, der jegliche schützende Lipiddoppelschicht fehlt, wurde durch RNase A allein und RNase A mit Detergens vollständig verdaut (Abb. 4c). Diese Beobachtung stützt die Behauptung, dass cf-mRNA hauptsächlich in Elektrofahrzeugen eingekapselt ist. Zusammenfassend deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass cf-mRNAs überwiegend im Plasma mittlerer und kleiner EVs vorhanden und geschützt sind. Unter Berücksichtigung dieser Punkte insgesamt: 1) Die maximalen ApoB-Peaks waren in FR912 und FR1619 zu finden, während der Großteil der cf-mRNA in FR14 und FR58 gefunden wurde, 2) signifikante cf-mRNA wurde aus immungefangenen CD9-EVs, aber nicht aus immungefangenen ApoB-Lipoproteinen nachgewiesen, und 3) Der RNase-Schutz innerhalb der Lipiddoppelschichten, der die Möglichkeit einer Anwesenheit von cf-mRNA auf der Oberfläche ausschließt, lässt uns schlussfolgern, dass EVs der Hauptträger von cf-mRNA im Plasma sind. Daher bezeichnen wir FR14 und FR58 im Folgenden als mittlere Elektrofahrzeuge bzw. kleine Elektrofahrzeuge.

Als nächstes untersuchten wir, ob sich der mRNA-Gehalt in EV-Subpopulationen zwischen Plasma von Krebspatienten und gesunden Kontrollpersonen unterscheidet. Um mit Krebs assoziierte RNA-Verpackungen zu identifizieren, identifizierten wir unterschiedlich exprimierte (DE) Gene (padj < 0,05 & log2FC > 1) zwischen jedem Krebstyp und gesunden Kontrollpersonen innerhalb einer bestimmten Fraktion (Abb. 5a). Wir verwendeten Permutationstests, um die statistische Signifikanz der DE-Analyse zu bewerten (ergänzende Abbildung 9). Um die Anreicherungsmuster zu analysieren, haben wir die fache Veränderung dieser zwischen den einzelnen Krebsarten identifizierten DE-Gene im Vergleich zu den Kontrollen innerhalb jeder Fraktion berechnet und in einer Heatmap visualisiert (Abb. 5a). Wir fanden heraus, dass das fraktionierte Plasma von Lungenkrebspatienten im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen signifikant hochregulierte mRNAs aufwies, insbesondere 136, 199, 462, 151, 105 und 7 innerhalb mittlerer EVs, kleiner EVs, Nicht-EV-Partikel, früher und mittlerer - bzw. spät eluierende Proteinfraktionen (ergänzende Abbildung 10a). Interessanterweise zeigte die Heatmap-Visualisierung von Faltenveränderungen bei Krebspatienten im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen deutliche Anreicherungsmuster von Lungenkrebs-differenzierender cf-mRNA, die spezifisch für EV- und Protein-Subpopulationen sind (Abb. 5b). Die Mehrzahl der DE-Gene ist an spezifischen EV- und Proteinfraktionen angereichert, wobei nur sehr wenige DE-mRNA zwischen den Fraktionen geteilt werden (ergänzende Abbildung 10). Um die mögliche Rolle dieser selektiv angereicherten krebsunterscheidenden Gensätze in jeder Plasmafraktion zu bewerten, führten wir eine Signalweganreicherungsanalyse mit g:Profiler durch, der auf Genontologie- und Reactome-Datenbanken, Cytoscape und EnrichmentMap basiert (Abb. 5a). Mit FR14 (mittlere EVs) angereicherte Differenzierungsgene von Lungenkrebs waren sowohl mit dem Immunsystem als auch mit dem Stoffwechselprozess verbunden (Abb. 5c), während mit FR912 (Nicht-EV-Partikelfraktion) angereicherte DE-Gene am Immunsystem beteiligt waren und durch myeloische Leukozyten vermittelt wurden Antwort (Abb. 5c). Mit FR1619 (früh eluierendes Protein) angereicherte Differenzierungsgene aus Lungenkrebs waren im Proteinlokalisierungskern, im Steroidhormon Kortikosteroid und im Verteidigungsvirus-Symbionten angereichert, während mit FR3033 (spät eluierendes Protein) angereicherte DE-Gene im Sphingolipid-Metabolismus angereichert waren (Abb. 5c).

ein Schema des Arbeitsablaufs für die selektive Verpackung (Heatmap) und Signalweganreicherungsanalyse für Lungenkrebs, der cf-mRNA differenziert. Die normalisierte Anzahl wurde gefiltert, um differenziell exprimierte (DE) Gene zwischen einzelnen gesunden und Krebsfraktionen zu identifizieren (padj < 0,05 & log2FC > 1). Nachdem DE-Gene identifiziert wurden, wurde die log2-fache Änderung (log2FC) berechnet, indem die log2-Anzahl der Krebserkrankungen aus einzelnen biologischen Replikaten vom Mittelwert der entsprechenden gesunden Fraktionen abgezogen wurde. Die Genlisten wurden nach Fraktionen geordnet. DE-Gene wurden für die selektive Verpackungs-Heatmap-Analyse identifiziert. Unter Verwendung der aus jeder Fraktion identifizierten DE-Gene wurde g:Profiler auf die biologischen Eigenschaften der Genontologie und das Reaktom zur Analyse der funktionellen Anreicherung angewendet. Die Pathway-Anreicherungsanalyse wurde mit Cytoscape und EnrichmentMap durchgeführt. b Heatmap der Genexpression bei Lungenkrebs im Vergleich zu Gesunden über Fraktionen hinweg. c Anreicherungskarte für Lungenkrebs-DE-Gene, die in einzelnen Fraktionen mithilfe von Gene Ontology (Biologische Eigenschaften) und Reactome gefunden wurden, wobei FR14, FR912, FR1619 und FR3033 durch Rot, Grün, Lila bzw. Gelb farbcodiert sind. Der Cluster repräsentiert (i) Steroidhormon Kortikosteroid, (ii) zelluläre Reaktionschemikalie, (iii) Verteidigungsvirus-Symbionten, (iv) regulatorische myeloische Zelle, (v) negative Regulationsreaktion, (vi) Toll-Cell-Rezeptor 4, (vii) g1-spezifisch Transkription und (viii) Hemidesmosom-Assemblierung. Knotencluster wurden automatisch mit AutoAnnotate von Cytoscape beschriftet.

Wir haben ähnliche selektive Verpackungs- und Signalweganreicherungsanalysen an Plasma von Patienten mit multiplem Myelom und Leberkrebs durchgeführt. Beim multiplen Myelom identifizierten wir 37, 60, 102, 121 und 65 DE-Gene in mittleren EVs, kleinen EVs, Nicht-EV-Partikeln sowie früh und mittel eluierenden Proteinfraktionen (ergänzende Abbildung 10b). Wir fanden keine differenzierende mRNA in spät eluierenden Proteinfraktionen. Multiple Myelom-differenzierende cf-mRNA zeigte charakteristische Anreicherungsmuster, die für EV- und Protein-Subpopulationen spezifisch sind (ergänzende Abbildung 11a). DE-Gene, die in mittleren EVs (FR14) gefunden wurden, standen im Zusammenhang mit der Entgiftung toxischer Substanzen (ergänzende Abbildung 11b). FR2326-differenzierende Gene beim multiplen Myelom werden für die Proteinregulation, die Chemotaxis von Neutrophilen und die humorale Immunantwort angereichert (ergänzende Abbildung 11b). Bei Leberkrebs entdeckten wir 12, 109 und 38 DE-Gene in den Fraktionen FR14, FR58 und FR912 (ergänzende Abbildung 10c). Wir fanden keine differenzierende mRNA in Proteinfraktionen. In ähnlicher Weise ergab unsere Heatmap-Analyse charakteristische Anreicherungsmuster von Leberkrebs, die cf-mRNA spezifisch für mittlere EVs, kleine EVs und Nicht-EV-Partikel unterscheiden (ergänzende Abbildung 12a). Leberkrebs-unterscheidende Gene, die in mittleren EVs (FR14) gefunden wurden, standen im Zusammenhang mit der Regulierung der Wundkoagulation und negativen Regulationszellen, während DE-mRNA, die für kleine EVs selektiv ist (FR58), mit der Regulierung der Wundkoagulation, dem Remodelling-Proteinkomplex und Triglycerid-Stoffwechselprozessen in Zusammenhang stand. und Plasma-Lipoproteinpartikel (ergänzende Abbildung 12b). Zusammengenommen identifizierten unsere Ergebnisse ein selektives Anreicherungsmuster differenzierender Gene, die mit verschiedenen Krebsarten in EV-Subpopulationen und Proteinfraktionen assoziiert sind.

Nachdem wir festgestellt hatten, dass sich die mRNA-Gehalte in EV-Subpopulationen zwischen Plasma von Krebspatienten und gesunden Kontrollpersonen unterscheiden, wollten wir als Nächstes feststellen, ob die mRNA-Gehalte in EV- und proteinangereicherten Fraktionen zwischen verschiedenen Krebsarten unterscheiden können. Wir analysierten die sechs Plasmafraktionen (mittlere EVs, kleine EVs, Nicht-EV-Partikel, früh, mittel und spät eluierende Proteinfraktionen) von Lungenkrebs, multiplem Myelom und Leberkrebs im Vergleich zu diesen Fraktionen bei gesunden Kontrollpersonen. Um die mit mehreren Krebsarten assoziierte RNA-Verpackung zu identifizieren, haben wir alle differentiell exprimierten (DE) Gene (padj < 0,05 & log2FC > 1) pro Krebstyp im Vergleich zu gesunden Kontrollen innerhalb jeder Fraktion kombiniert. Interessanterweise zeigte unsere Heatmap-Visualisierung der Anreicherungsmuster deutliche multiple Krebsarten, die cf-mRNA spezifisch für EV- und Proteinfraktionen differenzieren (Abb. 6a). Obwohl es einen leichten Anstieg der cf-mRNA-Expression zwischen kleinen EV-assoziierten Lungenkrebs-DE-Genen mit multiplem Myelom und Leberkrebs gibt, wurden die meisten dieser Gene bei multiplem Myelom und Leberkrebs nicht unterschiedlich exprimiert. Darüber hinaus führten wir funktionelle Anreicherungsanalysen dieser kombinierten Gensätze durch und stellten fest, dass die Mehrzahl der mit der biologischen Funktion zusammenhängenden Begriffe für jeden Krebstyp und jede Krebsfraktion einzigartig waren, mit minimaler Überlappung der humoralen antimikrobiellen Reaktion sowohl von FR14 bei Lungenkrebs als auch von FR2326 bei multiplem Myelom (Abb . 6b). Diese allgemeinen selektiven Anreicherungsmuster, die mit mehreren Krebsarten innerhalb von EV-Subpopulationen und Proteinfraktionen verbunden sind, legen nahe, dass unterschiedliche cf-mRNA bei Krebs in verschiedene Arten von extrazellulären Trägern verpackt sind.

eine Heatmap der Genexpression bei mehreren Krebsarten (Lungenkrebs, multiples Myelom und Leberkrebs) im Vergleich zu gesunden Menschen in verschiedenen Fraktionen. Die Anmerkungszeile gibt den Anteil der DE-Gene an, die für bestimmte Krebsarten im Vergleich zu den gesunden Kontrollen identifiziert wurden. Repräsentative Bilder wurden mit der Illustrationssoftware BioRender und PowerPoint erstellt. b Anreicherungskarte für mehrere Krebs-DE-Gene, die in einzelnen Fraktionen mithilfe der Genontologie (biologische Eigenschaften) und des Reaktoms gefunden wurden, wobei Lungenkrebs, multiples Myelom und Leberkrebs jeweils durch die Farben Grün, Lila und Gelb gekennzeichnet sind. Der Cluster repräsentiert (i) Steroidhormon Kortikosteroid, (ii) zelluläre Reaktionschemikalie, (iii) Sphingolipid-Metabolismus Glykosphingolipid, (iv) Lokalisierung des Nucleus nucleolus, (v) Temperaturhomöostase, (vi) regulatorische myeloische Zelle, (vii) Alpha-Beta-Zelle, (viii) Toll-Cell-Rezeptor 4, (ix) Hemidesmosom-Assemblierung, (x) negative Regulationsreaktion und (xi) g1-spezifische Transkription. Knotencluster wurden automatisch mit AutoAnnotate von Cytoscape beschriftet. Die Datensätze wurden nach dem Anteil der für bestimmte Krebsarten identifizierten DE-Gene im Vergleich zu den gesunden Kontrollen gefärbt, wie in Abb. 6a dargestellt.

Die Identifizierung von cf-mRNA-Frachttypen aus menschlichem Plasma und der Art und Weise, wie verschiedene Krebsarten sie fehlregulieren, ist angesichts neuer Studien zu ihren Rollen und Funktionen von entscheidender Bedeutung. In dieser Studie untersuchten wir die Assoziation von cf-mRNA mit potenziellen biologischen Trägern, indem wir Plasma in große Partikel, mittlere Partikel, kleine Partikel und proteinangereicherte Fraktionen fraktionierten. Nach unserem Kenntnisstand ist dies die erste Studie, die die Assoziation von Plasma-cf-mRNA mit EV- und Nicht-EV-Trägern in menschlichem Plasma bestimmt. Von den durch Sequenzierung nachgewiesenen und quantifizierten cf-mRNAs waren 99 % in großen und mittleren Partikelfraktionen vorhanden. Entscheidend ist, dass wir herausgefunden haben, dass cf-mRNA aus EV-assoziierten Fraktionen auch in Lipiddoppelschichten vor der RNase-Behandlung geschützt ist. Dieser Befund legt einen Mechanismus nahe, durch den cf-mRNAs in EVs von endogenen RNasen im menschlichen Plasma stabil bleiben können. Wichtig ist, dass wir nicht nur festgestellt haben, dass bestimmte cf-mRNAs bei Krebs im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen unterschiedlich exprimiert werden, sondern auch, dass sie funktionelle Sätze von Genen enthalten, die auf einzigartige Weise mit unterschiedlichen Ladungen angereichert sind.

Um die extrazelluläre RNA-Kommunikation beim Menschen zu verstehen, ist es wichtig zu ermitteln, inwieweit cf-mRNA mit vesikulären und nicht-vesikulären Komponenten assoziiert ist. Murillo et al. nutzten eine integrierte Computeranalyse, um die Hauptträger von cf-mRNA in verschiedenen Bioflüssigkeiten zu finden2. Sie untersuchten 23 gesunde Erkrankungen in 19 Studien und fanden heraus, dass cf-miRNA mit EVs, RNA-bindenden Proteinen oder als Teil von Lipoproteinpartikeln, hauptsächlich HDL2, assoziiert war. Eines der größten Hindernisse, auf die sie stießen, war die große ungeklärte Variabilität sowohl innerhalb als auch zwischen verschiedenen cfRNA-Profilierungsstudien. Frühere Studien haben gezeigt, dass Blutverarbeitung, EV-Isolierungsmethoden, RNA-Extraktionsmethoden, Vorbereitungen von Sequenzierungsbibliotheken und die spezifische Komplexität von Bioflüssigkeiten zu Abweichungen zwischen den Studien führen können1,3,35,36. Daher haben wir mithilfe einer einheitlichen RNA-Extraktions- und Sequenzierungsbibliotheksmethode ein Profil verschiedener cf-mRNA-Ladungen in denselben menschlichen Plasmaproben erstellt. Wir nutzten die Größenausschlusschromatographie (SEC), die im Vergleich zu anderen Methoden nachweislich weniger lösliche Proteine ​​zusammen mit EVs isolierte36. Durch den Einsatz von SEC und anschließendem Spike-In synthetischer RNA während der RNA-Extraktion konnten wir definierte RNA-Träger reproduzierbar isolieren und ihren cf-mRNA-Gehalt analysieren.

Während die Größenausschlusschromatographie eine bekannte Reproduzierbarkeit bietet und für die Reinigung von Elektrofahrzeugen für die Flüssigbiopsieforschung von großer Bedeutung ist, beobachteten wir überlappende Partikelgrößenverteilungen zwischen mittleren und kleinen mit Elektrofahrzeugen angereicherten Fraktionen sowie einen gewissen Grad an Lipoproteinverschleppung. Daher haben wir jede Fraktion zunächst mit der dominanten Partikelgröße bezeichnet, die durch direkte TEM-Quantifizierungen beobachtet wurde. Nachfolgende Western-Blot-Analysen ergaben jedoch unterschiedliche Verteilungen für: CD9+-EVs in FR14 und FR58, ApoB+-Lipoproteine ​​mit dem höchsten Peak bei FR912 und FR1619 sowie ApoA1 und Ago2, die beide in späteren Proteinfraktionen (FR1619, FR2326 und FR3033) gefunden wurden. Wir beobachteten auch, dass Nicht-EV-Partikel mit einer Größe von weniger als 50 nm in FR912 zwischen EVs und Proteinfraktionen eluiert wurden. Diese Fraktion wies keine nachweisbaren Mengen an kanonischen EV-Markern, Ago2 oder ApoA1 auf, zeigte jedoch eine hohe ApoB-Expression. James W. Clancy et al. definierten zusätzliche Nanopartikel, die kleiner als 50 nm sind, als potenzielle Exomere und Supermere37. Während gezeigt wurde, dass Exomere und Supermere Ago237,38 exprimieren, konnten wir Ago2 in FR912 nicht nachweisen. Obwohl die kleinsten Partikelgrößen und frühen Proteinfraktionen mit LDL übereinstimmen, würde eine detailliertere molekulare Charakterisierung dieser Partikel den Rahmen dieser Studie sprengen und weitere Untersuchungen erfordern. Eine alternative Fraktionierungsstrategie unter Verwendung der asymmetrischen Fluss-Feld-Fluss-Fraktionierung (AF4) hat einzigartige Fähigkeiten zur Trennung von EV-Subpopulationen aus der Zellkultur gezeigt39. Ob die AF4-Methode jedoch ähnliche repräsentative Fraktionen in komplexen Bioflüssigkeiten wie Plasma ermitteln würde, bleibt unbekannt. Gezieltere Studien zeigten, dass miRNAs in normalem menschlichem Plasma durch Ago2-Antikörper immunpräzipitiert werden könnten2,40, und doch liefern Methoden wie diese einen unvollständigen Überblick über andere Trägerbeiträge.

Eine frühere Studie zeigte das Vorhandensein einer Mikro-RNA pro 1–100 EVs und möglicherweise sogar noch weniger für mRNAs voller Länge41. Durch die Katalogisierung des gesamten cf-mRNA-Transkriptoms aus fraktionierten Plasmaproben haben wir die Beiträge jedes Trägers im Plasma erfasst. Ohne eine genaue Bestimmung der Reinigungs- und RNA-Extraktionseffizienz ist die genaue Verteilung der cf-mRNA-Kopien pro EV in dieser Studie jedoch nicht vollständig definiert. Darüber hinaus haben wir mögliche Unterschiede in Bezug auf Ernährung, Bewegung, zirkadiane Uhr, Geschlecht, Alter, Krankheitsstadium und Unterschiede zwischen Spendern nicht berücksichtigt. In unserer vorherigen Studie konnten wir jedoch keinen statistischen Unterschied in der Gesamtmenge an zellfreier RNA und dem Niveau des Housekeeping-Transkripts GAPDH für Plasma-cf-mRNA-Proben beobachten, die von derselben Person zu verschiedenen Tageszeiten oder zwischen Tagen gesammelt wurden42. In Anbetracht der Tatsache, dass der Verzehr von Mahlzeiten, ein wichtiger Faktor, der die zirkulierenden Lipoproteinspiegel verändert, die cf-mRNA-Spiegel im Laufe des Tages nicht wesentlich verändert, sollten mechanistischere Studien darüber, wie Lipoproteine ​​cfRNA transportieren können, weiter untersucht werden. Da sich die Lipoproteinmenge außerdem auf die Plasmapartikelkonzentration auswirkt, sollte auch ein Fasten vor der Blutverarbeitung in Betracht gezogen werden. Im Zusammenhang mit Krebs können uns mehr Patientenproben und eine sorgfältige Betrachtung verschiedener Trägerkategorien ermöglichen, die Stadiumsunterschiede der Krankheit besser zu verstehen und auch, wie sich verschiedene Krankheitstypen auf die Konzentrationen unterschiedlich großer EVs, Lipoproteine ​​und zugehöriger cfRNA auswirken können Ebenen. Weitere Studien werden von einer präziseren Größentrennung profitieren und gleichzeitig Reproduzierbarkeit, Genauigkeit und Praktikabilität bieten, um das Biomarkerpotenzial von cf-mRNA und sogar die Mechanismen hinter der Sortierung von cf-mRNA in EVs im Plasma besser zu untersuchen.

Hier haben wir gezeigt, dass der Großteil der cf-mRNA im Plasma (~ 99 %) mit großen und mittleren Partikelfraktionen assoziiert war. Während wir einen signifikanten Unterschied in der relativen logarithmischen Expression von mRNA zwischen mit Partikeln und löslichem Plasmaprotein angereicherten Fraktionen beobachteten, wurden Proben aus fraktionierten Plasmaproben bis zu einer einheitlichen Tiefe sequenziert. Wichtig ist, dass synthetische RNA-Spike-in-Kontrollen eine standardisierte Bewertung des relativen cf-mRNA-Gehalts über Fraktionen hinweg ermöglichten, der andernfalls durch einen herkömmlichen Ansatz zur Normalisierung der Bibliotheksgröße fälschlicherweise amplifiziert oder zurückgegangen wäre43,44. Eine ähnliche Studie mit Größenfraktionierung, die sich jedoch auf miRNA konzentrierte, von Arroyo et al. fanden heraus, dass Argonaut2 mit miR-16, miR-92 und miR-122 in proteinangereicherten Fraktionen koeluiert wurde12. Insbesondere fanden sie heraus, dass einige miRNAs, die von Zelltypen stammen könnten, von denen bekannt ist, dass sie Vesikel erzeugen, wie let-7a, bevorzugt in EVs nachgewiesen wurden12. Trotz allgemeiner Ähnlichkeiten bei den Methoden zur Charakterisierung von cf-miRNA- oder cf-mRNA-Trägern können unterschiedliche RNA-Biotypen mit unterschiedlichen Trägern im Plasma assoziiert sein.

Ein Schlüsselaspekt unserer Studie war die Eingrenzung des potenziellen Trägers der beobachteten, mit großen und mittleren Partikeln angereicherten cf-mRNA. Die Analyse der RNase-Behandlung mit und ohne Membranzerstörung durch Detergens deutete darauf hin, dass der Großteil der cf-mRNA im Plasma vor dem Abbau innerhalb von Elektrofahrzeugen geschützt ist. Unsere Ergebnisse stimmen mit Enderle et al. überein, die herausfanden, dass die relative Quantifizierung der säulengebundenen cf-mRNA nach der kombinierten Behandlung mit RNase und Detergenz abnahm45. Der Einschluss einer nicht membrangebundenen Form von cf-mRNA in unserer Studie war eine wichtige Kontrolle, da sie mit RNase sowohl mit als auch ohne Detergensbehandlung leicht reduziert werden konnte. Diese Ergebnisse belegen, dass die meisten cf-mRNAs innerhalb von Lipiddoppelschichten vor RNase-reichen Umgebungen wie Plasma geschützt sind. Darüber hinaus untersuchten wir die Häufigkeit von Lipoproteinen (ApoA1 und ApoB) und RNA-bindenden Proteinen (Ago2) mittels Immunpräzipitation. Während ApoA1 und Ago2 getrennt in der proteinangereicherten Fraktion eluiert wurden, wurde ApoB teilweise in den EV-assoziierten Fraktionen kofraktioniert. Durch die Durchführung einer Immunpräzipitation gefolgt von einer qRT-PCR konnten wir außerdem nachweisen, dass cf-mRNA im Vergleich zu Kontroll-IgG signifikant an CD9-Immunpräzipitaten angereichert ist, während im Vergleich zu Kontroll-IgG keine signifikant an ApoB-Immunpräzipitaten angereichert war. Das Verständnis der Mechanismen spezifischer Unterschiede in der Genverpackung und ihres Zusammenhangs mit Krebs, um sie als flüssige Biomarker zu nutzen, bleibt Gegenstand unserer zukünftigen Studien.

Wir beobachteten, dass der cf-mRNA-Gehalt zwischen verschiedenen Krebsarten und gesunden Kontrollpersonen zwischen verschiedenen RNA-Trägern verändert war. Frühere Berichte haben gezeigt, dass die funktionelle Abgabe von cfRNA durch EVs die Tumorentstehung, Invasion und Zellproliferation fördern kann46,47. Insbesondere der cf-mRNA-Gehalt von EVs zeigte einen bemerkenswerten Unterschied in klinischen menschlichen Proben. Ramshani et al. entwickelten einen oberflächenakustischen (SAW) EV-lysierenden Mikrofluidikchip und stellten fest, dass die Konzentration von miR-12 bei Leberkrebspatienten fast 13-fach höher war30. Interessanterweise wurde gezeigt, dass das Vorhandensein von Mutationen auf Onkogenen wie KRAS die Ago2-Wechselwirkungen mit Endosomen unterdrückt, was zu einem unterschiedlichen miRNA-Einbau in EVs28 führt. In unserer Studie haben wir unterschiedliche Anreicherungsmuster sowohl in mit Partikeln als auch mit Proteinen angereicherten Fraktionen entdeckt, die mit Krebs aus menschlichem Plasma in Zusammenhang stehen. Interessanterweise enthielt die funktionelle Charakterisierung dieser unterschiedlichen unterschiedlichen Gensätze über bestimmte Plasmafraktionen hinweg sowohl gemeinsame als auch einzigartige biologische Wege. Insbesondere wurden Lungenkrebs-unterscheidende Gene, die in mittleren EVs, Nicht-EV-Partikeln und früh eluierenden Proteinfraktionen identifiziert wurden, mit Immunantwortmolekülen in Verbindung gebracht. Leberkrebs-unterscheidende Gene in kleinen EVs waren mit Plasma-Lipoproteinpartikeln assoziiert, die mit der Leberfunktion zusammenhängen48. Darüber hinaus waren multiple Myelom-unterscheidende Gene in mittleren EVs mit der Entgiftung toxischer Substanzen verbunden, was möglicherweise mit der Fehlregulation der Erythropoese beim multiplen Myelom zusammenhängt49. Angesichts der Fähigkeit, einzigartige cf-mRNA in verschiedenen Trägern nachzuweisen, sind zukünftige mechanistische Studien erforderlich, um zu untersuchen, wie sich spezifische onkogene Treiber auf die selektive cf-mRNA-Verpackung aufgrund von Krebs auswirken könnten. Darüber hinaus sind weitere Studien erforderlich, um die Mechanismen zu untersuchen, die die Sortierung von cf-mRNA in Plasma-EVs und andere Träger, ihre Zelltypen und Ursprungsgewebe steuern und um zu untersuchen, ob in EV-Subpopulationen im Blut sortierte cf-mRNA Signalfunktionen hat.

Blutproben von Kontrollpersonen und Patienten mit multiplem Myelom, Leberkrebs und Lungenkrebs wurden von der Oregon Health and Science University (OHSU) durch die Knight Cancer Institute Biolibrary und das Oregon Clinical and Translational Research Institute (OCTRI) entnommen. Alle Proben wurden gemäß den vom OHSU Institutional Review Board (IRB) genehmigten Protokollen gesammelt. Alle Spender gaben eine schriftliche Einverständniserklärung für Forschungszwecke ab und alle relevanten ethischen Vorschriften wurden befolgt. Kontrollspender waren Personen ohne bekannte Krebsvorgeschichte. Alle Proben wurden nach einem einheitlichen Protokoll von denselben Mitarbeitern der OHSU gesammelt und verarbeitet. Die zu analysierenden Proben wurden hinsichtlich Alter und Geschlecht der Teilnehmer zwischen Krebs- und Kontrollgruppen abgeglichen. Wir haben zuvor umfassend die präanalytische Variation von cf-mRNA in Abhängigkeit von Blutentnahmeröhrchen und Verarbeitungsprotokoll getestet35. Basierend auf diesem Ergebnis haben wir die folgende Blutverarbeitungsmethode entwickelt, um die Variabilität bei der Ex-vivo-Erzeugung von EV-Subpopulationen und cf-mRNA-Transkripten im Zusammenhang mit der Thrombozytenaktivierung zu begrenzen. Vollblut wurde aus allen klinischen Proben in 10-ml-K2EDTA-Röhrchen (BD Vacutainer, Becton Dickinson, 36643) gesammelt. Die Röhrchen wurden vor der Verarbeitung vertikal bei Raumtemperatur transportiert. Innerhalb einer Stunde nach der Blutentnahme wurde Plasma durch Differentialzentrifugation (Eppendorf 5810-R-Zentrifuge, S-4-104 Rotor, Eppendorf) hergestellt. Zunächst wurden 10 ml Vollblut 10 Minuten lang bei 4 °C und 1000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde 10 mm über dem Leukozytenfilm gesammelt. Eine zweite Zentrifugation wurde 10 Minuten lang bei 15.000 x g und 4 °C durchgeführt. Aliquots des plättchenarmen Plasmas wurden in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen (VWR, 89126-714) überführt und sofort bei –80 °C gelagert.

Die Größenausschlusschromatographie wurde unter Verwendung kommerziell erhältlicher qEV2 SEC-Säulen (Izon Science Ltd, Neuseeland, SP8-USD) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Kurz gesagt, die Säule wurde mit 0,1 μm gefiltertem D-PBS ohne Calcium und Magnesium (Gibco, 14190250) bei Raumtemperatur äquilibriert. Zwei ml Plasma wurden auf die Säule geladen und 14 ml Leervolumen wurden verworfen. Genau 4 ml D-PBS wurden mit einer 5-ml-Pipette in SEC-Säulen gegeben, um jede Plasmafraktion zu sammeln. Wir haben 6 Plasmafraktionen pro Probe von SEC-Säulen auf Eis in separaten 50-ml-Kanonischen Röhrchen (Corning, 14-432-22) gesammelt: große Partikel (FR14: eluiert von 0 bis 4 ml), mittlere Partikel (FR58: eluiert von 4 bis 8 ml), kleine Partikel (FR912: eluiert von 8 bis 12 ml), früh eluierende Proteinfraktionen (FR1619: eluiert von 15 bis 19 ml), die mittel eluierenden Proteinfraktionen (FR2326: eluiert von 22 bis 26 ml) und spät eluierende Proteinfraktionen (FR3033: eluiert von 29 bis 33 ml). Der Sammlung dieser sechs Plasmafraktionen folgte unmittelbar die RNA-Extraktion.

Die Konzentrationen von Partikeln in isolierten, mit Partikeln angereicherten Fraktionen, die aus SEC unter Verwendung von Plasma von drei gesunden Personen gewonnen wurden, wurden mithilfe einer abstimmbaren Widerstandsimpulsmessung von qNano (Izon, Cambridge, MA, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen. Aufgrund der begrenzten Verfügbarkeit und Menge an Blutproben für Krebspatienten haben wir die Untersuchung nur an Proben gesunder Personen durchgeführt. Zunächst wurde eine Nanopore (Izon, NP150) auf einer Flüssigkeitszelle platziert und auf 47,0 mm gedehnt, um die Dehnung zu kalibrieren. Nachdem wir der unteren und oberen Flüssigkeitszelle 4 Minuten lang Befeuchtungslösung mit einem Druck von 20 mbar zugesetzt hatten, stellten wir einen stabilen Basisstrom bei etwa 120 nA her. Die Benetzungslösung wurde durch eine Beschichtungslösung ersetzt und jeweils 10 Minuten lang maximaler Druck und Vakuum bei 20 mbar angelegt. Die Beschichtungslösung wurde dreimal mit Messelektrolyt aus den oberen und unteren Flüssigkeitsvertiefungen gespült und 10 Minuten lang maximaler Druck angelegt, um den Messelektrolyten auszugleichen. Nach dem Entfernen des Elektrolyten fügten wir 110-nm-Kalibrierungspartikel mit 1 × 1013 Partikeln pro ml hinzu (Izon, CPC100), um Dehnung, Spannung und Druck so zu optimieren, dass die relative Partikelgröße innerhalb von 0,25–0,5 % liegt und ihre Geschwindigkeit innerhalb von 10–15 / MS. Nachdem wir die Kalibrierungsperlen aufgezeichnet hatten, platzierten wir die von SEC gesammelten mit Partikeln angereicherten Fraktionen auf der Nanopore (Izon, NP150) und zeichneten sie mit den gleichen Systemeinstellungen wie die Kalibrierungsperlen auf. Die Partikelkonzentration jeder Plasmafraktion wurde durch Umrechnung der Blockadehäufigkeit jeder Plasmafraktion mithilfe der Izon Control Suite (v3.3.2.2001, Izon Science) bestimmt. Die Plasmaproteinabsorption wurde bei 280 nm mit dem Mikrovolumen-UV-Vis-Spektrophotometer NanoDrop™ One/OneC (Thermo Scientific, ND-ONE-W) gemessen.

Ein ultradünner Kohlenstofffilm auf einem Spitzenkohlenstoffträger mit 400 Mesh auf Kupfer (Ted Pella, 01824) wurde 30 s lang mit dem PELCO easiGlow-Glimmentlader (Ted Pella) glimmentladen. Isolierte, mit Partikeln angereicherte Fraktionen von gesunden Personen wurden 1 Minute lang auf geladene Gitter gelegt, 30 Sekunden lang mit MilliQ-Wasser gewaschen und 30 Sekunden lang mit 1 % Uranylacetat fixiert. Gitter mit gefärbten Proben wurden vor der Bildgebung mindestens 30 Minuten lang an der Luft getrocknet. Vorbereitete Proben wurden bei 120 kV mit dem FEI Tecnai™ Spirit TEM-System abgebildet. Das FEI-Tecnai™ Spirit TEM-System wurde mit einer unten montierten Eagle™ 2 K TEM CCD-Multiscan-Kamera und einer NanoSprint12S-B cMOS-Kamera der schnellen seitlich montierten TEM CCD-Kamera von Advanced Microscopy Techniques (AMT) verbunden. Die Bilder wurden mit 30.000-facher Vergrößerung und einer Defokussierung von 3 μm aufgenommen. Die Bilder wurden mit der Nanosprint 12 AMT-Schnittstelle und der Kamera als 16-Bit-Graustufendateien mit 4000 × 3000 Pixeln erfasst. Für die Analyse wurden TEM-Bilder mit mindestens 25 Partikeln aus jeder Plasmafraktion aufgenommen. Beobachtete Partikel pro Fraktion wurden für das Histogramm mit einer Breite von 5 nm zusammengefasst. Die Partikeldurchmesser wurden manuell mit dem Fiji-Line-Tool gemessen und für nachgelagerte Analysen nach Excel/R exportiert.

Zur Immunpräzipitation wurden 200 μl Magna Bind Ziegen-Anti-Maus-IgG-Magnetkügelchen-Aufschlämmung (Thermo Scientific, PI21354) mit PBS-Lösung gewaschen und mit 5 μg monoklonalem Maus-Anti-Ago2 (Abcam, ab57113) und Anti-CD9-Antikörper (Abcam) inkubiert , ab58989), Anti-Apolipoprotein A1 (Santa Cruz Biotechnology, sc-376818), ApoB-Antikörper von Santa Cruz (sc-13538) oder normale Maus-IgG-Antikörper (Santa Cruz Biotechnology, sc-2025) für 2 Stunden bei 4 °C. Um kleinere Volumina für Immunpräzipitationsverfahren zu berücksichtigen, wurden die 4 ml von 6 Fraktionen (FR14, FR58, FR912, FR1619, FR2326 und FR3033) der SEC-Säule durch Ultrazentrifugation bei 150.000 g x 6 Stunden konzentriert. Die resultierenden Pellets wurden jeweils in 200 μl IP-Lysepuffer (Thermofisher Scientific, 87787), ergänzt mit einem Stopp-Protease-Inhibitor-Cocktail (Thermofisher, 78430), lysiert. Insgesamt 200 μl IP-lysierte Proben wurden mit 200 μl PBS gemischt. Die vorinkubierten Perlen und der Antikörper wurden dann zu den 400 μl Probe gegeben und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Die Perlen wurden dreimal mit 1 % Nonidet P-40-Puffer (Sigma Aldrich, 11332473001) gewaschen und dann in 20 μl NuPage LDS/Reduktionsmittel-Gemisch eluiert und 10 Minuten bei 70 °C inkubiert, um die Probe zu eluieren. Von den Perlen eluierte Proben wurden für das Western-Blotting verwendet. Western Blots wurden mit Bolt 4–12 % Bis-Tris Plus-Gel (Life Technologies, NW04122) durchgeführt und auf eine PVDF-Membran (Thermofisher Scientific, LC2002) übertragen. Die Membran wurde mit 1X TBST mit 5 % Milch (Sigma Aldrich, M7409-5BTL) blockiert und über Nacht bei 4 °C mit primären Antikörpern inkubiert. Als primäre Antikörper wurden der Anti-Argonaut-2-Antikörper (Abcam, ab32381), der Anti-CD9 (Abcam, ab223052), der Anti-Apolipoprotein A1 (Abcam, ab64308) und der polyklonale Ziegen-Anti-ApoB100-Antikörper (R&D Systems, AF3260) verwendet. Nach dem Waschen mit 1X TBST wurde die Membran mit Meerrettichperoxidase-konjugierten Anti-Kaninchen-Sekundärantikörpern (Cell Signaling, 7074) bzw. Anti-Ziegen-Sekundärantikörpern (Promega, V8051) inkubiert und erneut gewaschen, um ungebundene Antikörper zu entfernen. Gebundene Antikörper wurden mit Supersignal West Pico Plus Chemiluminescent Substrate (Thermofisher, 34577) nachgewiesen.

EVs, die große Partikel (FR14: eluiert aus 0–4 ml) und mittlere Partikel (FR58: eluiert aus 4–8 ml) umfassten, wurden aus der SEC-Säule unter Verwendung von 2 ml Eingangsplasma isoliert. Der EV-Isolierungsschritt wurde wiederholt, um insgesamt 16 ml Fraktionen mit EVs zu sammeln, die gleichmäßig auf vier Proben aufgeteilt wurden. Als Kontrolle wurden 4 ml Lungengewebe-RNA (Takara Bio, 636524) in einer Endkonzentration von 500 pg/μL verwendet. Anschließend wurden 4 ml der isolierten EV- oder Kontroll-RNA-Probe mit 0,2 % Triton X-100 (Sigma Aldrich, T8787) und/oder 25 μg/ml RNase (Thermo Scientific, EN0531) gemischt. Nach 30-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur mit gelegentlichem Schwenken wurde RNA aus der EV- oder Kontroll-RNA-Probe extrahiert.

RNA wurde aus 4 ml fraktioniertem Plasma unter Verwendung eines Plasma/Serum-Zirkulations- und exosomalen RNA-Reinigungskits (Norgen Biotek, 42800) gemäß dem Protokoll des Herstellers mit den folgenden Modifikationen extrahiert. Nachdem fraktionierte Plasmaproben 10 Minuten lang bei 60 °C lysiert und in Schritt 2 des Verfahrens mit Ethanol gemischt wurden, wurden 10 μl einer 106-fach verdünnten ERCC-RNA-Spike-In-Kontrollmischung (Thermofisher, 4456740) zu jeder denaturierten Plasmafraktionsprobe gegeben (dh nach dem Kombinieren der Plasmafraktionsproben mit der Denaturierungslösung in Schritt 1) ​​auf Eis als externe RNA-Kontrolle zur Normalisierung. Diese mit ERCC-RNA versetzten Plasmafraktionsproben wurden 2 Minuten lang bei 1000 U/min zentrifugiert. Danach folgten wir dem Protokoll des Herstellers und eluierten RNA in 100 μl. Um Spuren kontaminierender DNA zu verdauen, behandelten wir die RNA mit 10X Baseline-ZERO DNase (Lucigen, DB0715K). Mit DNase I behandelte RNA-Proben wurden gereinigt und unter Verwendung von RNA Clean und Concentrator-5 (Zymo Research, R1014) gemäß den Protokollen des Herstellers weiter konzentriert. Die endgültig eluierte RNA wurde aliquotiert und sofort bei –80 ° C gelagert.

Aus 2 ml gesundem Einzelplasma extrahierte zellfreie RNA und 1 ng/µL universelle Kontroll-RNA aus menschlichem Normalgewebe (Qiagen, C51105) wurden mit dem Agilent 2100 Bioanalyzer mit dem RNA 6000 Pico Series Kit (Agilent, 5067-1513) analysiert. Für die cf-mRNA-Fragmentanalyse wurden PCR-Primer entwickelt, um Genfragmente unterschiedlicher Länge über das ALB-Gen zu amplifizieren. Ein Primerpaar wurde entwickelt, um ein langes 898-bp-Fragment des Gens zu amplifizieren, und drei Primerpaare wurden entworfen, um kurze Genfragmente am 5'-Ende, in der Mitte und am 3'-Ende des Gens zu amplifizieren. Die erwarteten Amplikongrößen für diese Primer betrugen 80 bp, 82 bp bzw. 76 bp. Primersequenzen sind wie folgt: lange vorwärts: AGAGTGAGGTTGCTCATCGG; lange Rückseite: GGCAAGTCAGCAGGCATCTC; kurzes 5'-Ende nach vorne: TCCCTTCTTTTTCTCTTTAGCTCG; kurzes 5'-Ende umgekehrt: CGATGAGCAACCTCACTCTTG; kurzer Mittelstürmer: GCTGAGGCAAAGGATGTCTTC; kurze mittlere Rückseite: GCAGCAGCACGACAGAGTAA; kurzes 3'-Ende nach vorne: GCAAGGCTGACGATAAGGAGA; kurzes 3'-Ende umgekehrt: CCTAAGGCAGCTTGACTTGCAG. Die reverse Transkription wurde für jedes Primerpaar separat unter Verwendung des Invitrogen SuperScript III One-Step RT-PCR-Kits (Invitrogen, 12574026) und einer Primer-Endkonzentration von 0,1 µM mit 18 Voramplifikationszyklen durchgeführt. Nach der umgekehrten Transkription wurden die Proben 1:10 in hochreinem Wasser verdünnt. 1 µL des 1:10 verdünnten RT-Voramplifikationsprodukts wurde als Input für die PCR verwendet, die mit 2X PCR-Mastermix (Thermo Scientific, K0171) und einer Primer-Endkonzentration von 0,1 µM durchgeführt wurde. Es wurden 30 Amplifikationszyklen durchgeführt, gefolgt von einem 10-minütigen letzten Verlängerungsschritt. Nach der PCR wurden die Produktlängen mittels Gelelektrophorese unter Verwendung eines 2 %igen Agarose-TBE-Gels bestimmt, das 1 Stunde lang bei 70 V betrieben wurde. Als Größenreferenz wurde eine DNA-Leiter mit niedrigem Molekulargewicht (NEB, N3233L) einbezogen.

Für die Immunpräzipitation mit anschließender qRT-PCR wurden Ultrazentrifugationspellets von FR14 und FR58 in 600 µL D-PBS resuspendiert. Die 600 µL wurden in 3 Teilmengen von 200 µL aufgeteilt, die mit Anti-CD9, Anti-ApoB oder Anti-IgG über Nacht unter Rotation bei 4 °C inkubiert wurden. Anschließend wurden die Perlen 15 Minuten lang in 30 µl 0,2 M Glycin, pH 2,5 (Thermo Scientific, AAJ61855AK) inkubiert und zur Elution magnetisiert. Eluierte Fraktionen wurden mit 5 µL Tris-HCl, pH 8,6, neutralisiert. Schließlich wurden 2 µL des eluierten Produkts als Ausgangsmaterial für die qRT-PCR verwendet. Wir haben 4 Primer für Gene ausgewählt, die eine Vielzahl von cf-mRNAs umfassen, wie z. B. gewebespezifische Gene (d. h. ALB), Housekeeping-Gene (B2M), eine Back-Splicing-Junction (CORO1C) und das Gen für ribosomale Proteine ​​(RSP6), die optimiert wurden -Haus. Die 2 µL des eluierten Produkts wurden mit dem Superscript III One-Step RT-PCR-System mit Platinum Taq DNA-Polymerase (Invitrogen, Kat. 11-732-020) gemischt, um cDNA gemäß dem Protokoll zu erzeugen. Die cDNA aus der Voramplifikation wurde 1:80 verdünnt und in 96-Well-Platten mit SsoFast EvaGreen-Supermix mit niedrigem ROX (BioRad, Kat. 1725211) und den oben genannten Primern bei 10 µM angesetzt. QuantStudio 7 Flex (Applied Biosystems) wurde verwendet, um den RT-qPCR-Assay gemäß den vom Hersteller empfohlenen Zyklusbedingungen mit 40 Amplifikationszyklen durchzuführen, wie in unserer vorherigen Studie optimiert35.

Wir haben für jede Plasmafraktion gestrandete RNA-Seq-Bibliotheken mit dem Clontech SMARTer Stranded Total RNA-seq Kit v2-pico input Säugetier (Takara Bio, 634414) gemäß den Anweisungen des Herstellers vorbereitet. Für die cDNA-Synthese verwendeten wir Option 2 (ohne Fragmentierung), ausgehend von stark degradierter RNA. Die Eingabe von 7 µL RNA-Proben wurde verwendet, um cDNA-Bibliotheken zu erstellen, die für die Sequenzierung der nächsten Generation geeignet sind. Zum Hinzufügen von Adaptern und Indizes verwendeten wir das einzigartige SMARTer RNA Dual Index Kit −96 U (Takara Bio, 634452). Jeder Probe wurde ein einzigartiger SMARTer RNA-Doppelindex für jeden 5'- und 3'-PCR-Primer hinzugefügt, um gepoolte Bibliotheken voneinander zu unterscheiden. Die amplifizierte RNA-seq-Bibliothek wurde durch Immobilisierung auf dem AMPure XP PCR-Reinigungssystem (Beckman Coulter, A63881) gereinigt. Die aus rRNA und mitochondrialer rRNA stammenden Bibliotheksfragmente wurden gemäß dem Protokoll des Herstellers mit ZapR v2 und R-Probes behandelt. Für die endgültige Amplifikation der RNA-seq-Bibliothek wurden 16 PCR-Zyklen durchgeführt und die letzten 20 µL wurden nach der Reinigung der amplifizierten RNA-seq-Bibliothek in Tris-Puffer eluiert. Die amplifizierte RNA-seq-Bibliothek wurde zur Sequenzierung bei –20 °C gelagert.

Alle durch SEC isolierten fraktionierten Plasmaproben wurden zur Reduzierung von Probenchargeneffekten randomisiert und zur RNA-Extraktion, Bibliotheksvorbereitung und Sequenzierung in Illumina-Durchflusszellen einheitlich verarbeitet. Alle 120 vorgefertigten RNA-seq-Bibliotheksproben wurden mit dem NovaSeq 6000-System (Novogene, Sacramento, CA) sequenziert. Die vorgefertigten RNA-seq-Bibliotheksproben wurden für die Paired-End-Read-Sequenzierung x 150 bp gleichmäßig auf drei NovaSeq S4-Spuren verteilt. Die Qualität der Lesevorgänge wurde mit FastQC (v0.11.8)50,51 und RSeQC (v3.0.0)52 überprüft. Die Lesevorgänge wurden mithilfe des STAR-Aligners (v2.5.3a)53 mit der Zwei-Pass-Modus-Flagge an der menschlichen Genomassemblierung (hg38, Ensemble-Annotation; v94) und den ERCC-RNA-Spike-in-Sequenzen ausgerichtet. Nach dem Zuschneiden und Ausrichten des Adapters mit STAR (Version 2.5.3) wurden aus jeder Beispielausrichtungsdatei mithilfe von Bedtools (Version 2.27.1) Bigwig-Coverage-Tracks generiert. Anschließend wurden Beispiel-Bigwig-Dateien mit dem ggcoverage R-Paket (Version 0.7.1) über den genomischen Bereich des Housekeeping-Gens ACTB sowie ALB visualisiert. Die Lesezahlen für jedes Gen wurden mit dem htseq-count-Tool (v0.11.2)54 im kreuzungsstrikten Modus berechnet. Für jede Probe haben wir mithilfe von RSeQC (v3.0.0)52 Exon-, Intron- und Protein-kodierende Fraktionen (CDS-Exons) berechnet.

Unter insgesamt 6 Fraktionen (große Partikel, mittlere Partikel, kleine Partikel, früh, mittel und spät eluierende Proteinfraktionen) mit 20 Proben (einschließlich Krebs und biologischen Kontrollreplikaten) haben wir die Gesamtzahl der zellfreien RNA beibehalten mehr als fünf Messwerte in mindestens einer Plasmafraktion aller Proben. Dies führte dazu, dass insgesamt 12.671 (von 58.768) zellfreien RNA-Merkmalen und 55 (von 92) ERCC-Spike-Ins diesen Schwellenwert überschritten. Die gesamten zellfreien RNA-Zählungen wurden dann mithilfe der menschlichen Genomassemblierung (hg38, Ensembl-Annotation; v94) nach proteinkodierendem Biotyp gefiltert, was zur Identifizierung von 11.609 exprimierten zellfreien mRNA-Transkripten führte. Die nicht normalisierten proteinkodierenden Transkripte wurden dann unter Verwendung der ERCC-RNA-Spike-in-Kontrolle als Größenfaktoren in DESeq2 (v1.22.2)55 normalisiert. Der relative Protokollausdruck wurde aus dem RUVseq-Paket (v1.16.1)44 erhalten. 2 von 120 Plasmafraktionen wurden ausgeschlossen, da es sich aufgrund der Clusterung von Genen nach Expressionsmuster um einen Ausreißer handelte. Die Differentialexpressionsanalyse zwischen Fall/Kontrolle fraktionierter Proben wurde unter Verwendung von DESeq2 mit angepasstem p-Wert (padj) < 0,05 und log2-facher Änderung (log2FC) > 1 analysiert. Um die Signifikanz der Differentialexpressionsergebnisse für jeden paarweisen Vergleich von Krebs zu testen Um die Anzahl der gesunden Kontrollen pro Fraktion zu ermitteln, führten wir einen Permutationstest durch, bei dem die Analyse der differentiellen Expression zwischen zwei Gruppen randomisierter Proben mithilfe des DESeq2-Pakets verglichen wurde. Für jedes Paar wurden 1000 zufällige Permutationen durchgeführt und die Anzahl der differenzierenden Gene mit padj < 0,05 zur Erstellung eines Histogramms dokumentiert und mit der Anzahl signifikanter Gene (padj < 0,05) für die Gruppe mit korrekter Kennzeichnung verglichen.

Die Pathway-Anreicherungsanalyse wurde gemäß Reimand et al. durchgeführt. 56. Wir haben generische Anreicherungskartendateien (GEM) für die Signalweganalyse mit gprofiler erstellt, der eine funktionale Profilierung der Genliste aus groß angelegten Experimenten durchführt (https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/)57. Eine eingegebene (nicht geordnete) Genliste wurde aus einer differentiellen Expressionsanalyse abgeleitet, die zwischen Fall/Kontrolle von fraktionierten Proben durchgeführt wurde, die durch DESeq2 analysiert wurden. Zusätzlich zur Genontologie (molekulare Funktion, zelluläre Komponente oder/und biologischer Prozess) beziehen wir Pfade aus dem Reactome ein. Zur Visualisierung und Netzwerkanreicherungsanalyse wurden GEM-Dateien in Cytoscape (v3.9.0) (http://www.cytoscape.org/) importiert und eine GMT-Datei von der g:Profiler-Website mit der Datenquelle angegeben. EnrichmentMap in Cytoscape (http://www.baderlab.org/Software/EnrichmentMap) wurde zum Aufbau des Netzwerks56 verwendet, wobei Knoten (Kreise) den Pfad definieren. Für die Anzahl der Knoten wurden die Gene nach dem FDR-q-Wert-Grenzwert von 0,01 gefiltert. Einzelne biologische Themen wurden mithilfe von AutoAnnotate in der Cytoscape-Anwendung definiert.

Die Daten werden als Mittelwerte ± Standardabweichung von mindestens drei unabhängigen Experimenten angegeben. Differenziell exprimierte Gene zwischen Fall/Kontrolle fraktionierter Proben wurden mithilfe eines angepassten p-Werts (padj) < 0,05 und einer log2-fachen Änderung (log2FC) > 1 aus DESeq2 (v1.22.2) identifiziert. Für die DegPattern-Analyse aus dem R-Paket DEGreport (v1.18.1) wurden insgesamt 11.577 differenziell exprimierte Gene verwendet, die durch einen Einweg-ANOVA-Test über Plasmafraktionen mit einer Falscherkennungsrate von weniger als 0,05 bestimmt wurden.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Sequenzierungsdaten (GSE205301) werden im Gene Expression Omnibus Repository58 hinterlegt. Alle in diesem Manuskript verwendeten numerischen Quelldaten sind im Zenodo-Repository öffentlich verfügbar: https://doi.org/10.5281/zenodo.821179459. Alle weiteren Daten sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

Interne Skripte, die in diesem Manuskript für Grafiken und Analysen verwendet werden, einschließlich Datenverarbeitung und nachgelagerter Analyse, sowie die zur Generierung von Zahlen verwendeten Skripte sind im Zenodo-Repository öffentlich verfügbar: https://doi.org/10.5281/zenodo.821179459.

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Kim, H., Rames, M., Roskams-Hieter, B. und Ngo, TTM pyunjis/EV-RNA: Freigabe für Communications Biology Publication., https://doi.org/10.5281/zenodo.8211794 (2023) .

Referenzen herunterladen

Die Forschung im Ngo-Labor wurde vom Cancer Early Detection Advanced Research (CEDAR) Centre am OHSU Knight Cancer Institute (Vollzeit 2020-1289), dem Cancer Research UK/OHSU Project Award (C63763/A27122 an TTMN), der Kuni Foundation und der Abteilung unterstützt of Defense (W81XWH2110853 an TTMN) und der Susan G. Komen Foundation (CCR21663959 an TTMN). Die Probenentnahme wurde teilweise durch das OCTRI CTSA-Stipendium (UL1TR000128) unterstützt. Die Autoren würdigen die Unterstützung des Multiscale-Mikroskopiekerns für die Infrastruktur der Transmissionselektronenmikroskopie und danken Claudia Lopez für die Unterstützung bei der Mikroskopie. Die Autoren danken Dr. Lorena Pantano und Theresa Lusardi für ihre hilfreichen Diskussionen. Die Autoren danken Conner Bailey für die Unterstützung bei RT-qPCR-Experimenten. Wir möchten dem CEDAR-Repository und der Biobibliothek für ihre Unterstützung bei der Probenentnahme und -verarbeitung danken. HK, MJR, FC, CWK, BRH, ES, JB, AD, JE, ED und TTMN sind Mitglieder des Cancer Early Detection Advanced Research (CEDAR) Center des OHSU Knight Cancer Institute und werden von diesem unterstützt. Teile der Abb. 2, 6 wurden mit BioRender.com erstellt.

Cancer Early Detection Advanced Research Center (CEDAR), Knight Cancer Institute, Oregon Health and Science University, Portland, Oregon, USA

Hyun Ji Kim, Matthew J. Rames, Florian Goncalves, C. Ward Kirschbaum, Breeshey Roskams-Hieter, Elias Spiliotopoulos, Josephine Briand, Aaron Doe, Joseph Estabrook, Josiah T. Wagner, Emek Demir und Thuy TM Ngo

Abteilung für Biomedizintechnik, Oregon Health and Science University, Portland, OR, USA

Hyun Ji Kim, Matthew J. Rames, Florian Goncalves und Thuy TM Ngo

Computational Biology Program, Oregon Health and Science University, Portland, OR, USA

Joseph Estabrook und Emek Demir

Labor für Molekulare Genomik, Providence Health and Services, Portland, OR, USA

Josiah T. Wagner

Abteilung für Molekulare und Medizinische Genetik, Oregon Health and Science University, Portland, OR, USA

Emek Demir & Thuy TM Ngo

Abteilung für Onkologische Wissenschaften, Knight Cancer Institute, Oregon Health and Science University, Portland, OR, USA

Gordon Mills & Thuy TM Ngo

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HK und TTMN haben das Projekt initiiert. HK und MJR führten Nasslaborexperimente durch, darunter Plasmafraktionierung und RNA-Extraktion. HK, MJR, FG und JB führten Immunpräzipitationen und Western Blot durch. HK, MJR, CWK und ES führten qRT-PCR und Analyse durch. HK und MJR führten TEM-Experimente und Visualisierung durch. HK führte die Vorbereitung der Sequenzierungsbibliothek und die Datenvisualisierung durch. HK und TTMN haben die experimentelle Methodik entworfen. HK, BRH, AD, JE, ED und TTMN haben die Sequenzierungsmethodik und -analyse entworfen. TTMN betreute das Projekt. HK und TTMN verfassten das ursprüngliche Manuskript, das von HK, TTMN, GM, MJR, JTW, BRH, JB, AD und JE überarbeitet wurde

Korrespondenz mit Thuy TM Ngo.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Jennifer Jones und Randy Schekman für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptherausgeber: Gracjan Michlewski und Manuel Breuer. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Kim, HJ, Rames, MJ, Goncalves, F. et al. Selektive Anreicherung plasmazellfreier Messenger-RNA in krebsassoziierten extrazellulären Vesikeln. Commun Biol 6, 885 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-05232-z

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Eingegangen: 05. Oktober 2022

Angenommen: 09. August 2023

Veröffentlicht: 29. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-05232-z

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